人类TAP2基因克隆及其核表达质粒的构建

抗原处理相关转运体(transporter associated withantigen processing,TAP)属于ABC(ATP-binding cas-sette)超家族成员,由TAP1(75 kD)和TAP2(71 kD)形成异二聚体,负责抗原肽从胞浆到内质网的转运,在MHCⅠ类分子的抗原处理及提呈过程中发挥重要作用。TAP结构和功能障碍将导致细胞表面MHC Ⅰ类分子表达缺陷,这成为肿瘤细胞、病毒感染细胞逃逸免疫监视的重要机制。Seliger等指出,与自身正常     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

正反义人Pin1基因克隆及真核表达载体的构建

Objective： To clone and construct eukaryotic expressing vectors of sense and antisense human Pin1 （hPinl） genes. Methods： Total RNA was extracted from MG-63 cells, then the hPinl cDNA was amplified by RT-PCR. The same time the sense and antisense hPinl genes were formed by binding BamH Ⅰ and Hind Ⅲ in cis and trans-directions. At the end they were cloned into the eukaryotic expressing vector pIRES2-EGFP in cis and trans directions using DNA recombinant technology. The recombinant vectors were further identified by digestion of BamHⅠ and Hind Ⅲ. Results： The results of sequencing showed that the orientation of the ligations and the reading frame were correct. After digested by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ, two fragments exhibiting 5.3 kb and 0.99 kb were formed in sense and antisense eukaryotic expressing vectors. Electrophoretic results were completely coincident with theoretical calculation. Conclusion： Human Pin1 sense and antisense genes were successfully cloned and eukaryotic expressing vectors were successfully constructed.     

肿瘤抑制基因DOC-2真核表达载体的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达鉴定

目的构建肿瘤抑制基因DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,将其转入人卵巢癌细胞系HO-8910中,对其基因表达进行相关检测,为进一步研究DOC-2的功能奠定基础。方法利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA基因片段,将其连接入真核表达载体pCDNA3.1,并通过酶切鉴定。用脂质体介导法将真核表达载体pCDNA3.1-p93转染HO-8910,通过G418筛选稳定表达克隆;用免疫组化法观察人DOC-2蛋白在HO-8910中的表达。结果构建了DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,并通过酶切鉴定。免疫细胞化学结果显示pIRES2-EGFP-p93成功转入HO-8910中。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-p93并在HO-8910中得到稳定表达,为研究DOC-2蛋白的功能奠定了基础。     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

TFPI-2基因克隆及其在胰腺癌细胞中的表达

目的克隆人TFPI-2基因全长cDNA,构建其真核表达载体,并将其转染到人胰腺癌细胞Panc-1中,检测其表达。方法用RT-PCR法从人胎盘组织中扩增人TFPI-2基因,并将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。将构建的重组载体转染到人胰腺癌细胞系Panc-1细胞,Westernblot检测TFPI-2在Pane-1细胞中的表达。结果RT-PCR成功的扩增出一条约708bp的片断,扩增片断与载体连接后,经限制性内切酶酶切电泳分析和DNA序列测定证实该基因已经成功构建到载体上,转染Panc-1细胞后,荧光显微镜观察到稳定转染细胞发出较强绿色荧光,Westernblot技术证明TFPI-2基因能在Panc-1细胞中稳定表达。结论成功构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,获得了稳定表达TFPI-2的Panc-1细胞,证实TFPI-2基因能够在人胰腺癌细胞系Panc-1中高效、稳定的表达,为进一步研究其胰腺癌迁移、浸润及转移中的作用打下基础。     

人癌胚抗原cDNA的克隆与真核表达质粒的构建

[目的] 将人癌胚抗原(CEA)cDNA克隆到真核表达载体pIRES中，构建真核表达质粒pIRES-CEA，以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达，并为下一步连接上热休克蛋白基因(HSP70)从而构建CEA-HSP融合核酸疫苗作准备。[方法] 从CEA阳性的大肠癌组织中提取总RNA，经RTPCR方法获取人癌胚抗原cDNA，用内切酶XhaⅠ和NotⅠ分别酶切质粒pIRES和CEA cDNA，通过T4连接酶将带有黏性末端的CEA-cDNA插入到DIRES质粒的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点上。[结果] 通过PCR扩增获得了CEA基因，并将CEA-cDNA正向克隆到载体pIRES中。[结论] 已经成功构建了真核表达质粒pIRES-CEA，并为下一步连接上热休克蛋白基因（HSP70）从而构建CEA-HSP融合核酸疫苗作准备。     

携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

目的 构建携带绿色荧光基因的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A,并转染至鼻咽癌CNE2细胞。方法 从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的ＥＢＶ潜伏膜蛋白2A（latent membrane protein 2A,LMP2A）序列,并定向克隆入pIRES2-Zs-Green1载体,双酶切及测序鉴定重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A;通过脂质体转染将重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞（实验组）,同时另设转染pIRES2-Zs-Green1载体的阴性对照组及未转染的空白对照组。利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达计算细胞转染效率,RT-PCR检测目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达。结果 双酶切及测序鉴定证实真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A构建成功,荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光,实验组细胞转染率约为75%;RT-PCR检测发现实验组细胞中有目的基因LMP2A表达,但阴性对照组和空白对照组均未检测到目的基因表达。结论 成功构建了pIRES2-Zs-Green1- LMP2A真核表达载体并转染鼻咽癌CNE2细胞,目的基因LMP2A可在转染的鼻咽癌CNE2细胞中稳定表达。     

人白细胞介素—2真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建高效表达人ＩＬ－２的真核表达质粒,为ＩＬ－２的肿瘤基因治疗提供重要的工具。方法 运用ＰＣＲ扩增出人ＩＬ－２基因,经Ｂａｍ ＨＩ及ＥｃｏＲＩ双酶切后,回收片段与Ｂａｍ ＨＩ及ＥｃｏＲＩ处理的表达功体ｐＣＤＮＡ３在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下连接,并用多种限制性内切酶对重组质粒进行酶切鉴定。     

pcDNA3.1-KISS-1真核表达载体的构建及其对EC1细胞转移的抑制作用

 目的 克隆人食管组织KISS-1基因及构建真核表达载体pcDNA3.1-KISS-1,并观察其在食管癌EC1细胞中的表达及对EC1细胞侵袭及运动能力的影响。 方法 从人正常食管组织中提取总RNA,设计特异性引物,通过逆转录聚合酶联链反应（RT-PCR）扩增KISS-1基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-KISS-1,酶切鉴定及测序分析后用Lipofectamine脂质体将其转染到食管癌细胞,Western blot法检测其蛋白在EC1细胞中的表达情况;应用细胞运动实验及重建基底膜侵袭实验分析KISS-1表达对EC1细胞运动和侵袭能力的影响。 结果 成功克隆了人KISS-1基因全长编码序列,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-KISS-1,脂质体转染后KISS-1基因在EC1细胞中成功表达;转基因组细胞的运动能力（174.6±14.24）和体外穿越重建基底膜的能力（90.44±12.83）明显低于转空质粒组（222.6±30.08,110.22±15.87）和对照组EC1细胞（234.40±14.72,124.78±18.14）（P均<0.05）。 结论 重组pcDNA3.1-KISS-1真核表达质粒构建成功,并且KISS-1对食管癌细胞的侵袭和运动能力具有抑制作用。     

人白细胞介素-2真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建高效表达人IL－2的真核表达质粒,为IL－2的肿瘤基因治疗提供重要的工具。方法运用PCR扩增出人IL－2基因,经BamHI及EcoRI双酶切后,回收片段与BamHI及EcoRI处理的表达载体pcDNA3在T4DNA连接酶的作用下连接,并用多种限制性内切酶对重组质位进行酶切鉴定。结果PCR扩增片段的长度约为480bp,重组质粒经酶切显示,构建的质粒中含480bp的IL－2插人片段,将此重组质粒命名为pcDNA3－IL－2。结论本研究结果为进一步研究表达IL－2质粒的肿瘤基因治疗及免疫调节作用打下了基础。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用.方法: 根据 GenBank数据库提供的 CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl 设计原则,设计选择双链小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA ) ,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定.结果: 经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达.结论: CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功.     

膜联蛋白A1基因合成及其真核表达载体的构建

目的 探讨人膜联蛋白A1（ANXA1）基因的合成并构建其克隆载体。方法 根据ANXA1基因序列设计一对寡聚核苷酸引物,通过PCR反应合成一段长度为870bp的ANXA1基因。真核表达载体pEGFP-N3经Kpn Ⅰ ＆ BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切处理后与合成的ANXA1基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞进行扩增,并提取质粒进行鉴定。结果 PCR扩增获得ANXA1基因,对PCR产物及重组质粒酶切后的凝胶电泳鉴定证实为与理论设计目的片段大小（870bp）相符的DNA基因片段,并成功地转入克隆载体pEGFP-N3中。测序分析显示合成的目的基因与GenBank中ANXA1基因序列同源性为99％,整个表达载体阅读框正确无误。结论 成功构建了ANXA1基因pEGFP-N3表达载体,为下一步高效表达ANXA1蛋白和进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用。方法：根据GenBank数据库提供的CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl设计原则,设计选择双链小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pGPU6／GFP／Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT—PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达。结论：CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功。     

人IL-2基因克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的克隆人白细胞介素2基因（hIL-2），构建其重组穿梭载体pAdBM5-GFP—hIL-2。方法：应用PHA体外刺激培养的Jurkat细胞以促进hIL-2基因表达．设计特异性引物，应用RT—PCR法扩增hIL-2基因。将测序正确的片段用PmeⅠ和BglⅡ双酶切定向插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，酶切鉴定。结果：RT—PCR方法，成功克隆了hIL-2基因，并构建出pAdBM5-GFP-hIL-2真核表达载体．克隆的hIL-2序列全长528bp，含462个碱基开放读框．结论；构建含人白细胞介素2基因片段的重组腺病毒表达载体（pAdBM5-GFP—hIL-2），为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础．