参麦注射液致RBL-2H3细胞脱颗粒的研究

目的 探讨参麦注射液(SMI)对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响及其原因。方法 以C48/80为工具药建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型, 检测不同浓度C48/80与RBL-2H3细胞作用不同时间后细胞β-己糖苷酶、类胰蛋白酶和组胺的释放率以及细胞活力, 在细胞活力大于80%情况下, 选择释放程度较高的指标和条件为优选考察指标和条件。将SMI和其溶剂(Tween-80)原液等比稀释成不同浓度后与RBL-2H3细胞共同培养, 通过中性红染色法观察细胞脱颗粒的形态学变化, 分别用显色法和间接荧光法检测细胞上清的β-己糖苷酶和组胺释放率, 采用细胞计数法(CCK-8)检测细胞的活力。结果 RBL-2H3细胞脱颗粒模型的最佳作用时间为30 min, 最佳指标为β-己糖苷酶和组胺释放率。与空白组相比, SMI质量浓度低于13.3 g生药/L(3倍临床浓度)时, 细胞中性红染色未见脱颗粒现象, 组胺和β-己糖苷酶释放率亦无差异;而在Tween-80质量浓度为1.00 g/L时, SMI 40 g生药/L(9倍临床浓度)组和溶剂1.00 g/L组细胞中性红染色均可见脱颗粒现象, 细胞上清组胺和β-己糖苷酶释放率亦明显增加。此外, CCK-8结果显示, 与空白组相比, 各浓度的SMI对细胞活力均无影响。结论 SMI低于3倍临床浓度无明显RBL-2H3细胞脱颗粒作用;而在9倍临床浓度能刺激细胞脱颗粒, 这种脱颗粒作用可能与所含溶剂(Tween-80)有关, 与其对RBL-2H3的细胞毒性作用无关。提示SMI在低于3倍临床浓度相对安全, 在9倍临床浓度时有致类过敏反应的风险。     

聚山梨酯-80致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的研究

目的:研究聚山梨酯-80对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒释放组胺的影响.方法:培养大鼠来源的RBL-2H3肥大细胞,取不同厂家来源的聚山梨酯-80与RBL-2H3细胞共培养60 min,用荧光分光光度法定量检测RBL-2H3细胞释放的组胺量,计算组胺释放率.结果:不同厂家来源的聚山梨酯-80与RBL-2H3细胞作用60 min后,细胞的组胺释放率与空白对照组相比均显著增加,在一定浓度范围内,组胺的释放随聚山梨酯-80浓度的增加而增加.结论:聚山梨酯-80可导致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,并存在着明显的量效关系,为研究聚山梨酯80致过敏反应机制提供了一定的依据.     

地塞米松抑制肥大细胞脱颗粒及其机制初探

目的：研究糖皮质激素对Ⅰ型超敏反应中的肥大细胞脱颗粒反应是否有直接作用。方法：利用流式细胞仪技术观察地塞米松对RBL-2H3细胞(大鼠嗜碱粒细胞)脱颗粒程度的影响，利用western blot分析：ERK1／ERK2信号的改变。结果：地塞米松预先作用于RBL-2H3细胞，使AnnexinV标记的细胞阳性率较致敏原活化组明显下降，MAPK活性明显降低。结论：地塞米松抑制肥大细胞脱颗粒反应，其机制与MAPK活性有关。     

基于实时细胞分析技术评价注射用益气复脉(冻干)类过敏反应

目的 建立中药注射剂体外类过敏反应评价方法,快速评价不同批次注射用益气复脉（冻干）类过敏反应表现。方法 体外培养嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3细胞,选择Compound 48/80为阳性药,采用实时细胞分析（real-time cell analysis,RTCA）系统检测药物干预后引起的细胞指数（CI）值变化,并利用甲苯胺蓝、鬼笔环肽染色观察细胞形态、骨架变化,以及检测组胺和β-已糖苷酶释放量验证RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。选择20个批次的注射用益气复脉（冻干,100 μg/mL）作用于RBL-2H3细胞,进行基于RTCA技术的类过敏反应评价。结果 阳性药Compound 48/80（20 μg/mL）能够使RBL-2H3细胞的CI值在加药后30 min内呈先快速上升后下降趋势;形态学研究发现,Compound 48/80使细胞形态和细胞骨架均发生明显改变,发生明显的脱颗粒现象;组胺和β-己糖苷酶释放实验进一步证实Compound 48/80导致炎症介质的释放,引起了明显的脱颗粒现象;提示RTCA系统可以用于快速敏感的评价RBL-2H3细胞脱颗粒。不同批次的注射用益气复脉（冻干）对RBL-2H3细胞CI值无明显影响,提示所选批次为合格批次,无类过敏反应现象的发生。结论 建立了一套基于RTCA系统的类过敏反应体外快速评价技术,可用于注射用益气复脉（冻干）等中药注射剂类过敏反应的体外快速评价。     

高效液相色谱法测定咽舒茶中绿原酸含量

目的:建立用高效液相色谱法测定咽舒茶中绿原酸含量的方法.方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为ODS-C18流动相:乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87),流速为1.0 mL·min-1,检测波长为327 nm.结果:绿原酸在0.004 336～0.06 504 g·L-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系,平均回收率为99.8%,RSD为0.8%.结论:高效液相色谱法可简便、快速、准确地测定咽舒茶中绿原酸的含量.     

聚山梨酯80刺激肥大细胞RBL-2H3脱颗粒作用的评价

目的：研究不同类别及厂家的聚山梨酯80直接刺激肥大细胞RBL-2H3脱颗粒的作用,为建立完善的注射用辅料引发类过敏反应的筛选评价体系提供依据。方法：以不同剂量的聚山梨酯80处理RBL-2H3细胞,测定β-氨基己糖苷酶释放量,并通过MTT法进一步研究有脱颗粒作用的受试物对RBL-2H3细胞的毒性作用。结果：8种聚山梨酯80样品具有不同程度的直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的作用,且呈浓度依赖性,其中上海试剂采购供应站提供的受试物作用极强,威尔制药口服级受试物作用较强,威尔制药A、威尔制药B、威尔制药注射级、威尔制药4个受试物作用相近,2个进口品种的作用略弱。在产生直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒作用的浓度下,上海试剂采购供应站的聚山梨酯80有明显的细胞毒性,并呈浓度依赖性。结论：聚山梨酯80能够直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒,其作用强度不同反映了产品的质量差异;上海试剂采购供应站提供的聚山梨酯80直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的作用可能由其细胞毒性引起。     

Alpha-4/beta-1 and alpha-L/beta-2 integrins mediate cytokine induced lung leukocyte-epithelial adhesion and injury

BACKGROUND AND PURPOSE: Injury to the alveolar epithelium is a critical feature of acute lung injury (ALI). Using a cytokine model of ALI we demonstrated previously that newly recruited mononuclear phagocytes (MNP) contributed to lung inflammation and injury. We hypothesized that cytokines delivered into the alveolar airspace would have multiple effects on the lung that may contribute to lung injury. EXPERIMENTAL APPROACH: Intratracheal cytokine insufflation and leukocyte adoptive transfer in vivo were combined with in vitro analyses of lung epithelial cell-MNP adhesion and injury. Lung inflammatory injury was assessed by histology, leukocyte infiltration, and release of LDH and RAGE. KEY RESULTS: Cytokine insufflation was associated with apparent MNP-epithelial adhesion, up-regulation of alveolar ICAM-1 and VCAM-1, and the release of LDH and RAGE into the bronchoalveolar lavage. Insufflation of small molecule integrin antagonists suppressed adhesion of MNP and modulated release of LDH and RAGE. Adoptive transfer of MNP purified from cytokine insufflated lungs into leukopenic rats demonstrated the requirement of MNP for release of LDH that was not induced by cytokine alone. Corroboration that disrupting the ICAM/LFA1 interaction or the VCAM/VLA4 interaction blocked MNP-epithelial cell interaction and injury was obtained in vitro using both blocking monoclonal antibodies and the small molecule integrin antagonists, BIO5192 and XVA143. CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS: MNP recruited following cytokine insufflation contributed to lung injury. Further, integrin antagonists reduced alveolar epithelial cell injury induced during lung inflammation. Intratracheal delivery of small molecule antagonsists of leukocyte-epithelial adhesion that prevent lung injury may have significant clinical utility.     

HPLC法测定中药山楂中有效成分绿原酸的含量

目的建立测定山楂中绿原酸含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法色谱柱为Sunfire C18柱(250 mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钠缓冲液(25∶75),流速为1.0 ml/min,柱温为28℃,检测器波长为327 nm。结果绿原酸的质量浓度在7.03～70.3μg/ml范围内与峰面积值线性关系良好(r2=0.999 6),精密度RSD为0.27%,平均加样回收率为96.92%,RSD为0.92%(n=6)。结论 HPLC法简便易行、结果可靠,可以快速、准确地测定山楂中绿原酸的含量。     

HPLC法测定清肺饮中绿原酸的含量

目的建立清肺饮的质量控制方法。用HPLC法测定清肺饮中绿原酸的含量。方法采用Sinochorom ODS C18柱,以乙腈-0．4％磷酸水溶液（13：87）为流动相;流速为1．0ml·min^-1;检测波长为327nm。结果绿原酸在27．76～138．8mg·L^-1。范围内线性关系良好,r=0．9999;平均加样回收率为98．75％,RSD为1．1％（n=5）。结论本法专属性强,准确度高,重现性好,可作为该产品质量控制的方法。     

RBL-2H3细胞不适合用于类过敏模型的建立

目的考察RBL-2H3细胞是否适用于建立类过敏反应模型。方法用荧光定量聚合酶链反应考察RBL-2H3细胞上Mas相关G蛋白偶联受体(Mas-related G protein cou-pled receptor,Mrgpr)B2的表达情况;用显微镜观察和MTS法考察Compound 48/80对RBL-2H3细胞活力的影响;测定不同浓度Compound 48/80刺激RBL-2H3细胞脱颗粒释放的β-己糖胺酶含量,对比RBL-2H3细胞、人肥大细胞系LAD2和大鼠腹腔肥大细胞(rat peritoneal mast cells,RPMCs)对Compound 48/80响应性的差异。结果RBL-2H3细胞可表达MrgprB2受体。Compound 48/80能剂量依赖性地诱导RBL-2H3细胞释放β-己糖胺酶,但在高剂量(≥20 mg·L^-1)时对RBL-2H3的细胞活力产生明显影响,此时释放的β-己糖胺酶应当是由于其细胞毒作用引起细胞破裂所致。同在无毒剂量(10 mg·L^-1)的Compound 48/80刺激下,LAD2和RPMCs的响应性良好,β-己糖胺酶释放量分别为空白对照的15.02倍和16.05倍,而RBL-2H3细胞仅为空白对照的2.35倍。结论RBL-2H3细胞对Compound 48/80的响应性差,表明其并不适用于建立类过敏反应模型。     

绿原酸对缺氧环境下干细胞来源软骨样细胞凋亡的影响

目的探讨缺氧环境下绿原酸对骨髓间充质细胞来源软骨样细胞(Chondrogenic MSCs)影响及机制。方法采用体外培养大鼠间充质干细胞,以含0.2 mg.L-1 BMP-2诱导液培养12 d使其成为软骨样细胞后进行实验。分为(A)正常对照组、(B)绿原酸组、(C)0.1%O2缺氧环境组、(D)绿原酸+0.1%O2缺氧环境组。检测各组Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡、细胞内活性氧水平;RT-PCR检测不同组软骨细胞Caspase-3和Bcl-2基因的表达。结果与正常对照组比较,0.1%O2缺氧环境12 h能明显造成干细胞来源软骨样细胞的凋亡(P<0.05),绿原酸可降低0.1%O2缺氧引起的软骨样细胞凋亡率(P<0.05),活性氧水平下降,Bcl-2表达增强,Caspase-3表达减弱。结论绿原酸可抑制0.1%O2缺氧引起的软骨样细胞凋亡,其作用机制可能与降低细胞内的活性氧水平,稳定细胞的氧化还原状态来保护线粒体膜电位,促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达及抑制Caspase-3的表达有关。     

HPLC法测定清痤颗粒中绿原酸的含量

目的建立用高效液相色谱法测定清痤颗粒中绿原酸含量的方法。方法采用HPLC法,依利特C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈:0.4%磷酸溶液13∶87为流动相,检测波长327 nm,柱温30℃,流速1.0 ml.min-1。结果绿原酸浓度范围在10.08～60.48 mg.L-1之间峰面积(Y)与浓度(X)线性关系良好。平均回收率95.08%,RSD=2.13%。结论该方法操作简单,分离效果好,可用于清痤颗粒制剂质量控制。     

绿原酸跨细胞转运机制研究

目的利用Caco-2和MDCK细胞单层模型研究绿原酸(chlorogenic acid,CGA)的跨细胞转运过程及其机制。方法①Caco-2和MDCK细胞单层模型建立:Caco-2、MDCK细胞分别按密度1×105、5×104个细胞/cm2接种到Milli-cell-CM culture plate inserts上培养,待细胞单层达到一定致密程度后进行透过实验。②透过实验:用M2e酶标仪测定CGA在不同方向、不同浓度下的跨细胞转运情况并计算累积透过量。结果在两种细胞模型上CGA均有不同程度的双向跨细胞转运(吸收和分泌),P-gp抑制剂维拉帕米能明显减少CGA的分泌。结论CGA跨细胞转运同时存在吸收和分泌的动力学过程。P-gp部分参与CGA的分泌机制。     

HPLC法测定小儿咳喘灵凝胶中绿原酸的含量

目的 采用HPLC法测定小儿咳喘灵凝胶中绿原酸的含量.方法 HPLC法,汉邦C18柱(4.6 mm×250 mm),流动相:乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87),检测波长:327 nm,流速:1.0 ml·min-1.结果 绿原酸在0.168～0.84 μg范围内有良好的线性关系,r=0.999 6(n=5),平均回收率为98.55%.结论 该方法分离度高,重现性好,简便,准确,可用于小儿咳喘灵凝胶的质量控制.     

高效液相色谱法测定抗感颗粒中绿原酸的含量

目的　建立抗感颗粒中绿原酸的HPLC测定方法。方法　采用ZORBAXSB C18柱 (4. 6mm×250mm, 5μm),甲醇 1%磷酸溶液 (25∶75)为流动相,检测波长为 327nm。结果　绿原酸在 7. 5 ~120. 0μg·mL-1的浓度内呈良好的线性关系 (r=0. 9999),平均回收率为: 100. 48% (RSD=1. 2% )。结论　该方法简便、快速、准确,适用于抗感颗粒的质量控制。     

β‐eudesmol suppresses allergic reactions via inhibiting mast cell degranulation

The regulatory effect of β‐eudesmol, which is an active constituent of Pyeongwee‐San (KMP6), is evaluated for allergic reactions induced by mast cell degranulation. Phorbol 12‐myristate 13‐acetate (PMA) plus calcium ionophore A23187‐stimulated human mast cell line, HMC‐1 cells, and compound 48/80‐stimulated rat peritoneal mast cells (RPMCs) are used as the in vitro models; mice models of systemic anaphylaxis, ear swelling, and IgE‐dependent passive cutaneous anaphylaxis (PCA) are used as the in vivo allergic models. The results demonstrate that β‐eudesmol suppressed the histamine and tryptase releases from the PMA plus calcium ionophore A23187‐stimulated HMC‐1 cells. β‐eudesmol inhibits the expression and activity of histidine decarboxylase in the activated HMC‐1 cells. In addition, β‐eudesmol inhibits the levels of histamine and tryptase released from the compound 48/80‐stimulated RPMCs. Furthermore, β‐eudesmol decreases the intracellular calcium level in the activated RPMCs. β‐eudesmol also decreases the compound 48/80‐induced mortality and ear swelling response. β‐eudesmol suppresses the serum levels of histamine, IgE, interleukin (IL)‐1β, IL‐4, IL‐5, IL‐6, IL‐13, and vascular endothelial growth factor (VEGF) under PCA mice as well as PCA reactions. Therefore, the results from this study indicate the potential of β‐eudesmol as an anti‐allergic drug with respect to its pharmacological properties against mast cell‐mediated allergic reactions.     

基于RBL-2H3细胞和ICR小鼠过敏与类过敏叠加模型评价注射用血塞通(冻干)过敏与类过敏反应

目的 建立过敏和类过敏叠加的RBL-2H3细胞和ICR小鼠动物模型,对注射用血塞通(冻干)(XST)的过敏与类过敏反应进行评价研究。方法 体外以RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶(β-Hex)和组胺释放率为评价指标,确定抗二硝基苯单克隆抗体(DNP-IgE)、DNP-牛血清白蛋白(BSA)的剂量及与C48/80(30 μg·mL^-1)作用的最佳时间,筛选过敏和类过敏叠加模型的阳性条件,随后考察XST (4、8、16 mg·mL^-1)对细胞活力及与DNP-IgE/BSA叠加后对细胞脱颗粒的影响。体内以ICR小鼠为实验对象,以(类)过敏反应症状分值及血浆中免疫球蛋白E (IgE)、组胺、5-羟色胺、血管内皮生长因子A (VEGF-A)、末端补体复合物(SC5b-9)含量为评价指标,筛选卵蛋白(OVA,2.5、5.0、10.0 mg·kg^-1)、C48/80(1、2、4 mg·kg^-1)过敏-类过敏模型阳性条件,最后对XST (60、120、240 mg·kg^-1)的致敏性及是否会产生过敏、类过敏反应进行评价。结果 体外细胞实验最终确定400 ng·mL^-1的DNP-IgE致敏后用50 ng·mL^-1的DNP-BSA激发的同时与C48/80共同作用30 min作为过敏与类过敏叠加阳性组;16 mg·mL^-1的XST与DNP-IgE/BSA联合叠加时,与单给DNP-IgE/BSA或XST组比较均促进组胺和β-Hex的释放(P<0.01)。体内小鼠实验中5、10 mg·kg^-1的OVA均会使小鼠体内IgE显著升高,依据过敏样反应分值和小鼠血浆内组胺、VEGF-A和SC5b-9含量最终确定5 mg·kg^-1 OVA与1 mg·kg^-1 C48/80建立叠加模型,耳、肺及支气管组织中可见明显的水肿及炎性细胞浸润。单纯的XST不会对小鼠致敏,但是与OVA介导的过敏反应叠加后,与单给DNP-IgE/BSA或XST组比较,会显著提高血浆中内组胺、VEGF-A和SC5b-9水平(P<0.05、0.01),与建立的过敏-类过敏叠加模型表现出较好地一致性。结论 体外体内实验均表明IgE介导的过敏反应和C48/80引起的类过敏反应会产生叠加作用,加剧过敏介质的释放和免疫反应程度。同时此模型的建立也验证了XST存在过敏与类过敏叠加现象,该模型可为中药注射剂的临床前安全性评价及合理用药提供参考。     

非免疫性过敏反应细胞模型的建立

目的:通过非免疫性刺激物C48/80诱导大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞株RBL-2H3细胞脱颗粒反应正交试验,优化非免疫性过敏反应细胞模型建立条件.方法:在不同的孵育时间下,C48/80与不同浓度的RBL-2H3细胞共孵育,通过测定β-氨基己糖苷酶的释放率确定建立非免疫型过敏反应细胞模型的最优实验条件,并且分析不同检测方法间的差异.结果:不同浓度、不同孵育时间下的RBL-2H3细胞均可受C48/80诱导发生典型的脱颗粒反应,但不同条件下的脱颗粒程度和β-氨基己糖苷酶释放率都有显著差异.结论:当RBL-2H3细胞浓度为2×105 mL、孵育时间60 min时,细胞的感受性较好,其脱颗粒程度与药物浓度呈正相关.     

薄层扫描法测定安中解毒颗粒中绿原酸的含量

目的建立测定安中解毒颗粒中绿原酸含量的方法。方法采用硅胶G薄层板,以二甲苯-乙酸乙酯-70%乙醇-甲醇(3.5∶3.5∶1∶0.6)展开,紫外透射仪在365 nm处显色定位,在λs=310 nm,λR=245 nm条件下扫描测定。结果本线性范围为0.3~3μg,r=0.9978,平均回收率为99.89%,RSD=1.81%(n=4)。结论方法简单、准确、重现性好,可用于该产品的质量控制。     

药用注射辅料聚山梨酯80诱发类过敏反应的细胞研究

目的:观察聚山梨酯80诱导大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞株RBL-2 H3细胞脱颗粒现象,探讨其诱发类过敏反应的可能机制。方法:聚山梨酯80与RBL-2 H3细胞共同孵育60 min后,透射电镜观察细胞发生脱颗粒反应的形态学变化,荧光显微镜下观察细胞膜磷脂酰丝氨酸与Annexin V结合变化,分光光度法测定细胞上清液β-氨基己糖苷酶释放百分率,并通过阿利新蓝染色试验进行定性观察。结果:不同浓度聚山梨酯80可诱导细胞发生典型的脱颗粒反应形态学变化,与阴性对照组相比脱颗粒率及组胺释放率显著升高,且具有浓度依赖性。结论:聚山梨酯80单次、首次给药即可诱导RBL-2 H3细胞脱颗粒,释放组胺,诱发类过敏反应,这可能是其临床首次用药即引起严重不良反应的机制之一。