鼻咽癌放疗患者铜绿假单胞菌感染基因型同源性

目的：探讨鼻咽癌放疗患者铜绿假单胞菌（ PA ）感染的病原菌临床分布、耐药特点及其基因型（同源）亲缘关系。方法采用 BD phoenix 100全自动微生物鉴定药敏系统和 CLSI M100-S23指南对临床分离菌进行鉴定和耐药表型分组,应用随机引物扩增多态性（ RAPD ）技术进行基因分型同源性分析。结果49株 PA 来源于43位发生不同程度医院感染的鼻咽癌放疗患者,主要分布在咽拭子（46.94％）、痰（32.65％）、口腔分泌物（10.20％）等临床感染标本,耐药表型分组分别为Ⅰ组32株、Ⅱ组7株、Ⅲ组5株、Ⅳ组5株。49份PA 样本经扩增后电泳出46个电泳图谱,分19个基因型别。在放疗二区高分布的 H 型菌株（57.14％）与在放疗四区高分布的 J 型菌株（60.00％）高度同源,耐药Ⅲ组、Ⅳ组的组内及组间型别亲缘关系不明显。不同病区鼻咽癌放疗患者之间存在基因型高度同源的 PA 感染局部流行,不同型别高耐药菌株的感染散发,部分亲缘关系密切菌株的耐药表型相似。结论应用基因分型技术检测分析病原菌同源性对医院感染监测和追踪具有重要意义。     

甲氧西林耐药溶血性葡萄球菌的基因多态性研究

目的应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术,对甲氧西林耐药溶血性葡萄球菌（MRSH）进行基因多态性研究。方法对81株MRSH通过RAPD技术进行扩增,电泳条带采用SPSS13.0软件分析,根据树状图分型。结果81株MRSH通过RAPD技术可产生相对固定的6条电泳带,经遗传相关系数分析后可分为8型,其中A型占70.37%,而10株血培养阳性的MRSH中有9株为A型。结论通过RAPD分型研究,可以了解MRSH基因流行型的特性,为该菌的感染控制提供分子流行病学依据。     

金黄色葡萄球菌随机扩增多态性DNA分型及其应用

目的 利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorpohic DNA,RAPD）分析技术，对金黄色葡萄球菌进行基因分型，并观察临床耐药型与其基因型之间的关系。方法 利用自己合成的随机引物，建立RAPD检测分析方法，并利用这一方法对5株金黄色葡萄球菌进行基因分型的研究。结果 5株金黄色葡萄球菌中，2株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）为同一基因型，另外3株为两种基因型，均是敏感菌株。结论 从RAPD分析的初步结果可以看出，金黄色葡萄球菌的临床表现型与基因型存在一定的关系，本法有望且于临床金黄色葡萄球菌耐药的快速检测。     

黏质沙雷菌随机扩增DNA多态性DNA分型

目的明确同一时间段先后分离自同一病房2例患者的两株黏质沙雷菌是否属于同源菌。方法应用随机扩增DNA多态性（RAPD）技术对同一时间段先后自同一病房2例患者痰液标本中分离得的2株黏质沙雷菌进行RAPD基因多态性分析。结果2株黏质沙雷菌扩增出2条不同的电泳带谱。结论2株黏质沙雷菌为不同的RAPD基因型，非同源菌。     

多药耐药铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶及相关基因检测

目的了解分离到的多药耐药铜绿假单胞菌（MRPA）产金属β-内胺酶（MBLs）情况及基因类型,为进一步的流行病学研究提供依据。方法随机抽取2007年7月至2009年5月18株临床标本中分离出的经VITEK-32全自动细菌鉴定仪鉴定的铜绿假单胞菌（PA）,用GNS132进行药敏实验,部分药物用纸片扩散法（K-B法）补充测定;用改良三维试验法对细菌产MBLs进行验证;用PCR法检测IPM、VIM、SPM、GIM、SIM五种MBLs基因。结果药敏试验结果显示18株PA中9株对亚胺培南（IMP）耐药;三维试验显示有5株PA产MBLs;PCR扩增VIM基因阳性的有4株,GIM基因阳性的1株,VIM和GIM两种基因阳性1株,其他均未检测到相应基因。结论川北医学院附属医院分离到的MRPA,产MBLs是亚胺培南耐药的重要机制,且携带的MBLs基因类型具有多样性。     

湖南地区CTX-M型超广谱β内酰胺酶的研究

目的了解湖南本地区产CTX—M型超广谱β内酰胺酶（ESBLs）肠杆菌科细菌的检出率，确定其基因型，并对其流行病学特征进行研究。方法收集2004年10月至2005年7月湖南地区中南大学3家附属医院临床标本分离的多重耐药肠杆菌科细菌171株，按临床实验室标准委员会（CLSI／NCCLS）所推荐的方法进行表型确证试验，聚合酶链反应（PCR）进一步进行CTX—M酶基因型的检测，PCR产物测序并确定其基因型。结果171株多重耐药革兰阴性杆菌中142株表型检测阳性，经多重PCR扩增109株携带CTX—M基因，其中大肠埃希菌45株，肺炎克雷伯菌29株，阴沟肠杆菌21株，其他菌株14，CTX—M酶在产ESBLs肠杆菌科细菌中检出率达76．8％（109／142），经测序25株共检出3种基因型，即7株携带CTX-M-15、7株携带CTX-M-3和11株携带CTX-M-14。RAPD共做50株菌，26株大肠埃希菌有12种RAPD类型，14株肺炎克雷伯菌有6种RAPD类型，10株阴沟肠杆菌有7种RAPD类型。结论在湖南地区检出3种CTX—M型ESBLs基因，在一定程度上CTX—M酶存在克隆传播。     

新生儿呼吸道感染肺炎克雷伯菌随机扩增DNA多态性研究

目的建立肺炎克雷伯菌随机扩增DNA多态性（RAPD）基因分型的方法,并对新生儿病房呼吸道感染肺炎克雷伯菌进行分子流行病学分析。方法在对肺炎克雷伯菌进行RAPD反应体系优化的基础上,对我院新生儿病房下呼吸道分泌物分离获得的30株肺炎克雷伯菌,提取基因组DNA后进行RAPD分型,同时进行抗生素敏感性试验。结果30株肺炎克雷伯菌RAPD分型可分为14型,分型率100．0％;其中A型6株、B型4株、C型3株、D型3株、E型-H型各2株、I型-N型各1株。药敏结果显示分离菌株多重耐药情况严重,对第三代头孢菌素类抗生素耐药率高达50．0％-73．3％,但对亚胺培南仍高度敏感。结论RAPD可对肺炎克雷伯菌进行分子流行病学研究。新生儿病房内存在肺炎克雷伯菌流行株的交叉感染。     

多重耐药铜绿假单胞菌在医院内感染中的同源性分析

目的 了解重症监护病区（ICU）和神经内科在院内感染中检出的多重耐药铜绿假单胞菌之间是否存在同源性。方法 检测铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性，同时用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对多重耐药的铜绿假单胞菌进行基因分型。结果 两病区之间有19株铜绿假单胞菌对6种抗生素具有高耐药性。多重耐药菌株经聚合酶链反应（PCR）分析，两病区间铜绿假单胞菌无同源性表现。结论 铜绿假单胞菌在院内感染中无交叉感染的现象。     

应用随机扩增多态性DNA技术分型大肠艾希菌

目的对大肠艾希菌（E．coli）进行随机扩增多态性DNA（RAPD）法基因分型并应用于医院感染的判断。方法以优化的随机引物、反应体系和扩增条件对临床分离的161株E．coli进行RAPD法基因分型并按指纹图上DNA条带数及片段大小绘制基因分型图谱，同时对E．coli的医院内感染进行了观察与分析。结果161株临床分离E．coil共得RAPD型120种：E．coli的医院内感染确实存在。结论RAPD法可将E．coli分型120种并有效应用于E．coli医院内感染的判断。     

粪肠球菌耐庆大霉素基因的检测及分子流行病学研究

目的探讨患者医院内下呼吸道分离的粪肠球菌耐庆大霉素基因特点及粪肠球菌感染的分子流行病学。方法应用PCR技术检测庆大霉素高水平耐药株（HLGR）耐药基因及应用随机扩增多态性DNA分型法（RAPD）进行分子流行病学研究。结果48株下呼吸道痰标本分离的肠球菌均为粪肠球菌，其高水平庆大霉素的耐药率为87．5％，基因型均为aac（6′）-Ie-aph（2″）-Ia，为单一基因型，未发现aph（2″）-Ib、aph（2″）-Ic及aph（2″）Id基因型。对DNA的指纹图谱行聚类分析可分为3种基因型，命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，3个类型各个病区均有分布。结论根据粪肠球菌耐高水平庆大霉素的基因型选择有效的抗菌药物，我院分离的粪肠球菌其基因型不一致，无明显的优势菌株。     

肝移植术后阴沟肠杆菌感染耐药性及分子流行病学研究

目的了解肝移植术后阴沟肠杆菌感染的耐药谱和分子生物学特征及两者的关系。方法基因分型采用随机扩增多态性DNA(RAPD)法,耐药谱选用K-B法。结果RAPD分型将28株阴沟肠杆菌分为10种株型,耐药谱则将其分为7种不同的耐药型,28株阴沟肠杆菌中AmpC酶检出率为53.6%,未发现美洛培南耐药株。RAPD的基因分型得的遗传聚类图可分为10类。结论RAPD技术对肝移植术后阴沟肠杆菌感染的流行病学分析是一个有效的方法,肝移植术后阴沟肠杆菌有很高的耐药性,治疗应首选美洛培南,RAPD指纹图谱与耐药谱分型具有一定的相关性。     

Role of the ABC transporter MRPA (PGPA) in antimony resistance in Leishmania infantum axenic and intracellular amastigotes

Antimonial compounds are the mainstay for the treatment of infections with the protozoan parasite Leishmania. We present our studies on Leishmania infantum amastigote parasites selected for resistance to potassium antimonyl tartrate [Sb(III)]. Inside macrophages, the Sb(III)-selected cells are cross-resistant to sodium stibogluconate (Pentostam), the main drug used against Leishmania. Putative alterations in the level of expression of more than 40 genes were compared between susceptible and resistant axenic amastigotes using customized DNA microarrays. The expression of three genes coding for the ABC transporter MRPA (PGPA), S-adenosylhomocysteine hydrolase, and folylpolyglutamate synthase was found to be consistently increased. The levels of cysteine were found to be increased in the mutant. Transfection of the MRPA gene was shown to confer sodium stibogluconate resistance in intracellular parasites. This MRPA-mediated resistance could be reverted by using the glutathione biosynthesis-specific inhibitor buthionine sulfoximine. These results highlight for the first time the role of MRPA in antimony resistance in the amastigote stage of the parasite and suggest a strategy for reversing resistance.     

铜绿假单胞菌的临床分布及对环丙沙星耐药机制的研究

目的 分析医院铜绿假单胞菌（PAE）的临床分布和耐药性,并了解其对环丙沙星的耐药机制.方法 我院2011年9月-2013年9月收集的287株铜绿假单胞菌.采用琼脂纸片扩散法（K-B法）进行药敏试验,微量肉汤稀释法测定环丙沙星对PAE的最低抑菌浓度（MIC）.应用PCR方法扩增PAE的gyrA、gyrB、parC及parE基因,并测序来确定基因的突变.结果 287株铜绿假单胞菌以痰液标本中分离最多（76.3％）;主要感染分布在重症监护室（29.3％）和呼吸内科（22.6％）;且对哌拉西林/他唑巴坦及亚胺培南敏感,敏感率均在70％以上;而对氨苄西林及环丙沙星耐药率高,分别达97.9％和44.9％.在45株（环丙沙星MICs≥32 μg/ml）铜绿假单胞菌中,有42株均存在gyrA基因突变,且28株存在着gyrA基因和parC基因双突变.结论 铜绿假单胞菌多重耐药现象严重,gyrA基因突变是PAE对环丙沙星耐药的主要机制之一.应加强对铜绿假单胞菌的临床分布及耐药性监测,更好地指导临床合理用药,控制医院感染.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究

目的了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药特点和分子流行病学情况。方法对临床分离的金黄色葡萄球菌应用VITEK-32微生物分析仪及配套GPS118药敏卡测定其对12种抗菌药物的敏感性,头孢西丁纸片扩散法筛选MR-SA。对已筛选的12株MRSA,应用随机扩增多态DNA(RAPD)技术进行基因型别分析。结果 12株MRSA对氨苄西林、苯唑西林、青霉素G和红霉素全部耐药;对氯洁霉素、庆大霉素、左氧氟沙星均出现8株耐药;对万古霉素、利奈唑烷、喹努普汀/达福普汀全部敏感。RAPD将检测菌株分为3个型别(A～C)其中RAPD A型和B型是本院的主要流行菌株。结论 MRSA表现为多重耐药菌,本地区存在两种不同型别的MRSA流行克隆。     

Role of ABC transporter MRPA, gamma-glutamylcysteine synthetase and ornithine decarboxylase in natural antimony-resistant isolates of Leishmania donovani

OBJECTIVES: The resistance of clinical isolates of Leishmania donovani to sodium antimony gluconate (SAG), the mainstay of treatment in Indian visceral leishmaniasis, has become a critical issue in India. The present work investigates the mechanism of resistance to SAG in parasites isolated from patients who are unresponsive to SAG. METHODS AND RESULTS: Susceptibility to SAG as determined in vitro with intracellular amastigotes correlated well with the clinical response. The ABC transporter gene MRPA was amplified in resistant field isolates as part of an extrachromosomal circle. Co-amplification of the pterin reductase gene (PTR1) and MRPA suggests amplification of the H locus in SAG-resistant isolates. Amplification of MRPA was correlated to increased RNA as determined by real-time PCR. MRPA is an ABC-thiol transporter, and cysteine and glutathione were increased in the resistant isolates. Ornithine decarboxylase (a rate limiting enzyme in polyamine biosynthesis), and gamma-glutamylcysteine synthetase (a rate limiting enzyme in glutathione biosynthesis), the two building blocks of the main cellular thiol trypanothione, were overexpressed in some of the resistant isolates. CONCLUSIONS: A variety of resistance mechanisms to SAG, most of them consistent with a model based on the study of resistance in vitro, were present in clinical isolates from the same geographical region.     

Use of Random Amplified Polymorphic DNA for Rapid Molecular Subtyping of Corynebacterium diphtheriae

A total of 210 Corynebacterium diphtheriae strains isolated worldwide were assayed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay. RAPD was as discriminating as standard ribotyping, and in some cases, even further differentiation was obtained. RAPD can rapidly aid clinical and molecular epidemic studies in a simple and cost-effective manner.     

西安地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药现状及碳青霉烯酶基因研究

目的：调查西安地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药现状及碳青霉烯酶耐药基因携带情况,指导临床合理使用抗菌药。方法连续收集2012年8月至2013年7月西安地区四所医院临床标本中分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌共151株,通过药物敏感试验了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征,并采用聚合酶链反应技术（PCR）检测碳青霉烯酶耐药基因在耐亚胺培南铜绿假单胞菌中的携带情况。结果151株耐亚胺培南铜绿假单胞菌主要分布在神经外科 ICU （37．1％）、神经内科 ICU （27．1％）及烧伤科（19．9％）;所检菌株对多黏菌素 B 敏感,对其余9种抗菌药物均不同程度耐药;94株携带 VIM 基因,32株携带IMP 基因,5株携带 SPM 基因,3株携带 SIM 基因。结论耐亚胺培南铜绿假单胞菌多药耐药及泛耐药现象严重,其原因可能与产碳青霉烯酶耐药基因表达有关,耐药基因以 VIM、IMP 为主,临床应加强细菌耐药性监测,合理有效使用抗菌药物,防止耐亚胺培南铜绿假单胞菌的蔓延。     

Mutations in the cyp51A gene and susceptibility to itraconazole in Aspergillus fumigatus serially isolated from a patient with lung aspergilloma

OBJECTIVES: To monitor changes in itraconazole susceptibility of isolates from a patient undergoing treatment for pulmonary Aspergillus infection and relate these changes to genotypic/phenotypic alterations. METHODS: Six Aspergillus fumigatus isolates were serially recovered from the patient. Itraconazole MICs were determined by Etest and NCCLS methodology. Growth characteristics and phenotype were monitored. Molecular analysis included random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and sequencing of the cyp51A gene. RESULTS: The MIC of itraconazole against the first isolate before treatment was 0.25 mg/L; the MIC against the second isolate, recovered after 6 months of itraconazole therapy, was >16 mg/L; and that against the third isolate, obtained 2 months after discontinuation of the therapy, was 0.5 mg/L. The MIC against the last three isolates, acquired after restoration of itraconazole therapy for 4-7 months, was >16 mg/L. The six isolates shared identical band patterns of RAPD assay using four primers and the same sequence in intertranscribed spacers (ITS). Therefore, the six isolates were likely to be the same strain of A. fumigatus, and mutations involving itraconazole resistance possibly occurred in these isolates after prolonged itraconazole therapy. Sequencing of the cyp51A gene in the coding region revealed a mutation of M220I in cytochrome P450 sterol 14-alpha-demethylase in the second resistant isolate and a mutation of G54R in the last three resistant isolates. Expression changes of some pump genes, such as MDR3, may also, in part, be related to the resistance to itraconazole. CONCLUSIONS: We conclude that resistance of A. fumigatus to itraconazole occurred in a patient treated with the drug, and the resistance may result from mutations in the cyp51A gene-the gene encoding the target enzyme for itraconazole.