表达前列腺特异性膜抗原的DNA疫苗对肿瘤细胞的抑制作用

目的构建表达前列腺特异性膜抗原（PSMA）的DNA疫苗，观察其在体外对肿瘤细胞的免疫攻击和在体内对肿瘤细胞攻击的免疫保护作用。方法通过稳定转染构建表达PSMA的小鼠黑色素瘤细胞系B16-PSMA，将DNA疫苗pCDNA3．1-PSMA通过肌肉注射导入C57BL／6小鼠体内，分离小鼠脾细胞，检测细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）反应。以B16-PSMA细胞攻击免骺小鼠，观察免疫动物的无瘤生存期和肿瘤体积增长情况，评价DNA疫苗的抗肿瘤作用。结果DNA疫苗可诱导小鼠脾淋巴细胞CTL活性，经过免疫后的小鼠成瘤率降低，无瘤生存期延长，肿瘤生长缓慢，肿瘤组织内有较多淋巴细胞浸润，表明产生较强的抗肿瘤反应。结论表达PSMA的DNA疫苗能够诱导小鼠产生特异性免疫反应，对表达PSMA的肿瘤细胞的攻击产生免疫保护作用，为前列腺癌的预防和免疫治疗提供了新的思路。     

表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的:探讨表达钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和HPV E2融合蛋白的肿瘤疫苗在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫应答.方法:转染重组质粒得到高表达CRT、E2和CRT-E2融合蛋白的肿瘤细胞,作为肿瘤疫苗隔周两次腹腔注射免疫小鼠,17天后观察成瘤率,检测NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CIL活性以及睥淋巴细胞分泌IFN-γ水平,并观察荷瘤小鼠生存期.结果:高表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗免疫小鼠后,其成瘤率明显低于其他实验组,NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CTL活性和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平均显著高于其它实验组(P＜0.01),生存期也明显延长(P＜0.01).结论:小鼠体内实验显示,表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗能够诱导特异性CD8+T细胞免疫应答和NK细胞活性,显著抑制了肿瘤生长.     

CEA 迷你肽表位基因疫苗诱导小鼠抗肿瘤免疫的研究

目的:利用含有CEA625-667 基因的单倍体疫苗pcDNA-CEA625-667 及三串联体的DNA 疫苗pcDNA-triCEA625-667 免疫小鼠后,观察其诱导的抗肿瘤免疫效应。方法: 采用4 ~ 6 周纯系BALB/ c 小鼠,肌肉注射法分pc-DNA3.0、pcDNA-CEA625-667 、pcDNA-triCEA625-667 三组免疫小鼠,对其激发的机体特异性及非特异性免疫反应进行研究。流式细胞术检测免疫小鼠脾细胞的T 细胞亚群和CD4+ / CD8+比值;3 H-TdR 掺入法检测免疫小鼠的特异性淋巴细胞增殖;Western blot 杂交及ELISA法检测免疫小鼠血清中的CEA 特异性抗体;ELISA 法检测免疫动物脾细胞体外诱导IFN-β、IL-4、GM-CSF 的分泌水平。结果:实验组与对照组的CD4+ / CD8+比值差异无统计学意义;经过基因疫苗免疫的小鼠与天然小鼠相比,其脾细胞在体外与短肽共孵育之后,会在更短的时间内出现更明显的细胞增殖;免疫了CEA 迷你基因串联体肿瘤疫苗的小鼠血清中可以产生低滴度的抗体,提示HTL 的活化;免疫小鼠脾细胞上清中IFN鄄酌的含量明显高于对照组,而pc-DNA3.0,pcDNA-CEA625-667 ,pcDNA-tri-CEA625-667各组IL-4 的含量均很低,差异无统计学意义;迷你基因三倍体疫苗所引发的增殖效应以及释放细胞因子的水平均高于迷你基因一倍体,说明我们所采用将目的基因多倍串联的抗原改造的方式起到了增强免疫效应的作用。结论:CEA 迷你肽表位基因单倍体及三倍体疫苗均不能显著改变动物体内CD4/ CD8 比值,但均能诱导HTL 活化,使被免疫机体T 细胞趋向于Th1 效应且三倍体疫苗的免疫原性强于单倍体疫苗。     

HBV与HCV融合基因免疫的抗肿瘤作用研究

目的 :观察基因疫苗SpcDNA3.1、CpcDNA3.1及融合基因疫苗CSpcDNA3.1诱导BALB c小鼠 (H 2 d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg和HCcAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞 (H 2 d)接种动物后成瘤性的影响。方法 :3种重组质粒SpcDNA3.1、CpcDNA3 1和CSpcDNA3 1分别肌注免疫小鼠 ,3w后背部皮下接种质粒CSpcDNA3 1转染的P815细胞 ,观察小鼠成瘤和存活时间。LDH法检测免疫小鼠的脾淋巴细胞CTL活性。结果 :融合质粒CSpcDNA3 1可显著抑制肿瘤出现和生长 ,小鼠生存时间明显延长 ,生存率提高 ,CSpcDNA3 1免疫的小鼠脾淋巴细胞体外对转染的P815肿瘤细胞有明显的杀伤作用。结论 :融合基因疫苗CSpcDNA3 1免疫的小鼠能诱发特异性抗肿瘤细胞免疫。     

人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因疫苗的免疫原性

目的 :检测人免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)gag基因疫苗的免疫原性。方法 :分别以ELISA、荧光抗体染色和乳酸脱氢酶释放法 ,检测免疫小鼠血清抗体滴度、脾T细胞亚群的数量和淋巴细胞杀伤效应。结果 :血清抗体滴度、脾T细胞亚群的数量及淋巴细胞杀伤效应 ,重组质粒pVAXGAG免疫组与空载体pVAX1对照组相比较差异显著(分别为P <0 .0 5和P <0 .0 1)。结论 :HIV 1DNA疫苗质粒pVAXGAG在BALB/c小鼠中不仅可诱导特异性体液免疫 ,而且可诱导特异性细胞免疫。     

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答

目的 :检测表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答效果。方法 :将真核表达质粒pVAXGE肌肉注射BALB C小鼠 ,观察免疫小鼠脾T淋巴细胞亚群的数量、特异性CTL杀伤率及小鼠免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度。结果 :重组质粒pVAXGE免疫组小鼠脾淋巴细胞进行了增殖 ,脾特异性CTL杀伤率显著高于对照组 (P <0 0 1) ;小鼠免疫后于第 8周血清抗体达到最高。结论 :表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗质粒可诱导BALB C小鼠发生免疫应答     

肿瘤超声抗原疫苗联合低剂量环磷酰胺在小鼠体内抗肿瘤效应的研究

目的探索肿瘤超声抗原疫苗联合低剂量环磷酰胺(CTX)的抗肿瘤效应。方法 C57BL/6雄性小鼠48只,随机分为PBS对照组、CTX组、FBL3超声抗原疫苗组、FBL3超声抗原疫苗联合CTX组。按程序免疫3次后,每组随机取4只小鼠,流式细胞术比较脾细胞中CD4+CD25+Treg及CD8+T细胞比例,MTT法比较脾细胞杀伤FBL3功能,各组其余小鼠接种FBL3肿瘤细胞,观察成瘤时间及肿块大小。结果超声抗原疫苗不能诱导CD8+T细胞比例升高(P0.05);CTX可下调Treg细胞数量(P0.05);疫苗和CTX均可提高脾细胞体外肿瘤杀伤率并能缩小肿块体积、延长小鼠成瘤时间,两者联合显示更强的抗肿瘤效应。结论肿瘤超声抗原疫苗联合小剂量CTX可能通过提高体液免疫或固有免疫发挥抗肿瘤效应。     

重组BCG的抑瘤活性及免疫学机制研究

目的:对重组GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因的BCG(卡介苗)进行抑瘤活性及免疫学机制研究。方法:建立EB病毒阳性肿瘤动物模型,对小鼠成瘤时间、存活情况、肿瘤重量进行分析,检测重组BCG的抑瘤活性;用ELISA方法对重组BCG刺激机体产生的特异性抗体进行检测,乳酸脱氢酶法检测特异性CTL杀伤效应,ELISPOT法检测IFN-γ的分泌水平,流式细胞术、HE染色检测重组BCG免疫小鼠的肿瘤组织中的淋巴细胞浸润情况。用统计学方法对重组BCG免疫效果进行初步分析和评价。结果:肿瘤成瘤时间与其他对照相比明显延迟,肿瘤生长明显缓慢,小鼠生存期延长。ELISA检测结果表明,重组BCG免疫后能产生针对GM-CSF和LMP2A的特异性Ig G抗体,重组BCG免疫组的小鼠能检测到特异性CTL活性,用ELISPOT法检测到免疫小鼠淋巴细胞有IFN-γ分泌;流式细胞术及形态学观察的方法检测到重组BCG免疫的小鼠肿瘤组织中有淋巴细胞的浸润生长。结论:重组BCG诱导C57BL/6小鼠机体产生了体液免疫和细胞免疫反应,重组BCG对EB病毒阳性肿瘤细胞具有明显抑制作用。     

TH细胞在记忆性CTL介导的肿瘤抑制中的作用研究

目的 观察记忆性CTL的抑瘤作用是否需要抗原特异性TH细胞的辅助。方法 表达OVAT细胞表位SIINFEKL特异性TCR的T细胞转输RAG^-l-小鼠，经相应T细胞表位多肽刺激后产生记忆性CTL，将此记忆性CTL转输已产生特异性和非特异性TH细胞的C57BL／6小鼠体内并接种肿瘤细胞EG7。结果 经T细胞表位多肽免疫后，SIINFEKL特异性TCR T细胞成功在RAG^-l-小鼠体内增殖并分化为记忆性CTL；抗原特异性TH细胞可辅助产生较多效应性CTL但并没有完全的肿瘤抑制作用；记忆性CTL的完全抑瘤活性需要抗原特异性TH细胞的辅助。结论机体对肿瘤的长期完全杀伤作用不但需要肿瘤特异性抗原诱导产生的记忆性CTL，而且需要特异性TH细胞的辅助，肿瘤疫苗的设计必须包括特异性的CTL表位多肽和辅助性TH细胞多肽。     

CEA抗原表位串联体与FL共表达基因疫苗抑制小鼠肝癌细胞体内生长的研究

目的:观察CEA抗原表位串联体与FL共表达基因疫苗抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。方法:利用基因重组技术将CEA抗原表位三串联体和FL基因片段克隆到质粒pcDNA3.0上,肌注免疫BALB/c小鼠,观察重组基因疫苗对CEA阳性肿瘤的抑制作用、小鼠生存时间及其诱导小鼠杀伤效应细胞的活性。结果:pcDNA-triCEA625-667-sFL免疫组小鼠生存时间延长,肿瘤生长速度缓慢,瘤块较小,与对照组小鼠比较有显著性差异(P0.01);经pcDNA-triCEA625-667-sFL免疫的小鼠脾细胞对H22-CEA+的杀伤率明显升高,差异有显著性(P0.01)。结论:共表达三倍体CEA抗原表位和FL的基因疫苗可以有效抑制CEA阳性肿瘤在小鼠体内的生长,并增强小鼠杀伤效应细胞的活性。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 、CD8 T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础     

Co-administration of a DNA vaccine encoding the prostate specific membrane antigen and CpG oligodeoxynucleotides suppresses tumor growth

BACKGROUND: Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a well characterized prostate-specific tumor associated antigen. Its expression is elevated in prostate carcinoma, particularly in metastatic and recurrent lesions. These observations suggest that PSMA can be used as immune target to induce tumor cell-specific recognition by the host and, consequently tumor rejection. We utilized a DNA-based vaccine to specifically enhance PSMA expression. An immune modulator, such as CpG oligodeoxynucleotides which promote Th1-type immune responses was combined to increase the efficacy of tumor recognition and elimination. METHODS: A eukaryotic expression plasmid pCDNA3.1-PSMA encoding full-length PSMA was constructed. C57BL/6 mice were immunized with endotoxin-free pCDNA3.1-PSMA alone or in combination with CpG oligodeoxynucleotides by intramuscular injection. After 4 immunizations, PSMA specific antibodies and cytotoxic T lymphocyte reactivity were measured. Immunized C57BL/6 mice were also challenged subcutaneously with B16 cells transfected with PSMA to evaluate suppression of tumor growth. RESULTS: Vaccine-specific cytotoxic T lymphocytes reactive with B16 cells expressing PSMA could be induced with this treatment schedule. Immune protection was observed in vaccinated mice as indicated by increased tumor growth in the control group (100%) compared with the groups vaccinated with DNA alone (66.7%) or DNA plus CpG oligodeoxynucleotides (50%) respectively. Average tumor volume was smaller in vaccinated groups and tumor-free survival time was prolonged by the vaccination. CONCLUSION: The current findings suggest that specific anti-tumor immune response can be induced by DNA vaccines expressing PSMA. In addition, the suppression of in vivo growth of tumor cells expressing PSMA was augmented by CpG oligodeoxynucleotides. This strategy may provide a new venue for the treatment of carcinoma of prostate after failure of standard therapy.     

基因疫苗pcDNA3．0．PSMA肿瘤细胞模型的建立

目的 构建表达前列腺特异性膜抗原（PSMA）的肿瘤细胞模型，为基因疫苗的抑瘤效应研究及免疫机制的探讨提供实验材料。方法 脂质体转染法分别将PSMA．pcDNA3．0质粒和pcDNA3．0质粒转染至SP2／0细胞,G418筛选后获得了稳定生长的阳性克隆细胞株。RT．PCR、间接免疫荧光法、Westernblot检测PSMA蛋白的表达。结果 RT．PCR、间接免疫荧光法和Westernblot均证明转染了PSMA．pcDNA3．0质粒的SP2／0细胞表达PSMA。结论 成功建立了稳定表达PSMA的小鼠肿瘤细胞模型．最终为前列腺癌的预防和免疫治疗研究打下了坚实的基础。     

HIV-1CN54 DNA疫苗滴鼻免疫小鼠诱发系统和黏膜免疫应答

目的：探讨重组痘苗病毒rVVsyngp120或rVVmCN54gp120候选疫苗是否增强HIV-1CN54合成gp120基因(syngp120)DNA疫苗的免疫原性。方法：第0、7、14、21天用DNA疫苗滴鼻免疫小鼠,第28、35、42天再滴鼻接种rVVsyngp120或rVVmCN54gp120。体外测脾和肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞增殖应答与CD8^ CTL应答。测血清和黏膜洗液特异的IgG和IgA,并测其是否中和实验室适应株HIV-1SF33。结果：单纯DNA免疫后,脾和MLN淋巴细胞在体外发生增殖应答和CTL应答,且测出血清特异的IgG和黏膜洗液特异的IgA。重组痘苗病毒末次免疫后第2周(第56天),发现rVVmCN54gp120增强MLN淋巴细胞增殖应答和CTL应答,脾CTL应答也增强。rVVsyngp120则增强MLN CTL应答。同时发现：2组重组痘苗病毒免疫的动物其血清中特异IgG抗体滴度均有所增高,但黏膜(粪便和阴道)洗液特异IgA抗体滴度却未增高,未测出血清特异IgA和黏膜洗液特异IgG。免疫血清可中和HIV-1SF33,而阴道洗液却不能。结论：单纯DNA疫苗滴鼻免疫可诱发较弱的系统和黏膜体液免疫与细胞免疫,但维持时间短。重组痘苗病毒主要增强局部黏膜的细胞免疫应答,且稍增强系统体液免疫应答,未增强黏膜的IgA应答。免疫血清有中和作用。     

HIV DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫效果的研究

目的 构建含HIV-1B亚型中国株gagV3基因的DNA疫苗及重组腺病毒伴随病毒(rAAV)疫苗，并研究DNA疫苗和rAAV联合免疫的免疫效果。方法 将HIV-1B亚型中国株gagV3基因克隆入真核表达载体pCI-neo上，构建了含HIV-1 gagV3基因的DNA疫苗pCI-gagV3。采用电击法将pCI-gagV3质粒转染p815细胞，用G418压力筛选，得到转入重组质粒的细胞系p815-gagV3，用免疫酶法检测细胞系中HIV-1基因的表达。用该DNA疫苗进行小鼠免疫实验，检测免疫效果；用该DNA疫苗初次免疫，含同样gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒rAAV-gagV3加强免疫，采用免疫酶法检测免疫小鼠血清中HIV-1特异性的抗体水平，用乳酸脱氢酶法检测免疫小鼠的HIV-1特异性CTL水平。结果 pCI-gagV3可以在p815细胞中表达HIV-1的基因，免疫BALB／c小鼠后可以在小鼠体内诱发HIV-1特异性的细胞和体液免疫反应。HIV-1特异性抗体滴度为1：20；效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为41．7％。pCI-gagV3与rAAV-gagV3联合免疫并不能明显提高抗体水平，但可以提高CTL反应，效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为61.3％，高于单独用DNA疫苗或重组AAV疫苗免疫后产生的CTL活性。结论 DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫可以提高免疫小鼠产生的HIV-1特异性CTL反应。     

DNA免疫激发针对肾母细胞瘤CTL效应初步研究

目的 将鼠源肾母细胞瘤WT1基因一段序列(WT1y)构建于真核表达质粒pCDNA3.1( ),通过小鼠和体外细胞模型初步研究所激发的针对肾母细胞瘤CTL效应.方法 人工合成WT1基因一段序列,含有HLA-A*2402锚定残基的9个氨基酸.构建重组真核表达质粒pCDNA3.1( )/WT1y.免疫Balb/c小鼠,通过ELISA方法检测体液免疫反应;分离脾淋巴细胞,FCM检测脾淋巴细胞中CD4/CD8;将分离的脾淋巴细胞与小鼠肾母细胞瘤细胞共培养,检测其体外溶解组织相容性抗原型别一致的外源性靶细胞能力.结果 构建的重组质粒经测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;免疫组小鼠T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组(P＜0.01);体外具有较强溶解靶细胞的功能.结论 WT1基因的DNA疫苗初步研究具有很强的CTL效应,为小儿肾母细胞瘤的治疗提供了新的思路.     

Autoimmune response induced by dendritic cells exerts anti-tumor effect in murine model of leukemia

An autoimmune response can be induced with the application of dendritic cells (DCs), offering a viable tumor vaccine for cancer immunotherapy. Previous studies have shown that DC-based tumor vaccines in animal tumor models can inhibit tumor growth and induce autoantibodies transiently without clinical or histological features of autoimmunity. The present study aimed to investigate the role of immune response induced by dendritic cells-based therapy, especially anti-ds DNA antibodies in tumor inhibition. In this study, high titers of anti-ds DNA antibodies were induced after injecting syngeneic dendritic cells into BALB/c mice. In addition, mice immunized with DCs showed the inhibition of RL ♂ 1, BALB/c leukemia cell line, tumor growth, and prolonged survival times of tumor mice but no significant difference was found in specific CTL response and NK cell activity when compared to those of the control group. Anti-ds DNA monoclonal antibodies can recognize RL ♂ 1 cells but not normal cells by FACS analysis. Monoclonal anti-ds DNA antibody was demonstrated to be able to lyse tumor cells via complement mediated reaction in vitro and also exhibits the anti-tumor effects when the antibody was injected into tumor-implanted mice. The data suggested that immunization with dendritic cells can induce autoimmune response, which might exert anti-tumor activity in vivo.     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据     

Granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor,a potent adjuvant for polarization to Th‐17 pattern: an experience on HIV‐1 vaccine model

Cytokines are mediators for polarization of immune response in vaccines. Studies show that co‐immunization of DNA vaccines with granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor (GM‐CSF) can increase immune responses. Here, experimental mice were immunized with HIV‐1_{tat/pol/gag/env} DNA vaccine with GM‐CSF and boosted with recombinant vaccine. Lymphocyte proliferation with Brdu and CTL activity, IL‐4, IFN‐γ, IL‐17 cytokines, total antibody, and IgG1 and IgG2a isotypes were assessed with ELISA. Results show that GM‐CSF as adjuvant in DNA immunization significantly increased lymphocyte proliferation and IFN‐γ cytokines, but CTL response was tiny increased. Also GM‐CSF as adjuvant decreased IL‐4 cytokine vs mere vaccine group. IL‐17 in the group that immunized with mixture of DNA vaccine/GM‐CSF was significantly increased vs DNA vaccine group. Result of total antibody shows that GM‐CSF increased antibody response in which both IgG1 and IgG2a increased. Overall, results confirmed the beneficial effect of GM‐CSF as adjuvant to increase vaccine immunogenicity. The hallmark result of this study was to increase IL‐17 cytokine with DNA vaccine/GM‐CSF immunized group. This study for the first time provides the evidence of the potency of GM‐CSF in the induction of IL‐17 in response to a vaccine, which is important for control of infection such as HIV‐1.