小细胞肺癌抗独特型单链抗体的表达及活性研究

目的:在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌(SCLC)抗独特型抗体3F6单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法:从SCLC抗独特型抗体3F6小鼠杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录为cDNA。利用小鼠抗体骨架区共用引物,PCR扩增单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过人工设计的柔性连接肽(Gly4Ser)3连接构建3F6ScFv。再将其重组到原核表达载体pQE31中,构建3F6ScFv表达载体。转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达,用NiNTA树脂对表达产物进行变性纯化。通过凝胶(SephacrylS200)柱上在位复性后,用竞争ELISA检测复性的3F6ScFv活性。结果:获得了SCLC抗独特型抗体3F6的VH和VL基因,构建了3F6ScFv表达质粒。在大肠杆菌中高效表达3F6ScFv,表达蛋白的相对分子质量为32×103,以包涵体形式存在。纯化后获得较纯的3F6ScFv蛋白,经复性后可竞争2F7抗体与SCLCNIHH128细胞结合。结论:成功构建、表达、纯化和复性了SCLC抗独特型抗体3F6ScFv,获得有活性的3F6ScFv,为SCLC抗独特型抗体的进一步研究奠定了基础。     

抗人整合素β3亚基单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中表达

目的:构建抗人整合素β3亚基单链抗体(ScFv)基因,在大肠杆菌中表达并获得具有活性的ScFv。方法:从分泌抗人整合素β3亚基单抗(mAb)的杂交瘤细胞4F12中提取总RNA,RTPCR扩增VH和VL基因,通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3,并将其克隆至原核表达载体pQE中,获得含β3抗体基因的高效表达载体pQEβ3ScFv。将重组子转化大肠杆菌M15后诱导表达,并对表达产物进行纯化和凝胶柱上在位复性。结果:获得抗β3单抗的VH和VL基因,构建了pQEβ3ScFv,并在大肠杆菌中获得了表达,表达蛋白相对分子质量约为26×103,以包涵体形式存在,纯化和复性后,ELISA证实其具有良好的抗原结合活性。结论:成功构建、表达了抗人整合素β3亚基的ScFv基因,并获得了有活性的ScFv。     

抗人肺腺癌单链抗体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建抗肺腺癌的单链抗体(scFv),研究其表达条件,为将这一小分子抗体应用于临床奠定基础.方法:将抗人肺腺癌单克隆抗体的重链及轻链可变区基因插入表达载体pFUW80、pTH、pTF,分别在大肠杆菌XL1-Blue、Top10、GI698/GI724中诱导表达,得到噬菌体抗体或包涵体.用SDS-PAGE和ELISA鉴定检测活性.结果:SDS-PAGE的结果表明,在pTH和pTF的表达产物中,有一条43kD的特异条带,其分子量与预期相符,单链抗体以包涵体形式出现,其表达量达细菌总蛋白的18.6%.ELISA的结果表明,噬菌体抗体和经复性处理的包涵体具有与亲本单抗相同的特异性.结论:成功地构建和在大肠杆菌中表达了抗肺腺癌单链抗体.     

抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。     

人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建

目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性。结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出人可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库。BstNⅠ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础。     

抗人大肠癌单链抗体基因的克隆与表达

背景与目的：单链抗体相对于完整抗体具有免疫源性低、对肿瘤组织穿透力强的特点,日益成为肿瘤诊断和治疗的良好导向载体。本研究的目的是将抗人大肠癌单克隆抗体ND－1的重链可变区VH和轻链可变区VL基因借助一短肽序列（Gly4Ser)3进行重组,构建单链抗体基因ND－1scFv,并使其在大肠杆菌中表达。方法：采用RT－PCR技术从能够分泌ND－1单抗的鼠杂交瘤细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建ND－lscFv基因,经过常规转化和筛选,将其克隆至PET－28a( )表达载体,由IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达为ND－lscFv与His-Tag的融合蛋白。表达产物用Ni-NTA resin亲和层析方法纯化,并采用ELISA方法检测其免疫活性。结果：序列分析表明,ND－lscFv基因全长732bp,VH354bp位于上游;VL330bp位于下游。SDS－PAGE显示,重组蛋白相对分子量30kDa,与预期结果一致。scFv表达产物以不溶性包涵体形式存在,经亲和层析纯化后蛋白纯度达94％。ELISA结果显示scFv保留了与亲本抗体ND－1相似的免疫活性。结论：成功地构建了抗人大肠癌单链抗体ND－lscFv,并在大肠杆菌中获得了较高水平的功能性表达。     

Rb基因导入对膀胱癌细胞生长的抑制作用

由于免疫原性,鼠源性单克隆抗体在人体疾病治疗方面受到限制,运用基因重组技术,将抗体轻链、重链可变区基因连接,构建单链Fv(ScFv)基因.表达制备ScFv片段,由于其分子小,免疫原性弱,有潜在应用前景.本实验将获得的抗人肺癌单克隆抗体轻重链可变区基因,通过Linker基因序列连接并克隆至pIg20表达载体,表达制备抗人肺癌scFv融合蛋白.现报道如下.l 材料与方法1.1 抗人肺癌单克隆抗体3D_3(McAb3D_3)重链可变区基因(VH)克隆至表达载体pIg20,以SmaⅠ,XbaⅠ分别双酶切VH及pIg20质粒,以粘末端方式,将SmaⅠ-VH-Xba片段连接到pIg20载体,连接产物电穿孔法转染BL21菌,筛选鉴定.阳性子命名为pIgVH.1.2 将McAb3D_3轻链可变区基因(VL)克隆至pIgVH,以BgLⅡ、NcoⅠ分别消化中pIgVH及VL,以粘     

针对人CD133分子两个胞外段的单链抗体的克隆与表达

目的:克隆与表达针对人CD133分子两个不同胞外段的单链抗体。方法:提取杂交瘤细胞总mR-NA,利用简并引物PCR获得针对人CD133分子两个胞外段抗体可变区基因,再通过重叠延伸PCR的方法,用一段柔性linker(GGGGS)3将其相连,得到CD133 Ex-1 scFv和CD133 Ex-2 scFv基因。随后,将其克隆至携带6×His标签的原核表达载体pRSET-B中,然后对其进行了表达和鉴定研究。结果:获得分别针对CD133不同胞外段的单链抗体基因,并成功获得针对CD133两个胞外段的单链抗体,但该单链抗体主要以不溶性包涵体形式存在于胞内。包涵体蛋白经复性和镍柱亲和层析纯化后,得到纯度较高的单链抗体,通过蛋白质印迹实验证实,融合蛋白确实为单链抗体。结论:成功制备出针对CD133两个胞外段的单链抗体。该研究结果为其功能研究及其在肿瘤靶向治疗研究中奠定了物质基础。     

HPV16E7-HSP70 融合蛋白在大肠杆菌中表达及纯化

[目的]在大肠杆菌中表达HPV16E7-HSP70融合蛋白并进行纯化和复性,为进一步研究HPV16E7-HSP70融合蛋白抗喉癌免疫活性奠定基础.[方法]用构建的原核表达质粒pET28a HPV16E7-HSP70转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达;通过超声波裂解细菌,高浓度尿素裂解包涵体和Ni2+离子金属螯合亲和层析纯化目的蛋白;并对融合蛋白进行复性;用SDS-PAGE及Western Blot进行分析鉴定.[结果]SDS-PAGE 分析显示有分子量约为90kD的融合蛋白表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量可达30％;纯化后目的蛋白的纯度达到95％;经Western Blot鉴定复性后的融合蛋白能与抗HPV 16E7抗体、抗HSP70抗体特异性结合.[结论]HPV16E7-HSP70融合蛋白能够在体外大肠杆菌中表达获得.     

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的：MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段（ScFv)。方法：从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重,轻链可变区DNA（VH和VL DNA）,两者经linker DNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5 ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果：VH,VL和ScFvDNA分别约为340bp,320bp和750bp,在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个,结论：用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

Single-chain variable fragment antibody against human aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase expressed in recombinant Escherichia coli

The human aspartyl beta-hydroxylase (HAAH) is a highly conserved enzyme that hydroxylates epidermal growth factor-like domains in transformation-associated proteins. Previous studies showed that the gene of HAAH was overexpressed in many human malignancies. In the present study, the HAAH-specific single-chain variable fragment (ScFv) antibody was produced in recombinant Escherichia coli. The variable regions of the genes of the heavy chain (VH) and light chain (VL) cloned from the hybridoma cells G3/F11 were connected with a flexible linker using an overlap extension polymerase chain reaction. Nucleotide sequence analysis revealed that the anti-HAAH VH was a member of the VH V gene family and the VL gene belonged to the Vκ gene family VI subgroup. Extensive efforts to express the functional ScFv antibody in E. coli have been made by using two different prokaryotic expression vectors-pHEN1 and pET-16b-to compare the expression level and solubility of the antibody. The recombinant pHEN1/E1-anti-HAAH vector could express soluble ScFv, although the yield was only 7.8% of the total cellular protein. However, the pET-16b/E2-anti-HAAH vector produced the ScFv as inclusion bodies inside the host cytoplasm, although the expression level of the antibody was quite high (28.5% of the total cellular protein). Soluble ScFv antibody produced by pHEN1/E1-anti-HAAH was characterized for its antigen-binding characteristics. Its antigen affinity as antibody was measured by indirect enzyme linked immunosorbent assay analysis and proved to have high binding activity to the antigen HAAH.     

抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的基因构建及表达

目的　构建抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0并在大肠杆菌中表达。方法　从质粒pVC85中克隆出PE4 0基因 ,与抗胶质瘤单链抗体SZ39 ScFv基因进行拼接 ,构建出重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0基因 ,并将其克隆于表达载体pET2 0b( ) ,在大肠杆菌Bl2 1(DE3)pLysS中以IPTG诱导表达。结果　SDS PAGE分析显示表达产物主要以包涵体的形式存在 ,分子量为 6 8kD左右 ,与SZ39(ScFv) PE4 0的分子量理论推算值相符 ;Westernblot显示在 6 8kD处出现特异性显色印迹 ;凝胶灰度扫描显示其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。结论　重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0可经原核表达载体 ,pET2 0b( )在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中以包涵体形式得到较高效率的表达。     

Development of a second generation monoclonal single chain variable fragment antibody against Venezuelan equine encephalitis virus: expression and functional analysis

We have generated a single chain variable fragment (ScFv) antibody from a well-characterized monoclonal antibody (MAb) against Venezuelan equine encephalitis virus (VEE), by cloning variable regions of the heavy (V(H)) and the light (V(L)) chain antibody genes, connected by a DNA linker, in phagemid expression vector pCANTAB 5 E. MAb 1A4A1 was successfully cloned as a ScFv in Escherichia coli strain TG-1 and expressed as a approximately 30 kDa ScFv protein which was functional in recognizing VEE by ELISA. Results were reproduced in Escherichia coli strain HB2151 where the same clone, designated A116, was expressed primarily as soluble periplasmic protein. The 30 kDa A116 antibody displayed weak binding specificity to VEE antigen. Sequence analysis revealed a frame shift in the N-terminal region of the V(L) domain, upstream to the complementarity-determining region 1 (CDR1), as the probable cause of reduced activity. The protein sequence of A116 was highly homologous to published murine ScFv protein sequences except in the region of the identified frame shift.     

DEVELOPMENT OF GENETICALLY ENGINEERED MOUSE/HUMAN CHIMERIC AND SINGLE CHAIN ANTIBODIES AGAINST HUMAN BRAIN GLIOMA:A PRELIMINARY REPORT

Thetargetingdiagnosisandtherapyofmalignanttumorbymeansoftumormonoclonalantibody(mAb)isoneofthehighlypopularresearchsubjectsinrecentyears.ThemurineoriginmAbSZ,,'againstmalignanthumanbraingliomageneratedinourlaboratoryin1988hasbeenconjugatedwithadriamycinandshowntopossessanincreasedtargetingactivitybothinvitroandinanimalmodels.Inaddition,ithasbeenlabeledwithisotopesandusedastargetingagentforthediagnosticpurposeinhumanbraingliomapatients.'However,themurineoriginmAbpossessedthedrawbackofpotentia…     

重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

 目的　正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法　将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果　成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论　 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选

背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应。方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库。在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2scFv。结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因。在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库。经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2scFv单克隆,阳性率为33.7%。再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2scFv。结论:联     

ISOLATION OF ENDOTOXIN-SPECIFIC ANTIBODIES BY SELECTION OF AN SINGLE CHAIN PHAGE ANTIBODY LIBRARY

The development of antibody is now in the era of genetic engineered antibody after polyclonal antibody and monoclonal antibody. Among this, the technique of phage antibody library that is based on Smith抯 phage surface display system reported in 1985[1] has great potential in not only the preparation of human originated antibody but also the diagnosis and treatment of tumor. According to recent data, related papers have been increasingly reported on malignant melanoma[2-4], tumor-associated an…