日本血吸虫尾蚴(中国大陆株)表达序列标签的获取及同源性分析

目的 了解日本血吸虫尾蚴ｃＤＮＡ文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法 日本血吸虫尾 蜘ｃＤＡＮ文库中的噬菌体侵入大肠杆菌ＢＭ２５．８后环化成质粒。筛选出已转入质粒的菌株。提取质粒ＤＮＡ,用质粒上 的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＢＬＡＳＴｘ及ＢＬＡＳＴｎ公共数据库经编辑分 析的ＥＳＴ序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新ＥＳＴ序列,以编写好的程序和Ｅ－ｍａｉｌ方式递交,以获得ＧｅｎＢａｎｋ 登录号。通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论 在测出的５８个ＥＳＴ中有３个核 苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有２个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有７个ＥＳＴ的蛋白质序列与 其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有２７个ＥＳＴ的蛋白质及核苷酸序列同源性都很低。     

日本血吸虫(中国大陆株)成虫表达序列标签的获取及分析

随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST（ex-pressed　sequence　tag）,获得的EST通过 BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果在随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库150个单个重组克隆中,获得了56个有价值的EST序列,其中47个在GeneBank dbEST中登录。7.1％EST序列为日本血吸虫已知序列,3.6％为日本血吸虫同源序列,曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占25％,未知序列占55.6％。通过同源性分析可知,大多数同源序列具有看家基因功能。另外,也发现了几个有价值的基因。     

日本血吸虫表达序列标签的获取和分析

目的 运用表达序列标签(expressed sequence tag，EST)技术，从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列，为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点。方法 构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，将获取的EST登录GenBank，并进行生物信息学分析。结果 随机挑取382个阳性克隆进行测序，获得149个EST(登录号分别为：CA747382～CA747391，BU917055～BU917058，CA305307～CA305309，BU581980，BU582400～BU582403，BU666906和(A946548～CA946666)，同源性比较发现，部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。结论 EST技术有助于快速、经济地获取和研究日本血吸虫表达基因。     

日本血吸虫（大陆株）成虫基因表达谱的研究

报告作1998年至2000年有关日本血吸虫（大陆株）成早基因表达谱研究的结果，主要扬：已测定551条EST，其中519条EST已送入国际基因数据库（GenBank/dbEST），并获得了GenBank的登录号。经同源整合后，519长EST序列归类为388个基因序列，其中，24条（6.19％）为日本血吸虫已知基因序列；18条（4.64％）EST与曼长血吸虫已知基因序列同源，90条（23.19％）EST与其它生物的已知基因序列同源，同源基因包括精氮酸酶、酰胺酸酶、微纤维蛋白、肌动蛋白、细胞色素C氧化酶、二硫异构酶、加长因子、热激蛋白70、Y盒结合蛋白和抗凋亡因子等。其余的256条（65.98％）EST在Gen-Bank中未发现有已知基因的同源序列。将非日本血吸虫同源序列EST或未检索到同源序列的EST初步定义为日本血吸虫亲基因/未知基因序列EST，共364条。已克降日本血吸虫精氮酸酶基因、Y-盒结合蛋白基因和抗凋亡-1因子3个新基因的全长cDNA，其GenBank的登录号分别为AF402615、AF367371和AF333765。本研究结果丰富了血吸虫基因组数据，并为进一步筛选日本血吸虫疫苗候选基因或药物靶位提供了科学依据。     

表达序列标签分析在血吸虫基因组研究中的应用

表达序列标签分析是借助于100－400个核苷酸长度的标记引物，在随机选取cDNA克隆，进行5′端或（和）3′端进行大规模一次性测序，将得到的片段与数据本就EST分析在血吸虫基因组研究中的应用进行综述。     

日本血吸虫中国大陆株32ku抗原cDNA的克隆及其核苷酸序列分析

目的　研究日本血吸虫重组疫苗，表达和制备血吸32ku抗原重组疫苗。方法　根据Merekelbach等报道的日本血吸虫中成虫32ku抗原完整编码序列设计引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板，采用逆转录—聚合酶链反应技术，扩增其32ku抗原完整编码区cDNA。将cDNA重组于pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌。结果　重组质粒经测序进行鉴定，结果与Merckelbach等报道的32ku抗原编码区cDNA进行比较，二序列一致。结论　32ku抗原在不同的地区异株间的32ku蛋白进化上存在高度保守性，因此32ku抗原可以作为重组疫苗的候选抗原。     

日本血吸虫尾蚴不同途径感染小鼠的比较

本对医学实验动物感染日本血吸虫尾蚴的时间和方法进行了观察，结果表明小白鼠建立日本血吸虫病的动物模型时，选用经腹壁皮肤感染的方法效果好，感染时间短，感染率、成活率高。     

抗日本血吸虫病天然分子疫苗免疫猪血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库结果分析

目的通过天然分子疫苗免疫猪血清作为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,应用表达序列标签获得日本血吸虫新基因.方法制备天然分子免疫猪血清,将筛选的尾蚴cDNA文库中大肠杆菌XL1-Blue侵入大肠杆菌BM25.8后环化成质粒,筛选出已转入质粒的菌株.提取质粒DNA,进行测序,得到一个表达序列标签(EST).通过NCBI网站的BLASTx及BLASTn公共数据库,编辑分析EST序列并进行同源性比较.结果从26个克隆样品中筛选出8个阳性克隆,其中有一个新基因(GenBank登录号DQ097517),该基因全长861 bp,有完整的阅读框架,与蜜蜂(Apis mellifera)SMC3蛋白编码的mRNA基因序列同源性最高.结论疫苗免疫猪血清可作为筛选日本血吸虫新基因的有效探针,新发现1个日本血吸虫相关基因.     

紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴抗原的初步分析

目的：探讨日本血吸虫尾蚴经紫外线（UV）照射后抗原成分的改变。方法：日本血吸虫尾蚴经UV（400uW/cm^2)照射1min后，取其可溶性抗原经照射尾蚴抗原（UVCA）与未经照射的尾蚴可溶性抗原（NCA）同步进行SDS－PAGE和免疫印迹试验。结果：经UV照射后，日本血吸虫尾缦新出现了Mr212000和82000抗原带，Mr116000,26000和16000抗原带浓度明显升高，NCA的M，67000分子仅能被UVCA免疫猪血清识别，而不能被感染猪血清识别，Mr79000和94000与免疫猪血清的反应也明显强于感染猪血清，结论：UV照射后新出现或含量增加的抗原成分以及仅免疫猪血清所别的抗原分子可能是照射尾蚴激发高度保护性免疫的主要因素。     

日本血吸虫精氨酸酶编码基因cDNA的分离和序列分析

目的：分离和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.j)新基因。方法：应用免疫学方法筛选S.j.cDNA库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标答（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定／采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。结果：获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个804bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44％,50％,51％,53％和54％,结论获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了.     

日本血吸虫新基因的发现及其功能的初步预测

本文运用表达序列标签（expressed sequence tags,EST）法筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cD-NA文库,获得50个日本血吸虫EST片段,经过测序后将EST序列送入EMBL和NCBI、Genbank进行同源性分析并登录。为寻找新的抗血吸虫疫苗候选分子、化疗药物及具有我国自主知识产权的血吸虫功能基因奠定工作基础。     

日本血吸虫(大陆株)成虫基因表达谱的研究

报告作者 1998年至 2 0 0 0年有关日本血吸虫 (大陆株 )成虫基因表达谱研究的结果 ,主要包括 :已测定 5 5 1条EST ,其中 5 19条EST已送入国际基因数据库 (GenBank/dbEST) ,并获得了GenBank的登录号。经同源整合后 ,5 19条EST序列归类为 388个基因序列 ,其中 ,2 4条 (6 19%)为日本血吸虫已知基因序列 ;18条 (4 6 4 %)EST与曼氏血吸虫已知基因序列同源 ,90条 (2 3 19%)EST与其它生物的已知基因序列同源 ,同源基因包括精氨酸酶、酰胺酸酶、微纤维蛋白、肌动蛋白、细胞色素C氧化酶、二硫异构酶、加长因子、热激蛋白 70、Y盒结合蛋白和抗凋亡因子等。其余的 2 5 6条 (6 5 98%)EST在Gen Bank中未发现有已知基因的同源序列。将非日本血吸虫同源序列EST或未检索到同源序列的EST初步定义为日本血吸虫亲基因 /未知基因序列EST ,共 36 4条。已克隆日本血吸虫精氨酸酶基因、Y 盒结合蛋白基因和抗凋亡 1因子 3个新基因的全长cDNA ,其GenBank的登录号分别为AF4 0 2 6 15、AF36 7371和AF33376 5。本研究结果丰富了血吸虫基因组数据 ,并为进一步筛选日本血吸虫疫苗候选基因或药物靶位提供了科学依据。     

日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析

【目的】研究日本血吸虫亲免素基因编码序列的结构及进行初步的功能预测。【方法】用5’端和3’端锚定PCR从尾蚴库中扩增，以获取日本血吸虫中国大陆株亲免素基因完整的开放阅读框(open reading frame，ORF)；用生物信息学技术确认其是否为亲免素编码基因并进行结构功能的初步分析和预测。【结果】用5’端和3’端锚定PCR从尾蚴库中获得了亲免素基因5’端和3’端所缺序列，得到的亲免素基因cDNA的总序列长为1438bp，其ORF长1296bp，编码431个氨基酸。利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫亲免素基因的完整cDNA序列。并用RT-PCR从日本血吸虫尾蚴mRNA扩增出亲免素基因的ORF。【结论】成功获得了日本血吸虫亲免素编码基因的全长cDNA，为进一步的功能研究打下了基础。     

紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴抗原的初步分析

目的探讨日本血吸虫尾蚴经紫外线(UV)照射后抗原成分的改变。方法日本血吸虫尾蚴经UV(400 μW/cm2)照射1 min 后,取其可溶性抗原经照射尾蚴抗原(UVCA)与未经照射的尾蚴可溶性抗原(NCA)同步进行SDS-PAGE和免疫印迹试验。结果经UV照射后,日本血吸虫尾蚴新出现了Mr 212 000和82 000抗原带,Mr 116 000、26 000和16 000抗原带浓度明显升高;NCA的Mr 67 000分子仅能被UVCA免疫猪血清识别,而不能被感染猪血清识别,Mr 79 000和94 000与免疫猪血清的反应也明显强于感染猪血清。结论UV照射后新出现或含量增加的抗原成分以及仅免疫猪血清所识别的抗原分子可能是照射尾蚴激发高度保护性免疫的主要因素。     

日本血吸虫尾蚴标本制作流程的改进

目的：探索日本血吸虫尾蚴标本制作流程的改进.方法：启用灿烂甲酚兰、伊红染色,改革制作流程,省略了传统制作中的固定、分色、脱水、透明等步骤.结果：制成的日本血吸虫尾蚴标本,结构清晰美观,虫体弯曲自然,无卷曲、重叠.结论：改进后的方法效果好,提高了标本的制作质量,而且操作简单易行,值得在有关教学与科研单位推广.     

日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosorna japonicum,Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的防治提供药物靶标或候选疫苗。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶新基因的cDNA序列(AY226980)，全长594bp，编码157个氨基酸，编码蛋白与人类或鸽、鸡、鼠及果蝇的核苷二磷酸激酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的cDNA序列。     

日本血吸虫精氨酸编码基因CDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S.jcDNA文库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标签（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定;采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44%,50%,51%,53%和54%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

日本血吸虫精氨酸酶编码基因cDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S .j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S .jcDNA文库获得阳性克隆 ;通过PCR直接序列测定技术 ,表达序列标签 (EST)同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定 ;采用亚克隆技术及生物信息学等技术 ,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含10 6 1bp外源插入片段的阳性克隆 ,其cDNA序列含有一个 840bp的阅读框 ,编码 2 79个氨基酸 ,属精氨酸酶家族 ,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为 44 % ,5 0 % ,5 1% ,5 3%和 5 4%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA ,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

日本血吸虫(大陆株)26ku谷胱甘肽转移酶基因真核表达载体构建及序列分析

目的　构建日本血吸虫大陆株 2 6ku谷胱甘肽转移酶 (GST)基因真核表达质粒 pBK SjGST并进行序列分析 ,为进一步进行重组蛋白的表达及保护性免疫研究提供条件。方法　根据日本血吸虫菲律宾株 2 6kuGST核苷酸序列 ,设计合成一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板 ,通过RT PCR合成日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGSTcDNA片段。将其克隆入 pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK SjGST ,转化到大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果　PCR、pGEM T SjGST及 pBK SjGST分别经双酶切获得一特异性基因片段 .经测序分析该片段具有一个 670bp的全基因序列 ,而其开放阅读框 (openreadingframe,ORF)为 65 7bp ,编码 2 18个氨基酸 ,并对其基因序列及编码的蛋白质进行了分析。结论　成功地构建了日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGST基因真核表达重组质粒 ,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析