182株儿童患者肺炎链球菌的分子生物学鉴定及分型

目的对来自患儿的肺炎链球菌进行分型,为肺炎链球菌疫苗的正确选择提供科学依据。方法收集2014年来自河北省儿童医院的182株肺炎链球菌,普通PCR对肺炎链球菌进行种属鉴定,应用多重PCR方法对菌株进行菌型分析。结果经PCR检测182株菌的cpsA基因扩增均为阳性;经多重PCR检测,除8株未分型菌株外,其余174株肺炎链球菌中,以19F、19A和6A/6B型数量最多,分别为68株(37.36%)、33株(18.13%)和26株(14.28%),其余型别有35B型、14型、6C/6D型、23F型、15B/15C型等。结论 182株肺炎链球菌的菌型主要为19F、19A和6A/6B,为该省肺炎链球菌疫苗的正确选择和制订使用策略提供了科学依据。     

成人重症肺炎的肺炎链球菌血清型及耐药性分析

目的 探讨ICU内重症肺炎患者痰及支气管灌洗液中肺炎链球菌的常见血清型及耐药性.方法 2019年8月-11月收集本院ICU内机械通气重症肺炎患者的痰液和支气管镜冲洗液,分离培养肺炎链球菌.荚膜肿胀试验确定肺炎链球菌的血清型;纸片扩散法和E-test法检测肺炎链球菌对抗生素的敏感性;PCR检测mefA和ermB基因.结果...     

肺炎链球菌PCR分型技术的建立与应用

目的 建立肺炎链球菌血清型分型的PCR简便方法 ,初步了解肺炎链球菌血清型/群的分布状况.方法 设计合成12种肺炎链球菌血清型/群特异性引物,优化不同血清型/群引物FCR条件,并检测最佳反应浓度、灵敏性以及特异性;初步应用于肺炎链球菌菌株的血清型/群检测.结果引物浓度优化后,12种肺炎链球菌血清型/群特异引物呈现较好的特异性与敏感性;对119株肺炎链球菌菌株进行PCR分型检测,其中113株可分为9个血清型/群(3、5、6A/B、9A/V、14、18、19A、19F、23F),6株未分群.结论 初步建立了12种血清型/群肺炎链球菌PCR分型技术,可用于鉴别人群中主要流行的肺炎链球菌血清型/群.     

肺炎链球菌毒力基因表达差异性及对大环内酯类耐药性分析

目的探讨临床分离各表型肺炎链球菌毒力基因表达的差异性并分析其对青霉素和大环内酯类抗菌药物的耐药性。方法收集2012年12月-2016年12月不同来源的肺炎链球菌111株,分为侵袭性组和非侵袭性组,采用荚膜肿胀实验进行血清学分型,聚合酶链反应(PCR)和荧光定量PCR检测psaA、ply、lytA、cbpA、nanA毒力基因,最低抑菌浓度(MIC)法检测药物敏感性并用PCR检测相关耐药基因(PBP1A、PBP2B、PBP2X,ermB、mefA)。结果 111株肺炎链球菌共检出24个血清型/群,流行血清型为:19F、19A、14、23F、6A、6B。所有菌株5个毒力基因的携带率基本均接近100%;侵袭性菌株nanA、lytA、psaA、ply 4个毒力基因在转录水平高于非侵袭性菌株,此外19F和6A/B血清型中侵袭性菌株这4个毒力基因转录水平也高于非侵袭性组;nanA、psaA、cbpA和ply在3型中的转录水平高于其他血清型。血液与痰液标本来源的肺炎链球菌毒力基因转录水平有一定差异但无统计学意义,脑脊液来源与血液,痰液比较,转录水平增高;脑膜炎肺炎链球菌青霉素非敏感率为70.00%(7/10),非脑膜炎肺炎链球菌青霉素非敏感率为18.81%(19/101),90.09%(100/111)菌株同时对红霉素和克林霉素耐药,主要携带ermB基因。结论常见5种毒力基因在肺炎链球菌中普遍存在,但不同致病类型、不同血清型和不同来源菌株基因表达水平存在差异,侵袭性3型和脑脊液来源的菌株毒力较强,且该地区肺炎链球菌对青霉素、红霉素和克林霉素耐药率较高,尤其是脑膜炎肺炎链球菌,应引起临床重视。     

15株婴幼儿来源的肺炎链球菌MLST分型及耐药性分析

目的 分析本院肺炎链球菌的临床耐药和血清型别分布情况，为临床防治提供参考。方法 收集2022年9月～2023年1月采集的65例支气管肺炎患儿的痰液标本，进行肺炎链球菌筛查，有疑似菌落经VITEK2 compact及配套的GP鉴定卡及使用AST-GP68药敏鉴定卡进行检测，同时提取菌体DNA进行肺炎链球菌多重PCR血清型检测以及细菌全基因组测序，进行多位点序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)在线分析。结果 共检出15株肺炎链球菌，检出率为23.1%。依据最小生成树聚类，其中7株(19F,ST271)聚类为clusterⅠ,3株(19A,ST320)为clusterⅡ,3株(6B,ST902)为clusterⅢ,1株(11A,ST12902)和1株(15B,ST8589)为独立类别。15株菌株对红霉素、四环素、复方新诺明3种抗生素全部耐药，有5株(3株19A,1株6B,1株19F)表现为对氨苄青霉素耐药。结论 15株菌株以19F血清型和ST271为主，且对多种抗生素耐药，提示临床上应加强婴幼儿肺炎链球菌的血清型、分子分型及耐药性监测。     

2017-2019年苏州地区儿童肺炎链球菌血清分型及耐药特征

目的 了解苏州大学附属儿童医院呼吸道感染儿童肺炎链球菌菌株的血清型分布及耐药特征,为制定肺炎链球菌相关疾病的治疗和预防接种策略提供参考.方法 采用乳胶凝集和荚膜肿胀试验对肺炎链球菌菌株进行血清分型,采用E-test法检测菌株对多种抗生素的耐药性.结果 2017年1月-2019年7月共收集3 652株肺炎链球菌,主要来自...     

2014—2022年湖南省病人来源猪链球菌2型鉴定及毒力基因分析

目的 了解2014—2022年湖南省人感染猪链球菌病病人分离株型别分布与毒力基因携带情况,为人感染猪链球菌病的防控提供依据。方法 收集2014—2022年湖南省人感染猪链球菌病临床分离株,通过传统生化反应和聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测猪链球菌种特异性基因16S rRNA,同时用PCR对2型血清型鉴定基因(兼荚膜多糖毒力基因)cps2J和7种毒力基因进行扩增,用毛细管电泳检测扩增产物,分析病人来源猪链球菌的型别与毒力基因携带情况。结果 2014—2022年湖南省38株人感染猪链球菌病临床分离株中,1株为羊链球菌,32株为猪链球菌2型,5株生化鉴定为2型的菌株经分子分型鉴定为猪链球菌其他型别。32株猪链球菌2型菌株中,46.88%的菌株携带全部8种毒力基因,40.63%的菌株携带除mrp外的7种毒力基因。携带cps2J、fbps、ef、gdh、orf2、gapdh 6种毒力基因与携带cps2J、sly、gdh、orf2、gapdh 5种毒力基因的菌株均占3.13%,6.25%的菌株携带cps2J、gdh、orf2、gapdh 4种毒力基因...     

ICU患者感染CRKP与CSKP的耐药基因和毒力基因

目的 分析重症监护病房(ICU)患者感染耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)与碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)的耐药基因及毒力基因。方法 选择2015年11月-2019年11月浙江大学附属第一医院ICU收治的感染肺炎克雷伯菌患者297例,根据其感染菌株是否耐碳青霉烯类分为CRKP组86例和CSKP组211例,采用全自动微生物分析仪进行菌株鉴定和药敏试验,采用多位点序列分型(MLST)分析CRKP与CSKP菌株基因分型和同源性,采用黏液丝试验检测毒力表型,采用聚合酶链式反应(PCR)检测荚膜血清型及毒力基因。结果297株肺炎克雷伯菌共检出CRKP菌株86株和CSKP菌株211株,CRKP菌株对常用抗菌药物的耐药率高于CSKP菌株(P<0.05);86株CRKP菌株共检测到6个ST型,以ST11型(59.30%)为主,211株CSKP菌株共检测到12个ST型,以ST405型(21.33%)为主;86株CRKP菌株检出K5型4株(4.66%),K1型3株(3.49%),211株CSKP菌株共检出74株(35.07%)高毒力荚膜血清型;CSKP组magA、ybt、kfu基因阳性率高...     

多重PCR技术检测b型流感嗜血杆菌荚膜基因

目的应用多重PCR技术研究杭州地区儿童中分离的流感嗜血杆菌b型菌株的检出率。方法以玻片凝集法的血清分型为金标准,以流感嗜血杆菌(Hi)荚膜编码基因(bexA)和b型特异性荚膜基因序列设计引物,应用多重PCR技术对流感嗜血杆菌菌株进行荚膜基因检测。结果 2001-2002年和2006-2007年分离的399株Hi临床株中,血清分型显示不可分型株297株,占74.44%,可分型株102株,占25.56%。b型仅1株,构成比0.98%。多重PCR检测显示:102株玻片凝集法可分型的菌株中,101株bex A PCR结果阳性,1株阴性;297株不定型株中2株bex A阳性。敏感度99.02%;特异度99.33%。Hib检测结果显示b型1株,占有荚膜菌株0.99%,与血清分型结果一致。结论 bex A PCR联合针对b型特异性荚膜基因的多重PCR技术,对Hib检出率100%,克服了血清分型的弊端。     

91株肺炎链球菌的血清型分布及耐药性分析

目的 了解重庆地区肺炎链球菌临床分离株的血清型分布及药物敏感性.方法 采用荚膜肿胀试验进行肺炎链球菌血清学分型,并计算疫苗(PVC7、PVC11、PVC13)覆盖率;肉汤稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC).结果 91株肺炎链球菌的临床分离患者年龄呈典型双峰分布,以＜5岁婴幼儿与＞50岁中老年人群为主,占51.7％、27.5％;90株肺炎链球菌共鉴定出20个血清型,1株未能血清分型,常见的肺炎链球菌血清型为19F、19A、6B,PVC13覆盖率为74.4％;91株肺炎链球菌均表现出较高的耐药率,在67株β-内酰胺类抗菌药物不敏感株(BLAs)中,青霉素不敏感菌株(PNSP)占53.8％.结论 重庆地区肺炎链球菌临床分离株以19F、19A、6B血清型为主,PVC13的预防作用更显著;肺炎链球菌耐药性高尤其是大多数菌株呈多药耐药趋势,临床应注意合理选择用药.     

人感染2型猪链球菌快速多重PCR检测方法的建立

目的：用多重PCR从临床标本中同时检测猪链2型特异性及5个毒力相关基因，建立SS2实验室快速诊断及应急检测的核酸鉴定方法。方法：根据已报告的引物序列设计并合成8对引物（含1对内对照引物），经过PCR反应条件的优化与组合，采用同一PCR反应条件与循环程序，直接从临床标本或培养物中同时一次性扩增属特异性（tuf）、种特异性（16S rRNA）、荚膜多糖（cps2J）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、细胞外蛋白因子（ef）、溶血素（sly）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）等基因；并对方法的特异性和敏感性进行评估。结果：运用所建立的方法可直接从临床疑似猪链感染患者的脑脊液、血液、双相培养液和血培养物中一次性扩增出上述8对引物的目的基因，并经基因序列分析、细菌分离培养和生化鉴定进一步证实。其敏感性为78cfu（克隆形成单位）。结论：所建立的方法具有敏感、特异、快速、简便的特点，可应用于SS2感染应急检测、流行病学监测和实验室快速诊断。     

2016年海南省高毒力肺炎克雷伯菌的临床分布、毒力基因和分子流行病学特点

目的分析2016年海南省某医院高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）的临床分布、荚膜分型、分子分型、毒力基因携带及药敏情况。方法回顾性分析2016年1—12月该院临床分离的肺炎克雷伯菌,通过黏液拉丝试验选取hvKP,对菌株进行药敏试验,与普通肺炎克雷伯菌（cKP）比较;采用聚合酶链反应（PCR）法对菌株进行荚膜分型、毒力基因和耐药基因检测,采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）方法对菌株进行分子分型。结果共分离hvKP 84株,其中主要标本来源为痰（45株）;K1和K2是hvKP的主要荚膜型,ST23、ST65和ST86是hvKP的主要ST型;rmpA、aerobatin、allS、kfuBC和cf29a在hvKP中的携带率分别为90.48%、96.43%、42.86%、66.67%和53.57%,均高于cKP,PFGE发现allS基因仅存在于K1型;hvKP对抗菌药物的耐药率普遍低于cKP。结论痰是hvKP菌株,尤其是K1型hvKP的主要标本来源;超过90%的hvKP菌株携带rmpA和aerobatin基因,allS基因仅存在于K1型hvKP中。     

贵州省死亡病例1型猪链球菌的分离及分子生物学特征分析

目的 对来自贵州省1例疑似人感染猪链球菌患者的血液标本进行细菌分离鉴定,了解该菌株的分子生物学特征,为病例的快速确诊提供病原学依据。方法 采用血培养法对疑似感染猪链球菌患者的血液进行细菌分离培养,对分离菌株采用细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR扩增和DNA序列测定,将测序结果通过GenBank数据库的BLAST程序进行在线比对,再用猪链球菌种特异的16S rRNA 基因进行猪链球菌种的鉴定,进一步分别采用PCR检测常见强致病性血清型1、2、7和9型特异的cps 1j、cps 2j、cps 7h和cps9h基因以鉴定其血清型,并对菌株毒力基因gapdh、mrp、sly和ef进行检测。结果 血培养分离出1株链球菌可疑菌株,序列比对结果显示该分离菌株16S rRNA基因与猪链球菌的同源性最高,进一步的猪链球菌特异性PCR检测显示分离菌株16S rRNA基因为阳性,血清型特异PCR检测结果显示cps 1j基因为阳性,而cps 2j、cps 7h和cps 9h基因为阴性,毒力基因检测结果显示分离菌株gapdh,sly和ef毒力基因为阳性,而mrp为阴性。结论 本次从疑似感染猪链球菌死亡病例分离的菌株为猪链球菌1型,其毒力特征为gapdh、sly和ef基因阳性,mrp基因阴性,该病例为1型猪链球菌感染所致,且菌株毒力较强。     

致病性猪链球菌主要毒力因子基因多重PCR检测

目的建立多重PCR体系．实现猪链球菌毒力相关因子基因cps、mrp、epf，（epf^＊）和sly的同步检测。方法根据上述毒力因子基因核苷酸序列，设计和合成4对特异性引物，通过体系和条件优化，建立多重PCR检测方法，并对72株种属背景明确的实验菌株（其中猪链球菌48株、阴性对照株24株）及49株猪临床分离的链球菌样本进行检测分析。结果48株猪链球菌中，cps2检出率为33．3％（16／48）、mrp检出率为29．2％（14／48）、epf检出率为25％（12／48）、epf^＊检出率为6．3％（3／48）、sly检出率为54．2％（26／48），上述检测结果与菌株的毒力因子背景情况完全相符；24株阴性对照和49株猪临床分离样本毒力因子检测结果均为阴性。结论多重PCR可用于猪链球菌毒力相关因子CPS2、MRP、EF、Sly的基因检测，特异性和敏感性好，为该病快速诊断和分子流行病学调查提供了新的技术手段。     

A real-time multiplex SYBR Green I polymerase chain reaction assay for rapid screening of salmonella serotypes prevalent in the European Union

A two-step real-time SYBR Green I multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay with melting curve analysis was developed for rapid detection of 19 Salmonella serotypes frequently encountered in humans, animals, and animal-associated meat products within the European Union. The first-step single-tube reaction (Multiplex PCR I), consisting of five primer pairs, classified an initial test panel of eight Salmonella serotypes into five groups on the basis of characteristic amplicon melting temperatures produced by each strain. Following designation into groups, two subsequent triplex reactions (Multiplex PCR II-G1 and II-G3) allowed for further identification of five Salmonella serotypes by their melting peak temperatures. Primers for serotype differentiation were designed to target the genes encoding either phase 1 and 2 flagellar antigens fliC and fljB or unique serotype-specific loci. In addition, the assay simultaneously screened for the presence of the ampicilin-amoxicillin, chloramphenicol-florfenicol, streptomycin-spectinomycin, sulfanomides, and tetracycline (ACSSuT)-type multidrug resistance pattern, indicated by the floR gene, and for the Salmonella virulence plasmid encoded by the svp operon in Salmonella serotype Typhimurium. The established multiplex assays were successfully tested on 97 isolates, comprising 37 distinct Salmonella serotypes and 12 non-Salmonella strains. The two-step assay correctly detected 19 of 37 Salmonella serotypes and all non-Salmonella strains produced negative results. Of the 19 serotypes detected in the assays, 7 serotypes, including Salmonella serotypes Ohio, Goldcoast, Livingstone, Kedougou, Enteritidis, Kentucky, ACSSuT-type Salmonella serotype Typhimurium DT104 and DT104b, as well as non-ACSSuT-type Salmonella serotype Typhimurium strains, were definitively identified. The developed multiplex real-time SYBR Green I PCR assay represents a more rapid and reliable method for identification of large numbers of Salmonella serotypes prevalent throughout the European Union than assays using phenotypic serotyping methods.     

The development and assessment of a bacteriocin typing method for Klebsiella.

Klebsiellas are generally typed by the method of capsular serotyping but, although this is a reliable method, it is time consuming, requires the production of a large number of antisera and is not generally available. For this reason another method for typing klebsiellas was sought. A bacteriocin typing method involving mitomycin C induction was developed and the cultural conditions giving optimum klebecin production and the best methods of testing the sensitivity of the organisms to klebecins were determined. Of 190 klebsiella strains screened for bacteriocinogeny, only 68 (35.8%) produced klebecin and after calculation of similarity values by computer analysis, a typing set of 15 producers was selected. This typing set allowed over 96% of klebsiella strains to be typed and tests of the reproducibility of the method and the variability of typing patterns in natural populations of klebsiella indicated that results of acceptable accuracy could be obtained, while retaining good discrimination if two or more differences were required between patterns before they were regarded as distinct. A complete set of capsular antisera were prepared, enabling the results obtained from klebecin typing to be compared with those from serotyping. There was generally close agreement between the results from the two typing methods and greater discrimination was obtained between similar strains when the two methods were combined. Klebecin typing and serotyping revealed relationships between strains from five outbreaks of infection, and strains of the same serotype from different hospitals could frequently be distinguished by their klebecin typing patterns.     

人感染猪链球菌病的病原分离与PCR方法的快速检测

目的研究人感染猪链球菌的生物学特征，并建立一种快速、特异且敏感的检测方法。方法将疑似猪链球菌感染患者的血液进行增菌培养，对所分离的病原菌进行染色形态观察、API 32 Strep生化鉴定；同时从该疑似患者血液（抗凝血）中提取DNA为模板，并合成引物检测猪链球菌特异性16SrRNA基因片段、2型猪链球菌特异性荚膜多糖编码基因片段cps2J、溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段mrp、细胞外蛋白因子编码基因片段ef。结果PCR扩增结果证实是猪链球菌2型，而从血液中分离的病原菌，经API 32 Strep生化鉴定，也证实为猪链球菌2型。结论人感染猪链球菌的病原学及PCR检测符合猪链球菌2型，同时该PCR反应体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法。     

结核分枝杆菌耐RFP快速检测的方法研究

目的应用PCR—SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变，评价此方法用于结核分枝杆菌利福平（RFP）耐药性的意义。方法采用PCR—SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果50例耐RFP菌株中有45例PCR—SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别，与药敏试验结果做对比，PCR—SSCP检测敏感性为90％，特异性为100％；12例敏感菌株与H37Rv条带一致，35份肺结核病人痰标本，21份痰PCR扩增阳性，15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别，而且PCR—SSCP28份图谱与H37Rv有差别，阳性率为80％。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行，有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定，并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

肺炎克雷伯菌所致肝脓肿患者的临床特征及毒力基因检测

目的 分析肺炎克雷伯菌肝脓肿(KPLA)患者的临床特征,了解肺炎克雷伯菌毒力基因携带情况,为临床早期诊断和合理治疗提供参考.方法 回顾性分析江苏大学附属医院2017年7月—2019年8月收治的34例脓液培养阳性的细菌性肝脓肿患者的临床资料,分为KPLA组和非肺炎克雷伯菌肝脓肿(NKPLA)组.采用VITEK 2 Com...