日本血吸虫大陆株14—3—3信号转导蛋白epsilon亚型基因的表达及鉴定

目的 构建日本血吸虫大陆株14—3—3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK—Sj14—3—3，并进一步在大肠杆菌中表达和鉴定，为其进一步保护性免疫的研究提供条件。方法根据日本血吸虫14—3—3蛋白的核苷酸序列，设计合成1对引物，以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板。用RT—PCR法合成日本血吸虫大陆株14—3—3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆人pGEM—T载体，经双酶切及PCR鉴定后，再亚克隆人pBK—CMV真核表达质粒，构建重组质粒pBK—sj14—3—3，转染到大肠杆菌BL21，双酶切鉴定后，通过IPTG的诱导在大肠杆菌BL21中进行表达及Western—blot鉴定。结果 RT—PCR产物、pGEM—T—Sj14—3—3及pBK—Sj14—3—3分别经双酶切均获得一特异性基因片段，其表达产物经SDS-PAGE及Western-blot鉴定后其分子质量为32ku，并能被抗14—3—3多克隆抗体识别。结论 真核表达重组质粒pBK—Sj14—3—3在大肠杆菌中的表达产物是一分子质量为32ku融合蛋白，并能被抗14—3—3多克隆抗体识别。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号转导蛋白epsilon亚型基因[Parasitol1]真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK一Sj14—3—3，为进一步对重组蛋白的融合表达及保护性免疫的研究提供条件。方法 根据日本血吸虫14—3—3蛋白的核苷酸序列。设计合成一对引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板，用RT-PCR法合成日本血吸虫中国大陆株14-3—3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM—T载体，经双酶切及PCR鉴定后，再亚克隆入pBK—CMV真核表达质粒，构建重组质粒pBK-Sj14—3—3，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果 RT-PCR产物、pGEM—T-Sj14—3—3及pBK-Sj14—3—3分别经双酶切均获得一特异性基因片段．经测序分析后该片段具有一个753bp完整开放阅读框(open reading frame，ORF)，由此推导的氨基酸序列具有多种蛋白激酶的磷酸化位点。结论 成功地构建了日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒。并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析。     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14—3—3编码基因重组质粒pET28a一Sj14—3—3的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3编码基因原核表达质粒pET28a-Sj14-3-3,测定Sj14-3-3基因序列,并为中国大陆株Sj14-3-3的体外表达奠定基础。方法采用RT-PCR技术从日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA中扩增出Sj14-3-3基因,扩增产物经纯化后。用BamH I Xho I双酶切,定向克隆入pET28a质粒,转化大肠杆菌DH5a,再用BamH I Xho I双酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用在线软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 PCR扩增产物约为765bp,符合预计大小,并成功地定向克隆到原核表达质粒pET28a,对插入片段的测序结果表明,该序列和推测的氨基酸序列与GenBank收录的日本血吸虫14-3-3基因分别有99.5％和99.2％的同源性。序列分析显示,Sj14-3-3基因序列中可能有抗原表位存在。结论 pET28a-Sj14-3-3重组质粒构建成功,为日本血吸虫5j14-3-3分子疫苗及信号转导研究奠定基础。     

两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达

目的　在原核细胞中表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3的融合蛋白。　方法　 RT- PCR法从日本血吸虫成虫总 RNA中扩增出 Sj14- 3- 3基因 ,亚克隆至原核表达载体 p GEX- 4T- 1,并转化 E.coli BL2 1 ,IPTG诱导表达 ,Western- blot鉴定表达产物。　结果　扩增产物约为 76 5 bp,重组质粒经 Bam H 和 Xho 双酶切后可得到一与 PCR产物大小相同的 DNA片段 ,经 IPTG诱导后在 5 5 ku附近出现一新增蛋白条带 ,Western- blot结果显示 ,表达产物可被兔抗鼠 14- 3- 3ε多克隆抗体识别。　结论　在原核细胞融合表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3成功。     

日本血吸虫信号转导分子14-3-3蛋白epsilon亚型基因的克隆与序列分析

目的：克隆日本血吸虫14－3－3蛋白epsilon亚型的编码基因，以研究其在血吸虫信号传导及其在免疫预防的作用。方法：以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链，设计合成引物,用PCR法扩增14－3－3蛋白epsilon亚型基因编码序列，将其克隆人pGEM-T载体，并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定。结果：RT－PCR扩增出一条约753bp大小的特异性条带，重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT－PCR扩增出大小相同条带，序列测定结果表明其具有753bp的开放阅读框，并具蛋白激酶、酪氨酸激酶磷酸化位点。结论：成功构建了日本血吸虫14－3－3蛋白epsilon亚型重组pGEM-T克隆载体，为进一步的研究提供了条件。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

了本血吸虫CuZn-SOD基因全长cDNA的识别及真核表达载体的构建

目的 识别日本血吸虫大陆株铜锌超氧化物歧化酶(Sj CuZn-SOD)基因，构建Sj CuZn-SOD的真核表达载体。方法 将曼氏血吸虫(Sm)的CuZn-SOD全长cDNA序列上网比对，寻找Sj相关EST。设计特异性引物从尾蚴cDNA文库扩增相应序列，经双酶切、连接、转化，克隆入pcDNA3.0真核表达质粒，并鉴定阳性克隆。结果 找到Sj相关EST(登录号BU794891)，核酸阅读框(ORF)分析和BLAST比对分析等方法判断为Sj CuZn-SOD完整的cDNA编码序列，含462 bp完整阅读框，编码154aa。经单双酶切、PCR扩增、核酸测序鉴定，验证成功构建了pcDNA 3．0-SOD真核重组表达载体。结论 成功构建真核重组表达载体pcDNA3．0-SOD，为在真核表达系统研究Sj CuZn-SOD基因功能奠定了基础。     

两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达

目的 在原核细胞中表达SjGST和Sj14-3-3的融合蛋白。方法 RT－PCR法从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出Sj14-3-3基因，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，并转化E.coli BL21,IPTG诱导表达，Western-blot鉴定表达产物。结果 扩增产物约为765bp，重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后可得到一与PCR产物大小相同的DNA片段，经IPTG诱导后在55ku附近出现一新增蛋白条带，Western-blot结果显示，表达产物可被免抗鼠14－3－3ε多克隆抗体识别。结论 在原核细胞融合表达SjGST和Sj14-3-3成功。     

日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的为了进一步研究日本血吸虫(中国大陆株)Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识.方法根据曼氏血吸虫Sm1 6基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DH5a菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆.以重组pcDNA3-Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较.结果从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3-Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码¨7氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异.结论成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础.     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 为了进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能，丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因；将Sj16基因定向克隆入pcDNA3，转化感受态DHA5α菌；用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。以重组pcDNA3－Sj16质粒为模板，用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列，应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因，重组质粒中含有Sj16基因，成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3－Sj16；Sj16基因开放读码框有354碱基，编码117氨基酸，N端18个氨基酸可能为信号肽序列；Sj16与Sm16有高度同源性，只存在一个氨基酸的差异。结论 成功克隆了Sj16基因的真核表达载体，并测定、分析了Sj16基因序列，为深入研究Sj16的免疫调节功能，丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3疫苗免疫保护性的观察

目的　研究日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白1433(rSj1433)作为血吸虫病疫苗分子的潜能,并探讨rSj1433、rSjGST两种重组蛋白作为疫苗的协同作用及结核杆菌低分子量耐热多肽(Mtb)激活的γδT细胞在抗血吸虫病中的作用。　方法　用SDSPAGE、电洗脱和透析的方法制备rSj1433和rSjGST抗原,将两种抗原(分别用福氏佐剂和Mtb为佐剂)分别免疫BALB/c小鼠后,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6wk后,剖杀小鼠计算各组的减虫率。　结果　各组的减虫率为rSj1433+福氏佐剂组32.20%,rSj1433+rSjGST+福氏佐剂组31.10%,rSj1433+Mtb佐剂组27.96%,rSj1433+rSjGST+Mtb佐剂组26.00%,rSjGST+Mtb佐剂组27.10%;各组的减卵率分别为(按以上组序)50.40%、53.30%、51.10%、58.60%和51.30%。　结论　rSj1433具有一定的抗血吸虫潜能,有可能成为抗日本血吸虫疫苗,但未见rSj1433和rSjGST的协同作用;Mtb激活扩增的γδT细胞在抗血吸虫免疫中的效果与福氏佐剂产生的免疫作用类似。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

Discovery and structural characterization of a small molecule 14-3-3 protein-protein interaction inhibitor

The 14-3-3 family of phosphoserine/threonine-recognition proteins engage multiple nodes in signaling networks that control diverse physiological and pathophysiological functions and have emerged as promising therapeutic targets for such diseases as cancer and neurodegenerative disorders. Thus, small molecule modulators of 14-3-3 are much needed agents for chemical biology investigations and therapeutic development. To analyze 14-3-3 function and modulate its activity, we conducted a chemical screen and identified 4-[(2Z)-2-[4-formyl-6-methyl-5-oxo-3-(phosphonatooxymethyl)pyridin-2-ylidene]hydrazinyl]benzoate as a 14-3-3 inhibitor, which we termed FOBISIN (FOurteen-three-three BInding Small molecule INhibitor) 101. FOBISIN101 effectively blocked the binding of 14-3-3 with Raf-1 and proline-rich AKT substrate, 40 kD(a) and neutralized the ability of 14-3-3 to activate exoenzyme S ADP-ribosyltransferase. To provide a mechanistic basis for 14-3-3 inhibition, the crystal structure of 14-3-3ζ in complex with FOBISIN101 was solved. Unexpectedly, the double bond linking the pyridoxal-phosphate and benzoate moieties was reduced by X-rays to create a covalent linkage of the pyridoxal-phosphate moiety to lysine 120 in the binding groove of 14-3-3, leading to persistent 14-3-3 inactivation. We suggest that FOBISIN101-like molecules could be developed as an entirely unique class of 14-3-3 inhibitors, which may serve as radiation-triggered therapeutic agents for the treatment of 14-3-3-mediated diseases, such as cancer.     

Association of 14-3-3 Proteins with Centrosomes

ABSTRACT: The 14-3-3 proteins are involved in diverse signal transduction pathways and interact physically with a wide variety of proteins. Here, we report the partial sequence analysis of a human spleen 14-3-3 protein, which was identified as a variant form of the ? isoform. A peptide antibody generated to the variant 14-3-3 localizes in the centrosome and spindle apparatus of mouse leukemic FDCP cells by immunofluorescence microscopy. Immunoblots of centrosomes isolated by sucrose density gradient centrifugation of cell lysates disclose only the ? and γ isoforms, while total cellular lysates contain the ?, γ, β and ζ isoforms of 14-3-3. These data suggest that a subset of total cellular 14-3-3 proteins are localized in the centrosomes and spindle apparatus. A differential localization of the centrosomal 14-3-3 was observed in mouse 3T3 cells. Serum-starved (quiescent) cells lack the centrosomal 14-3-3, but upon serum-stimulation of these quiescent cells, the centrosomal 14-3-3 reappears. We propose that a subset of intracellular 14-3-3 proteins are localized in the centrosome and spindle apparatus, and may in fact, link mitogenic signaling, the cell cycle, and perhaps the centrosome duplication cycle as well.     

日本血吸虫Sj14-3-3疫苗研究进展

日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一类严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,研制疫苗防治该病是目前的研究热点.Sj14-3-3蛋白是一种有效的疫苗分子,该文就Sj14-3-3蛋白疫苗和核酸疫苗的研究进展进行综述.     

14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义

目的:研究14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义。方法:实验用SD新生大鼠(1～3d龄),雌雄不拘,无菌取出乳鼠心脏,经分离附着组织,胰蛋白酶消化,纯化制成心肌细胞。在培养的第4天随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(APC)组。各组分别进行以下指标观察:①心肌细胞搏动频率;②细胞存活率(MTT法);③培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;④透射电镜观察细胞超微结构;⑤Western Blotting法检测14-3-3蛋白的表达变化。RT-PCR法检测14-3-3蛋白η、σmRNA的表达变化。结果:A/R组和APC组的14-3-3蛋白表达均上调,分别是正常对照组的(3.61±0.37)倍和(5.52±0.49)倍,A/R组和APC组与正常对照组比较、A/R组与APC组比较,均P<0.01。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3η亚型mRNA分别为正常对照组的(1.82±0.30)倍、(2.93±0.52)倍,差异均有统计学意义(P<0.01);APC组与A/R组比较,差异亦有统计学意义(P<0.01)。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3σ亚型mRNA表达量分别为正常对照组的...     

肝癌组织中14-3-3基因差异表达的意义

目的:检测肝癌组织中,4-3-3基因家族成员表达差异的临床意义.方法:用TRIzol一步法提取肝癌组织、硬化肝组织及正常肝组织的总RNA并纯化mRNA.逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针与含有14-3-3基因家族成员的基因芯片杂交,用GenePix Pro3.0图像分析软件分析不同病变肝组织中该基因家族成员的表达差异,行半定量RT-PCR对结果进行验证并探讨差异表达基因的临床意义.结果:在肝癌组织中14-3-3基因家族成员呈差异表达,其中14-3-3γ在肝癌组织中明显下调,与肿瘤包膜的完整性相关.14-3-3η在肝癌组织中明显上调,与肿瘤患者的临床分期相关.14-3-3γ与14-3-3ηmRNA的表达强度呈负相关(γ=-0.403,P<0.05).结论:14-3-3基因家族调控机制的紊乱参与肝癌的发生、发展,其中14-3-3γ和14-3-3η与肝癌的关系最为密切.     

日本血吸虫14-3-3抗原编码基因的扩增和克隆

目的克隆日本血吸虫14-3-3抗原的编码基因,以研究其用于血吸虫病免疫诊断和免疫预防效果.方法以日本血吸虫成虫RAN为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增14-3-3抗原基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定.结果RT-PCR扩增出一条约780bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT-PCR扩增出大小相同带.结论日本血吸虫14-3-3抗原重组pGEM-T克隆载体的成功构建,为进一步的研究提供了条件.     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的　初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。　方法　用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。　结果　上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。　结论　信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因研究进展

本文介绍了多房棘球绦虫Em14-3-3蛋白，并对Em14-3-3抗原编码基因的研究进展进行了综述。