HDAC2调控MiR199a-3p对大鼠心衰模型中心肌细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨HDAC2调控MiR199a 3p对大鼠心衰模型中心肌细胞凋亡的影响。 方法 选取清洁级健康成年雄性（sprague dawley,SD）大鼠40只,随机分为心衰组（HF组,20只）、假手术组（Sham组,10只）和空白对照组（无任何处理,Blank组,10只）3组。H&E 染色用于心脏大体形态分析;Q PCR方法检测HDAC2、HDAC3、HDAC4、miR199a 3p及其下游基因p53表达水平;western blot方法检测HDAC2及P53蛋白表达水平;染色质免疫共沉淀结合PCR（ChIP PCR）技术检测HDAC2与miR199a-3p启动子结合水平。 结果 与Sham组及Blank组对比,HF组大鼠心肌细胞明显肥厚。HDAC2 mRNA、p53 mRNA水平HF组显著高于Sham组及Blank组（P＜0.05）。miR199 a 3p mRNA水平HF组较Sham组及Blank组明显下降（P＜0.05）。p53 mRNA、HDAC2 mRNA、miR199 a-3p mRNA表达水平Sham组与Blank组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。HDAC3及HDAC4mRNA表达水平在各组间差异均无统计学意义（P＞0.05）,HDAC2蛋白、p53蛋白HF组显著高于Sham组及Blank组（P＜0.05）,Sham组及Blank组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。HF组中HDAC2与miR199a-3p启动子结合水平较Sham组及Blank组明显升高（P＜0.05）,而HDAC3及HDAC4 mRNA水平在各组中无显著差异（P＞0.05）。 结论 大鼠心衰模型中,组蛋白去乙酰化酶HDAC2介导miR199a-3p低表达,进而引起凋亡标志物p53表达上调。     

缺血后适应抑制大鼠脑缺血-再灌注后星形胶质细胞的增生

目的：观察缺血后适应（ ischemia postconditioning,IPostC）对大鼠脑缺血-再灌注损伤后胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein,GFAP）和组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase1,HDAC1）表达变化,初步探讨 IPostC 对星形胶质细胞增生的影响。方法采用线栓法制备大鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型（transient middle cerebral occlusion,tMCAO）模型,采用抽签法将21只健康雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠（体质量280~300 g）随机分为7组,每组3只：①假手术组（S）;② tMCAO 1h 组（R-1h）;③ tMCAO＋IPostC 1h 组（P-1h）;④ tMCAO 4h 组（R-4h）;⑤ tMCAO＋IPostC 4h 组（P-4h）;⑥ tMCAO 24h 组（R-24h）;⑦tMCAO＋IPostC 24h 组（P-24h）。缺血后适应的具体操作是在拔除线栓后即刻用动脉阻断夹夹闭双侧颈总动脉,阻断血流10 s后恢复血流10 s,如此反复操作5次。分别应用 Western blotting 法和免疫荧光法研究大鼠脑缺血-再灌注及后适应1、4和24 h 时HDAC1和 GFAP 表达的变化。结果（1）Western blotting 结果显示：①与 S 组相比,R 组 GFAP 蛋白的表达均有所增加,R-1h 和R-24h 显著增加（P〈0.05）,P 组的表达变化不大。与 R 组相比,P 组 GFAP 的表达下降,其中 P-4h 组显著下降（P〈0.05）。②与 S组相比,R 组 HDAC1蛋白的表达均有所增加,其中 R-1h 显著增加（P〈0.05）,P 组的表达变化不大。与 R 组相比,P 组 HDAC1的表达下降。（2）免疫荧光结果显示：HDAC1和 GFAP 蛋白有共定位,且 HDAC1和 GFAP 的变化趋势同 Western blotting 结果相同。结论 IPostC 可能通过降低 HDAC1的表达来抑制星形胶质细胞的增生从而发挥对脑缺血-再灌注损伤的神经保护作用。     

MIR-138-5p 通过靶向组蛋白去乙酰化酶调节心脏 肥大

目的:探究MIR-138-5p 对心脏肥大的影响及其机制。方法:首先构建体外心脏肥大的模型,HE 染色、α-肌动蛋白染色 和RT-PCR 方法,分别检测模型大鼠心脏的横断面积和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）处理的心肌细胞（H9c2）的表面积和心肌细胞中 MIR-138-5p mRNA 表达情况;MIR-138-5p-mimic 转染AngⅡ处理过的H9c2 细胞,α-肌动蛋白染色和Western 印迹分别检测 心肌细胞的表面积和心肌肥大标志物的蛋白表达水平;采用TargetScan 在线软件筛选miR-138-5p 的潜在靶基因,并进一步验 证。MIR-138-5p-mimic、pcDNA- HDAC4共转染AngⅡ处理过的H9c2 细胞,α-肌动蛋白染色和Western 印迹法分别检测心肌 细胞的表面积和心肌肥大标志物的蛋白表达水平。结果:相对于Sham 组,模型大鼠的心脏体积及心脏横截面均明显增大,心肌 细胞中的MIR-138-5p mRNA 表达水平明显降低（F=21.578,P<0.001）;相对于Con 组,AngⅡ组心肌细胞的表面积明显增大,且 MIR-138-5p mRNA 表达水平明显降低（F=23.790,P<0.001）。相对于AngⅡ+miR-NC 组,AngⅡ+miR-mimic 组心肌细胞的表面 积（F=8.325,P<0.01）、心肌肥大标志蛋白表达水平（F=9.532,P<0.01）和心肌细胞中HDAC4 mRNA表达水平明显降低（F=25.530, P<0.001）; 相对于MIR-138-5p-mimic+pcDNA-Con 组,MIR-138-5p- mimic+pcDNA-HDAC4 组心肌细胞的表面积明显减小 （F=10.134,P<0.01）,心肌肥大标志蛋白表达水平明显升高。结论:MIR-138-5p 通过靶向组蛋白脱乙酰基酶-8（HDAC4） 调节心脏肥大反应。     

靶向CK2α基因的siRNA对结肠癌HCT116细胞生长抑制作用及其机制

目的：探讨RNA干扰酪蛋白激酶2（CK2α）基因表达后对HCT116细胞生长的抑制作用并阐明其作用机制。方法：针对CK2α的mRNA序列设计CK2α-siRNA序列,将体外培养的HCT116细胞分为正常对照组(未转染)、阴性对照组(转染siRNA)和CK2α-siRNA组(转染CK2α-siRNA),应用Lipofectamine 2000进行转染,利用Western blotting 法检测CK2α、cyclin H、P53和P21蛋白表达水平;应用MTT法检测各组HCT116细胞增殖;采用流式细胞术检测细胞周期时相的分布。结果：与阴性对照组比较,CK2α-siRNA组CK2α和细胞周期蛋白cyclin H的表达水平明显降低（P<0.01）,P53蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,P21蛋白表达水平则明显升高（
P<0.01）;MTT检测,与阴性对照组比较,转染48和72 h,CK2α-siRNA组细胞存活率明显降低（P<0.01）;流式细胞术分析,与阴性对照组比较,CK2α-siRNA组S期细胞所占比例逐渐减少（P<0.01）,G1期细胞则明显增加（P<0.01）,细胞滞留在G1期。结论：RNA干扰CK2α表达能够抑制HCT116细胞增殖,发生G1期阻滞;其机制可能与RNA干扰CK2α表达后cyclin H表达下调及P53活性恢复有关。     

缺氧诱导因子-1α基因沉默逆转卵巢癌细胞SKOV3/DDP耐药性的机制

目的：观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)沉默后人卵巢癌细胞顺铂耐药株SKOV3/DDP 的HIF-1α、多药耐药基因1 （MDR1）和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）mRNA及蛋白产物的表达,探讨HIF-1α逆转SKOV3/DDP耐药性的机制。方法：体外培养卵巢癌细胞株SKOV3（敏感组）及其顺铂耐药株SKOV3/DDP（耐药组）,部分耐药株转染HIF-1α干扰质粒 pshRNA-HIF（转染组）及对照质粒pshRNA-Control（对照组）。RT-PCR法检测各组细胞HIF-1α、MDR1和Bcl-2 mRNA表达量;Western blotting和免疫组织化学法测定HIF-1α、P-gp（MDR1基因编码蛋白）和Bcl-2蛋白的表达量。结果：RT-PCR检测,敏感组和转染组HIF-1α、MDR1和Bcl-2 mRNA表达量明显低于耐药组（P<0.05)。Western blotting检测,敏感组和转染组HIF-1α、MDR1和Bcl-2蛋白表达量明显低于耐药组(P<0.05) ;免疫组织化学法,敏感组和转染组HIF-1α、MDR1和Bcl-2蛋白表达量明显低于耐药组(P<0.05);MDR1、Bcl-2 mRNA及蛋白在敏感组与转染组的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。HIF-1α表达与MDR1、Bcl-2 mRNA表达量均呈正相关关系（r=0.908,P=0;r=0.916,P=0);HIF-1α表达与P-gp、Bcl-2蛋白表达呈正相关关系(r=0.773,P=0.003;r=0.862,P=0）。结论：HIF-1α沉默逆转人卵巢癌细胞顺铂耐药株SOV3/DDP耐药性可能与MDR1和Bcl-2表达降低有关联。
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慢病毒载体介导的 RNA干扰对 HDAC2基因表达的影响

目的：构建组蛋白去乙酰化酶2（ HDAC2）基因的慢病毒表达载体,研究HDAC2基因在肝癌HepG2细胞中的表达。方法：将前期构建并鉴定正确的3条重组表达质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组、2组、3组及1条阴性对照pLKO.1-HDAC2-shRNAneg和空载体对照pLKO.1,运用脂质体法分别与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2. G共同转染人胚肾细胞293T,制备具有感染能力慢病毒颗粒;收集、纯化含病毒颗粒的上清液并感染人肝癌HepG2细胞,设未处理HepG2细胞为空白对照,采用Real time PCR 和Western blotting检测感染48 h和72 h后HepG2细胞中HDAC2基因mRNA和蛋白表达水平,鉴定、分析重组质粒的干扰效果。结果：与空白对照组相比,3条干扰序列转染肝癌HepG2细胞后均能明显抑制HDAC2 mRNA的表达（ P＜0.05）,其中以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组的抑制率更明显,达到82.09％;3条干扰序列均能明显抑制HDAC2蛋白的表达（ P＜0.05）,以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组和3组的干扰效果最明显,但两者相比较差异无统计学意义（ P＞0.05）。结论：构建的重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA能从转录水平和蛋白水平有效抑制HDAC2基因在HepG2细胞中表达。     

紫草素通过抑制PKM2/PHD3/HIF-1α通路诱导肝癌细胞凋亡

目的 探讨紫草素诱导人肝癌细胞SMMC-7721死亡的可能机制。方法 体外培养人肝癌细胞（SMMC-7721）和正常肝细胞（L-02）,实验分为对照组和紫草素给药组（4、8、16μmol/L）。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,MTT法检测细胞活力,试剂盒检测三磷酸腺苷（ATP）和乳酸水平,免疫共沉淀和免疫荧光双染实验明确M2型丙酮酸激酶（PKM2）、脯氨酰酸羟化酶3(PHD3)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)三者之间的作用关系及蛋白表达情况;Annexin V/PI检测细胞凋亡;Western blot观察PKM2、PHD3、HIF-1α及凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2表达水平;采用小干扰核糖核酸（siRNA）干扰法建立PKM2低表达的人肝癌SMMC-7721细胞,Western blot检测PKM2低表达对人肝癌SMMC-7721细胞中的PHD3、HIF-1α蛋白表达水平的影响。结果 紫草素对SMMC-7721和L-02细胞的半抑制浓度（IC50）分别是8.0...     

HDAC1基因小干扰RNA对人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞放射敏感性影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)抑制组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)表达对人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞放射治疗敏感性的作用及可能机制。方法体外合成针对HDAC1基因的siRNA,脂质体法转染人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞,应用蛋白印迹法检测细胞HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4的表达,应用实时定量聚合酶链反应方法检测HDAC1基因、核因子-κB(NF-κB)基因和p53蛋白调控的凋亡调控因子(PUMA)基因mRNA表达。应用6 MV直线加速器,以0、2、4、6、8 Gy不同剂量X线照射细胞,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及克隆形成实验检测细胞放射敏感性。结果人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞经转染HDAC1基因siRNA后,正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组HDAC1基因mRNA表达分别为10.21±0.42、9.48±0.41和4.92±0.41;蛋白表达分别为0.81±0.14、0.79±0.16和0.42±0.18,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05);正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组乙酰化组蛋白H4表达分别为0.76±0.21、0.75±0.20和0.30±0.19,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组乙酰化组蛋白H4表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组细胞NF-κB基因mRNA表达分别为6.24±0.52、6.31±0.61和4.22±0.56,PUMA基因mRNA表达分别为3.84±0.26、3.69±0.29和5.42±0.31,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞NF-κB基因mRNA降低,PUMA基因mRNA表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。经X线照射后,正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组凋亡率分别为(16.25±2.64)%、(15.41±2.97)%和(29.62±3.11)%,存活分数(SF2)值分别为0.576±0.149、0.564±0.142和0.226±0.151,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞凋亡率增加,SF2值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HDAC1基因siRNA能够增强人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞对放射线损伤的敏感性。抑制人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞HDAC1基因表达,增加乙酰化组蛋白H4表达,下调NF-κB基因表达和上调PUMA基因表达可能是其作用机制。     

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

目的：探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。方法构建重组慢病毒 pGCLV- CDK2AP1- shRNA及重组空病毒pGCLV- GFP,分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7,获得乳腺癌细胞株 MCF-7/RNAi- NC 和 MCF-7/RNAi- CDK2AP1。采用定量 PCR 法检测两组 MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达,xCELLigence/RT- CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力,Transwel 实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi- NC和MCF-7/RNAi- CDK2AP1,相比MCF-7/RNAi- NC细胞组,MCF-7/RNAi- CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制,其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。结论乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。     

人结肠癌细胞中组蛋白乙酰化对细胞周期调节基因表达的影响

目的 研究组蛋白乙酰化对Colo-320和SW1116人结肠癌细胞系p21^WAF1和p16^INKRA基因表达的影响。方法 培养人结肠癌细胞系SW1116和Colo-320,分别以去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-dC)和／或组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素(TSA)及丁酸钠(NaBu)干预细胞。运用流式细胞术检测细胞周期变化;以定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法研究控制细胞周期的基因p21^WAF1和p16^INKRA的表达;染色质免疫沉淀技术分析基因相关染色质乙酰化组蛋白的水平。结果 TSA或NaBu使人结肠癌细胞阻滞于G1期,而5-aza-dC并不能改变细胞周期。正常情况下,SW1116和Colo-320细胞中均有较弱的p16^INKRA表达;两种结肠癌细胞系p21^WAF1表达缺如。5-aza-dC干预后,p16^INKRA表达增强,相反p21^WAF1仍无明显表达。当该两个细胞系经TSA或NaBu处理后,p21^WAF1转录水平明显上调,并诱导p21^WAF1基因相关染色质乙酰化组蛋白H3和H4的积聚。结论 两种人结肠癌细胞系中,HDAC抑制剂通过选择性增加p21^WAF1基因相关染色质乙酰化水平,上调p21^WAF1基因的转录,并相应地导致结肠癌细胞生长停滞;而p16^INKRA基因表达主要受甲基化调节。     

CXCL2、HIF-1α在前列腺癌组织中的表达及意义

探讨CXCL2和HIF-1α在前列腺癌(prostatic cancer,PC)组织中的表达,分析其与前列腺癌临床病理特征的关系。方法对112例前列腺标本[PC(PC组)76例,前列腺上皮内瘤(prostatic intraepithelial neoplasia,PIN;PIN组)15例,良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH;BPH组)21例]行免疫组化SP法检测CX-CL2和HIF-1α的表达。结果 PC组、PIN组CXCL2、HIF-1α阳性表达率均显著高于BPH组,差异均有统计学意义(均P<0.01);PC组CXCL2、HIF-1α阳性表达率显著高于PIN组,差异有统计学意义(P<0.01)。高分化组CXCL2、HIF-1α阳性表达率显著低于中分化组,差异有统计学意义(P<0.05);高分化组、中分化组CXCL2、HIF-1α阳性表达率均显著低于低分化组,差异有统计学意义(均P<0.01)。A期组、B期组CXCL2阳性表达率均显著低于C期组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),A期组、B期组、C期组CXCL2阳性表达率均显著低于D期组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。A期组、B期组、C期组HIF-1α阳性表达率均显著低于D期组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),A期组HIF-1α阳性表达率显著低于B期组、C期组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),B期组HIF-1α阳性表达率显著低于C期组,差异有统计学意义(P<0.05)。PC转移组CXCL2、HIF-1α阳性表达率均显著高于PC无转移组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。PC中CXCL2表达与HIF-1α表达呈正相关(r=0.422,P<0.01)。结论 CXCL2、HIF-1α在PC组织中呈高表达。CXCL2、HIF-1α表达与前列腺癌病理分级、临床分期、淋巴结转移等有关。但CXCL2和HIF-1α在PC发生、发展中的作用机制还有待进一步的研究。     

PGC1α 对心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制

目的： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha,PGC1α)控制线粒体的生物发生,然而其在心血管疾病中的作用并不清楚。本研究旨在探究 PGC1α 对心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤的作用及其机制。方法： 通过结扎SD大鼠冠状动脉30 min 后复灌2 h 制作心肌I/R 模型。采用氯化三苯四唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法测算心肌梗死面积,免疫 组织化学和蛋白质印迹法检测心肌中PGC1α 的表达。对大鼠心肌细胞H9C2 进行缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/ R),敲低PGC1α 或缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因表达,上调PGC1α 基因表达,加入二甲 双胍等处理,采用蛋白质印迹法检测PGC1α,HIF-1α,p21,BAX和caspase-3 的蛋白质表达水平;CCK-8 检测细胞 的活力;流式细胞仪检测细胞凋亡情况及线粒体超氧化物释放量;定量RT-PCR(RT-qPCR)检测PGC1α 和HIF-1α mRNA表达水平;染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)-qPCR 和荧光素酶报告基因实验检测HIF- 1α 对PGC1α 的转录调控作用。结果： 大鼠梗死心肌中PGC1α 的蛋白质表达水平上调。对H9C2 细胞进行H/R 处理 后,细胞凋亡率上升(P<0.001),线粒体超氧化物释放量增加(P<0.001),PGC1α 和凋亡相关基因(p21,BAX,caspase- 3)的蛋白质表达水平均上调;而敲低PGC1α 表达后,细胞凋亡率下降(P<0.01)、线粒体超氧化物释放量减少(P< 0.001),凋亡相关基因的蛋白质表达水平均下调。HIF-1α 结合在PGC1α 的启动子区域。敲低HIF-1α 抑制PGC1α 的转 录和蛋白质表达,细胞凋亡率下降(P<0.001),线粒体超氧化物释放减少(P<0.01);而上调PGC1α 的表达逆转敲低 HIF-1α 导致的上述影响(均P<0.001)。二甲双胍有效减少H/R 导致的细胞凋亡(P=0.013),线粒体超氧化物的释放(P< 0.001),HIF-1α,PGC1α 以及凋亡相关基因的表达,恢复细胞活力(P<0.001),减少大鼠I/R 导致的心肌梗死面积(P= 0.003)。结论： 心肌I/R 后,HIF-1α 上调PGC1α 的表达,导致ROS的产生增加,损伤心肌;二甲双胍可抑制HIF-1α 在缺氧时的积累,有效保护心肌免受I/R损伤。     

人肝素酶RNAi序列的筛选及鉴定

目的 筛选及鉴定有效人肝素酶(heparanase, Hpa)RNA干扰(RNA interference)序列.方法 通过在线网络软件选择3个Hpa RNAi的靶点,再设计1组无关序列作阴性对照.通过基因重组技术,把3个干扰片段及阴性对照片段分别克隆入质粒pGenesile-1,脂质体法稳定转染至HepG2肝癌细胞;经G418抗性筛选后各挑选2个阳性克隆进行扩大培养;Western blot检测不同克隆肝素酶蛋白的表达水平,并进一步采用RT-PCR验证筛选克隆肝素酶mRNA的表达水平.结果 通过在线网络软件设计3个RNA干扰序列,分别为Hpa/RNAi-1:GGCTATCTCTTCTGTTCAA,Hpa/RNAi-2:TCCTGTCCGTCACCATTGA,Hpa/RNAi-3:CTCAGTTGCTCCTGGACTA及阴性对照序列Hpa/RNAi-N : CTACCGTTGTATAGGTGT;测序证实克隆入pGenesil-1载体的3个干扰序列及阴性对照序列与设计序列完全一致;经G418抗性筛选后形成的阳性克隆采用Western blot检测其肝素酶蛋白的表达,结果表明3个干扰序列对HepG2细胞人肝素酶蛋白的表达均有抑制作用,其中Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3干扰链的抑制效果最好,分别达到57%和71%;RT-PCR检测结果亦表明Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3序列在mRNA水平对肝素酶有较好的抑制效果.结论 成功筛选出有效的人肝素酶RANi序列.     

低氧诱导因子-1αsiRNA对HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的:观察低氧诱导因子-1α( hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)RNA干扰对低氧条件下永生化角质形成细胞株HaCaT细胞HIF-1α和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响.方法:将HaCaT细胞分为4组:常氧对照组...     

曲古霉素A对肺腺癌细胞NCI-H1299增殖抑制作用及机制

目的观察组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase）抑制剂曲古霉素A（trichostatin A,TSA）对体外培养肺腺癌NCI-H1299细胞生长情况及相关基因表达的影响,并探讨其可能的作用机制。方法MTT法检测不同浓度（0.1、0.2、0.4、2.0μmol/L）的TSA对人肺腺癌NCI-H1299生长的影响,流式细胞术检测处理后NCI-H1299细胞周期分布及凋亡率的变化;Western印迹法检测处理后人肺腺癌NCI-H1299组蛋白H4乙酰化水平的变化;Real-TimePCR检测处理后人肺腺癌NCI-H1299、p21、cyclin B1、Bcl-2和Bax的表达。结果TSA体外能明显抑制NCI-H1299细胞生长,且抑制作用呈明显的剂量、时间依赖性。0.4μmol/L TSA诱导后,流式细胞术检测示细胞阻滞于G2/M期;TSA可明显提高NCI-H1299组蛋白乙酰化水平,并诱导p21和Bax的mRNA表达和抑制Bcl-2和cyclin B1的mRNA表达。结论TSA可通过诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞而发挥体外抗肺腺癌细胞株作用,其作用机制可能涉及组蛋白乙酰化水平以及诱导调控相关基因p21、Bax、Bcl-2和cyclin B1。     

SULT2B1影响小鼠Hepa1-6肝癌细胞的HIF-1α，糖酵解及血管新生

 目的 研究羟基类固醇硫酸基转移酶SULT2B1对小鼠Hepa1-6肝癌细胞HIF-1α、糖酵解及血管新生能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 分别用SULT2B1过表达及干扰载体感染Hepa1-6细胞,采用real-time PCR和Western blot检测过表达/干扰SULT2B1对HIF-1α表达水平的影响,同时检测糖酵解相关基因HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平。CCK-8法检测干扰SULT2B1的肿瘤条件培养基(tumor conditioned medium,TCM)对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3增殖能力的影响,并检测VEGF的mRNA表达水平。建立Hepa1-6细胞裸鼠移植瘤模型,免疫组化染色检测裸鼠瘤组织中CD34的表达水平。结果 过表达/干扰 SULT2B1可分别上调/下调HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平,且干扰SULT2B1可使HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平降低,过表达发生相反的变化(P<0.05)。干扰SULT2B1的TCM可抑制bEnd.3细胞的增殖能力,并降低VEGF的mRNA表达水平(P<0.05)。同时,干扰SULT2B1可降低Hepa1-6细胞移植瘤在裸鼠体内的生长并降低瘤组织中的微血管密度(P<0.05)。结论 干扰SULT2B1可抑制Hepa1-6细胞的糖酵解及血管新生能力,其作用主要与下调HIF-1α、HK Ⅱ、LDH及VEGF的表达水平有关。     

C-myc和HIF-1α蛋白在预测巨块型宫颈鳞癌新辅助化疗疗效中的作用

目的：研究C-myc和低氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白在巨块型宫颈鳞癌新辅助动脉化疗前后的变化以及与化疗疗效的相关性。方法：选取2007年1月-2012年8月在我院因巨块型（Ib2或IIa2期）宫颈鳞癌行新辅助动脉化疗和宫颈癌根治术的患者,共36例,新辅助动脉化疗方案均为顺铂、5-氟尿嘧啶加丝裂霉素的联合化疗。采用Western blot法检测宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的特异性表达。采用免疫组织化学SP法检测宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的细胞定位以及两种蛋白在化疗前后、化疗有效组和无效组中的表达差异。结果：①巨块型宫颈鳞癌新辅助动脉化疗的总有效率为52.7%。②C-myc和HIF-1α蛋白在化疗后宫颈鳞癌组织中的表达均显著低于化疗前（均P＜0.05）。③化疗前C-myc和HIF-1α蛋白的表达明显相关。④化疗前宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达在化疗有效组中均比化疗无效组中高（均P＜0.05）。结论：巨块型宫颈鳞癌组织中C-myc和HIF-1α蛋白的表达可在新辅助动脉化疗前辅助预测化疗疗效。     

细胞周期关键分子标记物在HPV阳性宫颈癌中的表达

目的 研究人乳头状瘤病毒（HPV）E6、E7作用位点的各种细胞周期蛋白在宫颈癌的表达情况。方法 选择73例HPV16阳性的宫颈鳞癌癌组织标本，其中35例来自澳大利亚，38例来自中国。采用半定量的免疫组化方法检测p53、pRb、p16^INKAA、p21^CIP1/WAF1、p27^KIP1和细胞周期素D1（cyclin D1）的表达情况。结果 两组患者在平均年龄、淋巴结转移、肿瘤细胞分化程度方面的差异无统计学意义，但中国组较澳大利亚组进展期宫颈癌（〉Ⅱa期）患者为多（P=0．007）。澳大利亚组宫颈癌组织p53的阳性表达率及pRb、p21和p27的上调率分别为3％、56％、63％和34％，中国组分别为23％、89％、97％和89％，两组癌组织中上述四种细胞周期蛋白的表达情况差异有统计学意义。p16和cyclin D1的上调率在澳大利亚组分别为97％和3％，在中国组分别为和100％和12％，两组比较差异无统计学意义。两组资料合并，p53总的阳性表达率为13％，pRb、p16、N1、p27和cyclin D1总的上调率分别为74％、99％、81％、63％和7％。结论 HPV16阳性的宫颈癌明显存在pRb、p16、p21和p27的过度表达，而中国组宫颈癌p53阳性表达率和pRb、p21、p27的过度表达率比澳大利亚组明显增高，这提示HPV诱导宫颈癌的分子学途径复杂，有必要在不同人种进行进一步研究。