新生兔与成兔角膜缘上皮移植于纤维蛋白胶载体的实验研究

目的：利用组织工程技术体外重建角膜上皮组织，为重建角膜表面提供良好的移植材料和方法．方法：以等量凝血酶和纤维蛋白原作用生成的纤维蛋白胶为载体，分别种植新生兔和成兔角膜缘组织块．体外培养重建角膜上皮层．观察两组细胞的生长覆盖面积，t检验比较两组细胞的生长差异，并从生长特性、形态学特点及免疫细胞化学方面进行观察检测和比较。结果：两组兔角膜缘上皮细胞在纤维蛋白胶上黏附生长增殖，生长覆盖面积差异无统计学意义。体外培养7天左右即能较好地形成单层上皮细胞，2周左右形成的复层上皮细胞与纤维蛋白胶构成角膜上皮组织经检测与生理状态下的角膜上皮组织相近．结论：以纤维蛋白胶为载体、新生兔和成兔体外培养的角膜上皮组织片有些可作为眼表重建角膜上皮移植良好的来源之一。     

胶联羊膜的组织形态、细胞相容性及抗拉力特性研究

目的 研究胶联羊膜的组织形态、体外细胞相容性及抗拉力特性,探讨该材料用于眼表移植的可行性和优越性.方法 使用光镜和扫描电镜观察胶联羊膜的组织形态改变;以单层胶联羊膜为载体行角膜上皮细胞的原代培养,观察细胞生长覆盖面积;在电了万能试验机上测试胶联羊膜的拉伸性能,以单层羊膜和舣层羊膜作对照,得出弹性模量.结果 新制备的胶联羊膜成一整体,羊膜、纤维蛋白胶结构完整、粘合紧密,保存胶联羊膜外观完整,稍薄,但仍粘合紧密,其纤维蛋白胶面结构较模糊;体外培养7 d左有胶联羊膜上即形成单层上皮细胞,第2～7天的细胞生长覆盖面积差异有统计学意义(P<0.05);胶联羊膜的弹性模量小于单、双层羊膜(P<0.01).结论 羊膜和纤维蛋白胶可结合制成胶联羊膜,该材料粘合紧密,镜下形态规则,可作为上皮细胞种植的载体,其柔韧性和可塑性优于单、双层羊膜.     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

以纤维蛋白为基质网架的组织工程角膜上皮的构建

目的：应用组织工程技术以纤维蛋白为基质网架、角膜缘干细胞为种子细胞构建组织工程角膜上皮，为角膜上皮移植提供新的移植材料。方法：将20 g•L^-1的纤维蛋白原溶液和含有10 U•mL^-1凝血酶的催化剂溶液混合构成纤维蛋白基质网架，检测支架材料的一般结构和超微结构；取2 mm×2 mm角膜缘组织，胰蛋白酶消化后移至纤维蛋白胶上培养，观察角膜上皮干细胞的生长情况，2周后进行形态学、超微结构和免疫组织化学观察。结果：纤维蛋白基质网架柔软有伸拉性，孔径70～108 μm，平均三维空孔率为70.4%；扫描电镜下呈多层次网络状；接种36 h后，细胞从组织块边缘迁移，7 d后细胞几乎铺满整个培养板孔底，14 d左右细胞与纤维蛋白胶体形成复合植片。透射电镜下观察仍维持上皮细胞特有的超微结构特征。抗细胞角蛋白K3单克隆抗体AE5和抗p63的单克隆抗体4A4免疫组织化学染色均为阳性。 结论：纤维蛋白可作为角膜上皮干细胞移植的良好支架材料，可为组织工程角膜上皮提供新的移植材料。     

兔角膜缘上皮细胞培养联合羊膜行自体移植的实验研究

目的：用体外培养的角膜缘上皮细胞联合人羊膜的方法，行自体移植治疗角膜缘干细胞完全缺乏的兔眼。方法：制作10只兔右眼于细胞缺乏的模型，取其中7只兔的左眼上方角膜缘取一小块组织进行体外培养，并传代在无上皮细胞的人羊膜上。1个月后，手术切除10只兔受伤眼角膜表面被覆的新生血管膜和结膜上皮，7眼接受了含自体培养上皮细胞的羊膜移植，另3眼仅移植无上皮细胞的羊膜。结果：1周后原代培养的角膜缘上皮细胞融合，传代至无上皮细胞的人羊膜上继续生长2～3周，角膜上皮细胞可牢固的附着于羊膜上。移植了含有角膜上皮细胞的羊膜的兔子，术后早期都形成了角膜上皮化，并明显抑制了新生血管的再生，而接受羊膜移植的兔子，术后又出现明显的新生血管。结论：利用无上皮细胞的羊膜作为载体，培养角膜缘上皮细胞并自体移植可以恢复角膜上皮化、抑制新生血管生长。     

角膜缘上皮细胞移植重建眼表的实验研究

目的探讨角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮植片重建眼表的可行性和有效性。方法采用碱烧伤法建立完全性角膜缘干细胞缺陷的SD大鼠动物模型,以羊膜为载体培养人角膜缘上皮细胞,移植重建角膜缘干细胞缺陷眼表,观察术后眼表状态的改变,RT-PCR和免疫组化检测术后10、20、30、45 d及60 d角膜组织CK3/12和P63的表达。结果体外培养的人角膜缘上皮细胞移植术后,完全性角膜缘干细胞缺陷眼表状态较术前和对照组都有不同程度改善;免疫组化和RT-PCR检测表明体外培养角膜缘上皮细胞移植术后角膜组织60 d内P63和CK3/12表达无明显改变。结论以去上皮羊膜为载体,体外培养人角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮植片能够重建完全性角膜缘干细胞缺陷眼表。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的：建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法：应用组织培养的方法,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养,用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征,用苏木精-伊红染色、糖原（PAS）染色,细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果：兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代,原代培养细胞大多48h贴壁,5天后旺盛生长,15天形成单层,传代培养细胞次日贴壁10天形成单层。细胞角蛋白AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性,培养细胞呈多角形,细胞表面具有丰富的微绒毛,细胞之间有桥粒连接,结论：应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性。     

兔口腔黏膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的研究羊膜作为载体种植兔口腔黏膜上皮细胞的可行性及生物学特征，探索眼表重建良好和来源丰富的移植材料和方法。方法将兔口腔黏膜上皮细胞种植于去上皮羊膜基底膜进行体外培养扩增。倒置显微镜观察细胞在羊膜上的动态生长过程，将培养获得的复合上皮片作常规病理切片HE染色和透射电镜观察。采用AE5单克隆抗体鉴定培养组织中有无角蛋白3表达。结果免口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面能黏附生长并增殖，体外培养3周左右即可在羊膜上汇合成片并分层。形成的复合组织由羊膜基底膜和较扁平的2～3层上皮细胞组成，基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接，细胞之间可见桥粒连接，细胞表达角蛋白3。结论兔口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜上体外培养扩增能获得类似于角膜上皮的复层组织，为解决眼表重建供体来源不足的现状带来了新的希望。     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。     

骨髓基质干细胞接种于纤维蛋白凝胶的体外培养

目的：研究经分离培养的免音舱基质子细胞(MSC)接种在可吸收性纤维蛋白凝胶上向成分细胞分化，表型维持的影响。方法：取兔骨髓基质子细胞于含100nl/L胎牛血清的DMEM培养液中培养，并向成管细胞诱导。将细胞与纤维蛋白凝胶复合，通过扫描电镜观察细胞附着情况，共聚焦显微镜观察I型胶原的分泌，组织化学染色检测碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞，ALP含量测定。结果：骨髓基质子细胞在可吸收性纤维蛋白凝胶表面附着良好并继续增殖，可分泌I型胶原，这些细胞的ALP染色呈强阳性，细胞碱性磷酸酶含量增高。结论：具有良好的可塑性、低抗原性、好的降解吸收性的纤维蛋白凝胶具有促进骨髓基质细胞表达成管细胞表型、合成细胞外基质的功能，是良好的细胞载体。     

Biocompatibility Studies on Fibrin Glue Cultured with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro

By culturing bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits with fibrin glue in vitro,the biocompatibility of fibrin glue was investigated to study whether this material can be used as scaffolds in bone tissue engineering. After 2-months old New Zealand rabbits had been anesthetized, about 4--6 ml of bone marrow were aspirated from rabbit femoral trochanter. The monocytes suspension was aspirated after bone marrow was centrifuged with lymphocyte separating medium and cultured primarily. Then the cells were divided into two groups: one was cultured with complete medium and the other with induced medium. The cells of the two groups were collected and inoculated to the culture plate containing fibrin glue. In the control group, cells were inoculated without fibrin glue. The implanted cells and materials were observed at different stages under a phase-contrast microscope and scanning electron microscope. MTT and alkaline phosphatase (ALP) were measured. Bone marrow mesenchymal stem cells grew on the surface of fibrin glue and adhered to it gradually. Cells light absorption value (A value) and the ALP content showed no significant difference. Fibrin glue had no inhibitory effect on cell morphology, growth, proliferation and differentiation. It has good biocompatibility and can be used as scaffold materials for bone marrow mesenchvmal stem cells in bone tissue engineering.     

筛选适宜于构建工程化肝组织的凝胶材料支架

目的使用不同可注射性凝胶支架体外进行新生大鼠肝细胞立体培养,为后期体内植入筛选相容性较好的支架材料。方法使用胰酶冷消化法分离新生大鼠肝细胞。将肝细胞分别与纤维蛋白胶、壳聚糖凝胶、鼠尾胶原、透明质酸钠支架材料复合,形成工程化肝组织凝胶,接种于培养板中,并通过定期光镜来观察大鼠肝细胞,四唑盐（MTT）比色法评价细胞活性。溴甲酚绿法测上清白蛋白含量,脲酶比色法测定上清尿素含量。结果四组均可形成三维生长的工程化类肝样组织。培养第4天,生物蛋白胶及壳聚糖组的培养上清液中尿素含量达到高峰,分别为培养第1天的1.31倍和1.28倍,随后含量缓慢下降。培养第7天,新生大鼠肝细胞在纤维蛋白凝胶及壳聚糖凝胶中密集生长,同时MTT显示细胞活性及白蛋白分泌达到高峰,OD值分别为培养初期的1.11倍和1.17倍,上清白蛋白含量分别是初期的1.13倍和1.15倍。而在透明质酸钠及鼠尾胶原凝胶中则细胞生长缓慢,白蛋白及尿素含量持续下降。结论 4种可注射性支架中,壳聚糖和生物蛋白胶对于新生大鼠肝细胞生物相容性较好,透明质酸和鼠尾胶原较差,前两者更适合用于工程化肝组织的构建。     

兔眼角膜成纤维细胞原代培养

目的:建立眼角膜成纤维细胞体外培养的方法。方法:采用全角膜组织培养法培养兔角膜成纤维细胞。结果:在培养皿中培养1天后细胞开始贴壁,6天有新生细胞分出,形成梭形的成纤维细胞。传代细胞经4-6天可形成密集的成纤维细胞,细胞呈纤维状,呈漩涡形排列,排列整齐,局部细胞相互平行,第4、5代生长情况良好,细胞生长旺盛,细胞呈密集漩涡形排列。结论:眼角膜成纤维细胞全角膜组织培养法是可行的。     

利用皮肤干细胞的横向分化重建角膜上皮的初步研究

目的 观察皮肤干细胞在角膜基质上的分化发育情况,探讨皮肤干细胞重建角膜上皮的可能性。方法 将体外分离培养的1～4代人和兔皮肤干细胞种植在兔角膜基质上,在体外和体内观察皮肤干细胞的分化发育情况。实验标本作HE染色及用人上皮细胞角蛋白K19单克隆抗体和角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12抗体AE5进行免疫组织化学鉴定。结果 皮肤干细胞在角膜基质的调控下可以横向分化发育成表达角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12的细胞,呈现AE5抗体阳性;并可形成类似角膜上皮外观透明的多层细胞结构。结论 利用皮肤干细胞有可能重建角膜上皮,进行自体生物角膜的构建。     

兔角膜上皮——基质层组织工程方法三维重建

目的：利用细胞生物学和工程学原理在体外重建角膜上皮和基质层,提供与正常生理结构相似的模型。方法：兔角膜上皮和基质细胞原代并传代培养,免疫组化方法对细胞进行鉴定,以鼠尾为原料提取I型胶原溶液,重建角膜的基质和上皮,上皮实行气-液界面培养,倒置显微镜观察细胞形态。36h、72h、7d、14d、20d重建组织常规病理切片。结果：倒置显微镜下角膜成纤维细胞呈梭形三维生长,上皮细胞多层生长。组织病理检查显示重建的角膜组织结构类似于天然角膜组织。结论：本实验可为角膜的病理生理、毒理、药理以及基因表达等研究提供有利的模型和工具。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的：建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法，并观察其体外生长的生物学特性。方法：采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养，分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率，MTT比色法测定细胞生长曲线。结果：两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛（P〈0．05）；在16h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法（P〈0．05）。结论：选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

Biocompatibility studies on fibrin glue cultured with bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Summary By culturing bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits with fibrin gluein vitro, the biocompatibility of fibrin glue was investigated to study whether this material can be used as scaffolds in bone tissue engineering. After 2-months old New Zealand rabbits had been anesthetized, about 4–6 ml of bone marrow were aspirated from rabbit femoral trochanter. The monocytes suspension was aspirated after bone marrow was centrifuged with lymphocyte separating medium and cultured primarily. Then the cells were divided into two groups: one was cultured with complete medium and the other with induced medium. The cells of the two groups were collected and inoculated to the culture plate containing fibrin glue. In the control group, cells were inoculated without fibrin glue. The implanted cells and materials were observed at different stages under a phase-contrast microscope and scanning electron microscope. MTT and alkaline phosphatase (ALP) were measured. Bone marrow mesenchymal stem cells grew on the surface of fibrin glue and adhered to it gradually. Cells light absorption value (A value) and the ALP content showed no significant difference. Fibrin glue had no inhibitory effect on cell morphology, growth, proliferation and differentiation. It has good biocompatibility and can be used as scaffold materials for bone marrow mesenchymal stem cells in bone tissue engineering. FANG Huang, male, born in 1962, Associate Professor