异基因造血干细胞移植后慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因水平的动态变化

背景:bcr-abl融合基因不仅是慢性粒细胞白血病的诊断标准,其水平的变化也是判断病情或疗效的惟一指标,尤其是bcr-abl融合基因的动态变化对于异基因造血干细胞移植效果的评估和预后判断可能更为重要.目的:了解慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后bcr-abl融合基因水平的变化情况. 设计:回顾性病例分析.对象:2001-04/2007-01在广东省人民医院血液科收治的确诊1年内行异基因造血干细胞移植的慢性粒细胞白血病患者22例,中位年龄31.5岁,患者对治疗均签署知情同意书,治疗方案经医院医学伦理委员会批准.方法:所有同胞供者均采用粒细胞集落刺激因子行外周血干细胞动员.所有患者均采用改良BU/CY联合FLU预处理方案,供受者血型不相合者于移植前7 d、1 d行血浆置换以降低血型抗体滴度.患者经深静脉输入同胞供者平均单个核细胞数为5.48×108/kg,平均CD34 细胞数为10.45×106/kg.由于移植和随访时间不同,每例患者收集标本3～14份,共130份外周血标本.主要观察指标:通过实时荧光定量PCR法检测22例患者异基因造血干细胞移植后不同时间130份外周血标本中bcr-abl融合基因的水平.结果:移植后6个月内,bcr-abl融合基因总体水平逐渐降低,移植后1、3、6个月bcr-abl阴性患者的比例分别为33.33%、53.33%和84.62%,bcr-abl高水平阳性(bcr-abl/abl ≥ 0.02%)患者的比例分别为58.33%、33.33%和15.38%,低水平阳性(bcr-abl/abl < 0.02%)患者的比例分别为8.33%、13.33%和0.移植6个月后,多数患者连续多次检测不到bcr-abl融合基因,其中持续阴性者9例(69.23%),低水平波动者1例(7.69%),低水平持续阳性者1例(7.69%),复发2例(15.38%);复发的2例患者移植后6个月内连续检测bcr-abl融合基因水平均未降低至0,且3次检测结果中2次属于高水平阳性.结论:异基因造血干细胞移植后,慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因总体水平逐渐下降,但不同患者bcr-abl变化情况各异,通过实时定量PCR检测可明确其变化趋势.     

慢性粒细胞白血病患者胸腺输出功能与bcr-abl mRNA水平的关系

本研究了解慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者体内T细胞受体重排删除环(Tcell receptor rearrangement excision circles,TREC)的含量与bcr-abl mRNA水平的关系,进而明确CML患者的胸腺近期输出功能测定对疾病预后判断的意义.实时定量PCR检测15例CML-CP患者外周血TREC含量及bcr-abl融合基因转录本的水平,并追踪检测6例患者bcr-abl水平的变化.结果发现:在CML初发时患者外周血TREC含量与bcr-abl融合基因水平无明显的相关性;随访2年后,TREC含量高的患者bcr-abl水平下降幅度更大,而在修稿造血干细胞移植的2例患者中,移植前TREC含量相对较高者,移植1年后连续3次均检测不到bcr-abl,另1例则检测到低水平的bcr-abl.结论:CML患者胸腺输出功能较高者,可能对机体抵抗残留CML细胞有一定的帮助.     

慢性粒细胞白血病异基因造血干细胞移植后bcr-abl动态监测对低复发患者筛选的意义

目的 寻找慢性粒细胞自血病(CML)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后早期bcr-abl的动态变化规律,以识别不需要十预的低复发患者.方法 2004年11月至2006年11月在我院接受allo-HSCT的CML患者149例.移植前后采用实时定量PCR方法定期监测骨髓bcr-abl转录本的水平,计算未干预组患者各时间点的bcr-abl中位值,并采用Mann-Whitney U比较同一时间点不同移植模式下的bcr-abl水平.采用Kaplan-Meier曲线计算复发率、生存率和移植物抗宿主病(GVHD)发生率.结果 149例患者2年总生存率为86.0%(CI:82.9%～89.1%),累积血液学复发率为3.5%(CI:1.7%～5.3%).未干预组患者102例,bcr-abl水平中位值:移植前25.800%(0.067%～96.100%),+1个月0.025%(0～3.583%),+2个月0.011%(0～0.425%),+3个月0.002%(0～0.610%),+4个月为0(0～0.056%).本组患者至随访结束无一例复发.未干预组患者HLA配型不合组、配型相合组和非血缘关系移植组分别于移植后3、4和5个月bcr-abl下降至不能检测出其水平.结论 CML患者allo-HSCT后bcr-abl的动态监测有助于筛选出无须干预的CML患者.     

PCR-STR用于异基因造血干细胞移植后的骨髓和外周血嵌合状态的监测及作用

目的用PCR-STR检测观察比较异基因造血干细胞移植术后,骨髓和外周血嵌合状态和植入状态。方法提取17例异基因造血干细胞移植术中的供者外周血及受者移植前后各阶段外周血和骨髓的DNA,PCR PCR-STR检测扩增15个基因位点,和1个性别位点AMEL。用遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式,分析植入情况和嵌合状态。结果12名患者完全植入,骨髓和外周血的PCR-STR结果一致;1名患者骨髓PCR-STR显示为持续未植入,外周血PCR-STR显示为短期混合植入;4名患者骨髓和外周血PCR-STR显示嵌合状态时间不一致,骨髓PCR-STR显示嵌合状态时间明显早于外周血(P<0.05)。结论PCR-STR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法,骨髓嵌合状态的变化的出现早于外周血,混合嵌合状态对白血病复发有预警作用,骨髓嵌合状态的早期变化对实施临床干预治疗尤为重要。     

qPCR检测慢性粒细胞性白血病细胞中BCR-ABL mRNA的表达及其意义

目的探讨实时荧光定量PCR(qPCR)检测BCR-ABL mRNA对慢性粒细胞性白血病(CML)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后体内微小残留病(MRD)的早期预测和监测价值。方法选取2013年1月至2016年1月在深圳市盐田区人民医院、深圳大学医学院及北京大学深圳医院门诊和血液科住院的CML患者67例作为观察组,同期深圳市盐田区人民医院体检健康人群50例为对照组,用qPCR检测CML患者异基因造血干细胞移植前后BCR-ABL mRNA水平。结果对照组健康人群BCR-ABL mRNA检测均为阴性。移植前加速期和急变期的CML患者BCR-ABL mRNA水平高于慢性期,差异有统计学意义(P0.05);移植后,前36个月各时间点qPCR检测的BCR-ABL/ABL比值均较移植前明显下降,差异有统计学意义(P0.05);移植36个月后qPCR仍然能检测出BCR-ABL/ABL的表达水平。结论qPCR方法准确可靠,对于临床诊断CML和MRD的检测具有重要的临床应用价值。     

实时定量RT-PCR监测造血干细胞移植前后CML28 mRNA表达

本研究的目的在于建立检测CML28mRNA的SYBRGreenI实时定量PCR(RQPCR)的方法,并探讨CML28表达水平与异基因造血干细胞移植(AlloHSCT)后白血病复发之间的相关性,为此构建了pcDNA3.1HisACML28质粒作为定量模板,选择14例白血病患者进行研究。14例患者包括:10例慢性髓系白血病(CML),3例急性髓系白血病(AML),1例Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph ALL)。应用RocheLightCyclerPCR仪动态监测患者移植前后不同时间段的50份骨髓单个核细胞中CML28表达水平。研究结果表明:RQPCR的灵敏度为10-4(0.05ng)水平,标准品日间差及日内差均小于10%,重复性好。初治组中AML和CML加速期(CMLAP)与急变期(CMLBC)患者CML28呈高表达(6.58±2.34)×10-2,预处理前组CML28水平为(2.19±0.32)×10-2,移植后1月组CML28水平为(1.35±1.28)×10-2,移植后3月及以后组(以下简称移植后3月组)CML28水平为(4.57±6.39)×10-3。定期随访表明,3例CMLAP或BC患者与1例CML慢性期(CMLCP)患者,在AlloHSCT3个月后检测仍呈阳性,其中2例CML28mRNA的水平<2×10-2,获无病生存;2例CML28水平>2×10-2者,一年内均出现复发,其中1例死亡,另1例行第2次AlloHSCT后CML28水平虽然迅速下降,但仍>2×10-2,2个月后再次复发。结论:CML28水平与疾病的演变过程存在良好的相关性,对于造血干细胞移植受者,动态监测CML28水平比单一的结果价值更大,实时定量检测移植后CML28水平对预测白血病复发有一定的意义。     

实时定量RT-PCR监测慢性粒细胞白血病患者造血干细胞移植后bcr-abl mRNA水平

目的评价实时定量RT—PCR（Q—PCR）技术用于监测慢性粒细胞白血病（CML）患者异基因造血干细胞移植（HSCT）疗效的意义。方法采用基于TaqMan探针的Q—PCR技术检测112例CML患者HSCT后不同时间共316份骨髓标本bcr—abl mRNA的表达。bcr—abl mRNA水平以内参基因abl进行归一化。采用荧光原位杂交法（FISH）评估HSCT后是否达细胞遗传学完全缓解（CCyR）。结果Q-PCR实验可重复敏感度为5个拷贝。abl及bcr—abl基因CT值的批内差及批问差均〈2．0％。HSCT后1个月开始持续处于CCyR状态的101例患者，中位跟踪时问为12（6—60）个月的289份标本表现为HSCT后各时间段均有一定数量患者可检测出bcr-abl mRNA，总体上随着HSCT时间延长，中位水平逐渐降低。HSCT后1个月中位bcr—abl水平为0．035％（0～0．406％），较本室资料初治CML慢性期患者中位水平降低3个对数级，3个月时为0．006％（0～0．683％），6个月开始降至0％（0—0．225％），移植6个月后标本最高bcr—abl水平为0．068％。8例患者HSCT后未达CCyR或遗传学复发时bcr—abl水平为0．12％～13．45％，其中5例患者遗传学复发前的1份标本（复发前1—2个月）bcr—abl水平为0．09％-3．42％。9例持续CCyR患者bcr-abl水平曾经〉0．090％，但随后均下降至0。2例急变期患者HSCT后1．6和3个月内持续CCyR，但分别于1个月和1．5个月后进展为血液学复发，ber—abl水平亦从0及0．140％分别急剧增至46．900％和75．900％。结论Q—PCR技术精确、可靠，对CML患者HSCT后有必要定期系列监测ber—abl水平，以及时了解病情变化。对急变期患者需要更密切的监测。     

荧光原位杂交技术在判断异基因造血干细胞移植预后中的应用

目的研究荧光原位杂交(FISH)技术在判断异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)预后中的意义。方法收集异基因外周血干细胞移植、骨髓移植、脐血移植及多种干细胞联合移植标本63例,收集条件为融合基因(BCR/ABL、AML1/ETO)阳性表达,供受者性别不同或同时满足以上2项条件者,分为同性别间干细胞移植和不同性别间干细胞移植两组:同性别间干细胞移植者20例,应用相应的基因探针进行检测;不同性别间干细胞移植者应用相应的基因探针及XY染色体探针联合检测。结果 43例异性allo-HSCT的受者中,25例供、受者骨髓嵌合率在99%以上;13例早期嵌合率偏低(82%~98%),在随访过程中逐渐上升至99%以上,微量残留病灶(MRD)阴性,移植后原病均未复发;3例嵌合率由99%~100%逐渐下降,MRD比例上升,出现血液学复发。20例供、受者性别相同的allo-HSCT受者中,15例移植后未检测到原来的异常基因;2例检测到微量残留病灶,经免疫抑制剂减量、供者淋巴细胞输注等治疗后降为1%,目前仍在完全缓解中;3例在移植后1~4个月时出现原来的基因异常,复查骨髓为原病复发。结论 FISH技术简便、快速、准确性高、特异性强,对异基因干细胞移植预后判断具有重要意义。     

异基因移植患者进行Id4基因检测的意义初探

[目的]探讨在行异基因外周血干细胞移植的急性白血病(AL)患者中进行Id4基因甲基化检测对预测临床复发意义.[方法]用甲基化特异性PCR(MS-PCR)方法对16例接受异基因外周血干细胞移植的AL患者,检测其移植前、移植后6个月和12个月的骨髓Id4基因甲基化状态,并随诊分析.[结果]10例患者移植前Id4基因呈甲基化的患者中5例在移植后再次出现Id4基因甲基化,其中4例在随访期出现复发或复发倾向.而5例移植前Id4基因呈非甲基化的患者中,无一例在移植后再次甲基化,随访期间也无复发倾向.[结论]AL患者在移植后进行Id4基因甲基化检测对于预测白血病的复发可能有一定意义.     

STR-PCR对造血干细胞移植后植入证据的检测

本研究采用STRPCR检测方法，观察比较15例异基因造血干细胞移植术后患者的植入情况。提取15例异基因造血干细胞移植术患者及其供者移植前的以及患者移植术后的不同时期的外周血或骨髓DNA，PCR扩增5个具有高度多态性的STR位点，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，分析其植入情况。结果表明：15例患者均有不同程度植入，其中完全供者植入10例，供受者混合嵌合体5例。持续缓解10例，死亡4例，1例复发但仍存活。混合嵌合体中供者DNA比例的下降预示着早期排斥或复发。Ⅱ度以下急性移植物抗宿主病的发生与混合嵌合体有明显相关性。结论：STRPCR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法，混合嵌合状态对白血病复发有预警作用。嵌合状态的变化对疾病的治疗有指导作用。     

慢性粒细胞白血病患者胸腺输出功能与bcr-ab1 mRNA水平的关系

本研究了解慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）患者体内T细胞受体重排删除环（T cell receptor rearrangement excision circles，TREC）的含量与bcr-ab1 mRNA水平的关系，进而明确CML患者的胸腺近期输出功能测定对疾病预后判断的意义。实时定量PCR检测15例CML—CP患者外周血TREC含量及bcr-ab1融合基因转录本的水平，并追踪检测6例患者bcr—ab1水平的变化。结果发现：在CML初发时患者外周血TREC含量与bcr—ab1融合基因水平无明显的相关性；随访2年后，TREC含量高的患者bcr—ab1水平下降幅度更大，而在接受造血干细胞移植的2例患者中，移植前TREC含量相对较高者，移植1年后连续3次均检测不到bcr—ab1，另1例则检测到低水平的bcr—ab1。结论：CML患者胸腺输出功能较高者，可能对机体抵抗残留CML细胞有一定的帮助。     

慢性粒细胞白血病错配修复基因的研究

目的 探讨慢性粒细胞白血病（CML）错配修复（MMR）基因的表达水平及调控机制。方法 用半定量RT-PCR方法检测62例CML患者及K562细胞的5个MMR基因（hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS2）mRNA的表达；用RT-PCR方法动态检测26例进行异基因外周血造血干细胞移植（allo-PBSCT）及4例使用伊马替尼治疗的CML患者ber-abl及MMR mRNA的表达水平；用伊马替尼体外作用于CML患者的单个核细胞（MNC）及K562细胞后，用Western blot方法检测BCR—ABL融合蛋白的酪氨酸磷酸化水平，RT-PCR方法检测MMR mRNA表达水平。结果 与正常人比较，CML患者及K562细胞的hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达明显降低（P〈0．05）；26例行allo—PBSCT及4例使用伊马替尼治疗的CML患者，其hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达随着bcr—abl mRNA的表达降低而升高；伊马替尼体外作用于CML患者MNC及K562细胞后，其hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达随着BCR—ABL融合蛋白酪氨酸磷酸化水平的降低而升高。结论 CML患者、K562细胞hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA比正常人降低，bcr—abl融合基因抑制hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达。     

慢性髓系白血病DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因的研究

本研究旨在探讨髓系粒细胞白血病（CML）的DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）基因表达水平、调控机制及其在CML急性变中的作用。用半定量RT-PCR、Western blot方法分别检测62例CML患者及K562细胞的DNA-PKcs mRNA和DNA-PKcs蛋白表达,并与23例正常人作对照;对26例接受同种异基因外周血干细胞移植（allo-PBSCT）及4例使用伊马替尼治疗的CML患者用RT-PCR、Western blot方法分别动态检测bcr-abl mRNA和DNA-PKcs蛋白表达水平;用伊马替尼体外作用CML患者的单个核细胞（MNC）及K562细胞后,用RT-PCR、Western blot方法分别检测DNA-PKcs mRNA和DNA-PKcs蛋白表达及bcr-abl融合蛋白的酪氨酸磷酸化水平。结果表明：与正常人比较,CML患者及K562细胞的DNA-PKcs蛋白表达量明显降低（P〈0.05）;26例allo-PBSCT及4例使用伊马替尼治疗的CML患者,DNA-PKcs蛋白表达量随着bcr-abl mRNA表达量的降低而升高;伊马替尼体外作用于CML患者MNC及K562细胞后,DNA-PKcs蛋白表达量随着bcr-abl融合蛋白酪氨酸磷酸化水平的降低而升高。结论：bcr-abl融合基因通过转录后机制下调DNA-PKcs蛋白的表达;DNA-PKcs蛋白表达下降可能是CML急性变的机制之一。     

EBMT积分在异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病中的预后价值

目的 分析慢性粒细胞白血病(CML)异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗的危险因素,以利于更好地规避移植风险.方法 回顾性研究分析121例接受allo-HSCT的CML患者.预后评估参照EBMT积分,即Gratwohl积分,危险因素包括供者来源、患者年龄、患者移植前疾病状态、供患者性别差异、疾病确诊至移植时间.将患者分为3组:低危组(0～2分)、中危组(3～4分)和高危组(5分).结果 所有患者allo-HSCT后中位随访时间为37(1～126)个月,预期5年总生存(OS)率、无复发死亡(NRM)率及复发(RR)率分别为(56.8 ±5.0)%、(35.6±4.9)%和(12.9±3.7)%.其中低危组患者分别为(66.0±6.1)%、(28.8±6.0)%和(7.8±3.3)%,明显优于中危组[(47.2±8.7)%、(43.6±8.5)%和(18.7±8.1)%]和高危组[(16.8±15.2)%、(66.7±25.5)%和(50.0±25.0)%],差异具有统计学意义(P值分别为0.0015、0.045和0.0053).结论 EBMT危险因素积分系统能全面反映预测allo-HSCT治疗CML的疗效、复发率和移植相关死亡率.

Abstract：

Objective To analyze the risk factors of allogeneic stem cell transplantation (allo-SCT)for chroninc myeloid leukemia (CML) in an attempt to avoid transplant risks. Methods A total of 121 CML patients received allo-SCT were analyzed retrospectively. The risk analysis was based on the EBMT score (gratwohl score) which included donor type, age of patients, disease status before transplantation, donor/recipient sex match and time interval between diagnosis to allo-SCT. Patients were divided into 3 risk groups based on their EBMT score: low risk (score 0-2), inzermediate risk(3- 4 ) and high-risk (5). Results The median follow-up duration was 37(1-126) months. The estimated 5-year overall urvival (5 y-OS),non-relapse mortality (5 y-NRM) and relapse rate (5 y-RR) were (56.8 ±5.0)％, (35.6 ±4.9)％ and ( 12.9 ± 3.7) ％, respectively. The 5y-OS, NRM and RR were ( 66.0 ± 6.1 ) ％, ( 28.8 ± 6.0 ) ％ and ( 7.8 ± 3.3 ) ％ in the low risk group being significantly superior to both intermediate-risk [ (47.2 ± 8.7 ) ％,(43.6±8.5)％and(18.7 ±8.1)％] and high-risk group [(16.8±15.2)％, (66.7 ±25.5)％ and (50.0 ± 25.0) ％ ] (P = 0.0015, 0.045 and 0.0053 for OS, NRM and RR respectively ). Conclusion The EBMT risk score can effectively predict the overall outcome, relapse and transplant-related mortality of allo-SCT for CML patients.     

伊马替尼联合改良的Hyper-CVAD/MA强化方案及异基因造血干细胞移植一线治疗成人Ph阳性急性淋巴细胞白血病的临床研究

目的 探讨采用伊马替尼(IM)联合化疗后第1次完全缓解期(CR1)行异基因造血干细胞移植(allo-SCT)及IM维持治疗成人Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+-ALL)的临床疗效及相关预后因素.方法 2006年3月至2010年12月在我院淋巴肿瘤中心CR1期完成allo-SCT治疗的16例成人Ph+-ALL患者纳入研究.所有患者均以IM联合标准VDCP±L(长春新碱+柔红霉素+环磷酰胺+泼尼松±左旋门冬酰胺酶)方案诱导治疗,缓解后则联合改良HyperCVAD/MA方案强化巩固治疗,并于CR1期行allo-SCT;部分患者移植后给予IM维持治疗.随访至2011年3月31日,分析患者临床基本特征、总生存(OS)率、无病生存(DFS)率、累积复发(RI)率及非复发死亡(NRM)率,并探讨与生存相关的预后因素.结果 16例患者采用IM联合化疗在移植前均维持血液学缓解,其中10例达分子生物学缓解.移植后所有患者均成功植入.中位随访27.1(7.4 ～65.8)个月,14例患者存活,其中2例患者移植后复发经IM挽救均存活,2例非复发死亡.3年预期OS及DFS率分别为(85.9±9.3)％和(83.9±10.5)％,3年RI率及NRM率分别为(16.1±10.5)％和(14.1±9.3)％.生存分析未显示影响移植疗效的预后因素.结论 IM联合化疗及Hyper-CVAD/MA强化治疗可显著提高Ph+-ALL患者的缓解率及缓解质量,使患者在CR1期行allo-SCT的可行性增高.allo-SCT前、后联合IM能减少复发,提高长期OS及DFS率,是治疗成人Ph+-ALL的有效手段.