葡萄酒中酒香酵母实时荧光PCR检测方法的研究

目的建立葡萄酒中酒香酵母实时荧光PCR检测方法。方法将滴度为3.0×10~6cfu/ml、3.0×10~5cfu/ml、3.0×10~4cfu/ml、3.0×10~3cfu/ml、3.0×10~2cfu/ml、30 cfu/ml的1 ml菌液加至45 ml酒样中,离心洗涤后利用碱裂解法提取DNA,进行实时荧光PCR检测,测定检测方法的灵敏度;提取革兰阳性细菌、革兰阴性细菌以及5株葡萄酒中相关菌株(包含1株酒香酵母等效菌株)的DNA,进行实时荧光PCR检测,测定检测方法的特异性。结果该实时荧光PCR方法的定量限为6.67 cfu/ml,检出限为0.67 cfu/ml;该方法对酒香酵母及其等效菌株均可检出,对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌以及其余相关菌株均无交叉反应。结论该实时荧光PCR方法灵敏度高、特异性好,可准确快速地检测出葡萄酒中的酒香酵母菌。     

水中产气荚膜梭菌的荧光定量PCR检测法

目的研究水中产气荚膜梭菌的荧光定量PCR检测方法,缩短水中产气荚膜梭菌的检测时间。方法根据产气荚膜梭菌的α-toxin基因设计引物并扩增,构建α-toxin-T重组质粒,对重组质粒进行梯度稀释后进行荧光定量PCR检测;用该方法检测水中常见的15种细菌,确定方法的特异性;检测产气荚膜梭菌加标水样,验证方法的可行性。结果成功扩增出产气荚膜梭菌的α-toxin基因并连接T载体(417 bp)。α-toxin-T重组质粒的稀释度在2.17×10~0~2.17×10~9 copies/μl的范围内,PCR反应的特异性良好,且重组质粒各浓度梯度间间隔的Ct值相近;所得回归方程为y=31.69-3.11x,r=0.997 73;该方法的检出限可达到为10 copies/μl。15株受试细菌DNA的检测结果均为阴性,产气荚膜梭菌加标水样检测结果阳性。结论该方法操作快速,具有较好的特异性和灵敏性,适用于水中产气荚膜梭菌的快速检测。     

环境水体中痢疾志贺菌荧光定量PCR检测方法研究

目的对环境水体中痢疾志贺菌荧光定量PCR检测方法进行研究和评价。方法根据痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H(invasion plasmid antigen H,ipa H)基因设计引物,利用普通PCR方法扩增其ipa H基因并将其与T载体进行连接以获得ipa H-T重组质粒;对重组质粒进行梯度稀释后进行荧光定量PCR,观察其标准曲线及最低检出限;提取17株可在环境水样中存在的多种致病菌DNA并以同样反应体系进行荧光定量PCR,验证该方法的特异性;将痢疾志贺菌加标于地表水水样中,测试该方法的环境样品检测能力。结果成功扩增痢疾志贺菌ipa H基因并连接T载体;通过荧光定量PCR检测各梯度浓度重组质粒的Ct值间隔相近,检出限低至10 copies;17株致病菌DNA的检测结果均为阴性,显示该方特异性好;在环境地表水菌落总数为3.5×103 CFU/ml、痢疾志贺菌加标浓度低至5 CFU/ml时,仍可以通过该方法检出,显示该方法的抗干扰能力强,可用于环境水样的直接检测。结论通过荧光定量PCR方法可实现对水中痢疾志贺菌进行快速检测,检测时限3 h以内,检测浓度5 CFU/ml,特异性及抗干扰性好,可用于污染水样的快速直接检测。     

产气荚膜梭菌实时荧光定量PCR方法的应用

目的利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的产气荚膜梭菌检测方法。方法以产气荚膜梭菌基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以产气荚膜梭菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的灵敏度、特异性、重复性。结果反应体系在上、下游引物浓度均为1μmol/L,探针浓度为0.1μmol/L时,具有良好的特异性和灵敏度,与创伤弧菌等24种相关细菌均无交叉反应,对纯菌检测的灵敏度为9×102CFU/ml,重复性试验证实该体系重复性好,稳定性高;3例临床样本检测结果与细菌培养结果相符。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对临床气性坏疽做出快速准确的报告,实现对气性坏疽战时高发性疾病安全、快速和定量检测。     

荧光定量PCR技术在食源性疾病病原菌快速检测上的应用与评估

目的:应用荧光定量PCR技术,实现对食源性疾病病原菌的快速检测。方法:选取食源性疾病常见的四种病原菌,沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌,根据它们的基因保守区设计特异性引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR技术,同时验证方法的敏感性和特异性,并与普通PCR、常规培养法进行比较。结果:用荧光定量PCR技术检测沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的检测灵敏度可达4 CFU/ml～8 CFU/ml,其敏感性比普通PCR高10倍,比常规培养法高1000倍。且快速简便,特异性强,从核酸提取至完成检测最快能在2 h～3 h内完成,而常规培养需3 d～4 d。通过对282件样品的检测,证实该方法可以使阳性检出率从常规法的8.51%提高至14.18%。结论:建立的荧光定量PCR技术特异性强,敏感性高,操作简便快速,适用于食源性疾病病原菌的快速检测。     

应用Taqman实时PCR法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时PCR方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时PCR法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3×100、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU。分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时PCR检测,并用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率。结果建立的实时PCR法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3×103CFU/ml。人工染菌样本增菌24 h后,实时PCR检出限1.3 CFU/25 g,PCR及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h。根据增菌24 h的检测结果,建立实时PCR样本标准曲线。24份猪肉样本,实时PCR检出17份阳性,阳性率70.83%(17/24),与PCR和传统方法的阳性率一致。根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论所建立的实时PCR具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测。     

食源性疾病监测中副溶血性弧菌现场快速检测方法的建立与应用

目的建立食源性病原菌副溶血性弧菌的快速检测方法,应用于基层实验室食源性暴发疫情病原的现场快速检测。方法采用恒温扩增-核酸试纸条方法、荧光定量PCR和典型生化联合筛检法对239份临床样本、152份食品样本进行平行检测比较。通过标准菌株试验,观察方法的敏感性与特异性。结果用恒温扩增-核酸试纸条法、实时荧光定量PCR法、典型生化联合筛检法同时对239份临床患者腹泻样本和152份食品样本进行检测,结果临床样本的阳性检出率均为11.72%,食品样本的阳性率分别为19.73%、20.39%、20.39%,3种方法的阳性率差异无统计学意义(P0.05)。3种检测方法的食品检测、特异性试验结果差异均无统计学意义(P0.05),但敏感性试验结果检测下限恒温扩增-核酸试纸条法、实时荧光定量PCR法均为10-5稀释度(菌量22 cfu/ml),典型生化联合筛检法为10-4稀释度(菌量186 cfu/ml)。结论恒温扩增-核酸试纸条方法具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、仪器简单等优点,可应用于基层实验室的现场快速检测。     

基于Taqman探针双重实时荧光PCR检测单增李斯特菌

目的:建立双重荧光PCR对单增李斯特菌(LMO)特异性检测同时检测其毒力基因的方法。方法:根据LMO溶血素基因hlyA和內华素基因InlA的保守序列分别设计特异性引物和Taqman探针,优化多重荧光PCR反应体系,进行特异性、敏感性试验。结果:用建立的方法检测LMO标准菌株和24株分离株均出现hlyA和InlA扩增曲线,而沙门菌等其他菌株未见扩增曲线;敏感性试验结果方法的敏感性达到2.5×102 cfu/ml。结论:本研究建立的LMO实时荧光PCR检测方法特异性好、灵敏度高,是快速检测LMO及其毒力基因的有效手段,可用于食品中LMO检测。     

交叉引物恒温扩增结合免疫金标方法检测副溶血性弧菌

目的用交叉引物恒温扩增技术(CPA)结合免疫金标方法快速检测副溶血性弧菌。方法用加热煮沸方法提取菌株和标本的DNA;对CPA方法进行敏感性和特异性检测,并和荧光定量PCR方法进行比较;并用建立的方法对模拟牡蛎样本进行检测。结果该方法 60℃40 min即可完成反应,且敏感性和特异性高,14株副溶血性弧菌检测结果均阳性;最低检测限为1.8 cfu/ml,模拟样本的检测限达到180 cfu/g。与荧光定量PCR检测结果一致。结论该方法具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,特别适合在基层实验室和现场快速检测。     

实时荧光定量PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立与应用评价

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法以MRSA mecA基因为靶序列设计引物和探针,以自MRSA中提取的DNA为模板,优化引物、探针的浓度和退火温度,同时验证方法的特异性、敏感性、重复性、灵敏度和线性范围,并与K-B法和微量琼脂稀释法(MIC)相比较。结果建立的反应体系在上游引物、下游引物浓度为0.2 mmol/L、退火温度为55℃时,具有良好的特异性和敏感性,与大肠埃希菌等8种细菌均无交叉反应;对MRSA检测的灵敏度达到10 CFU/ml。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对MRSA做出快速准确的报告,实现准确、快速和定量检测。     

Taqman实时定量PCR检测产毒艰难梭菌方法的建立

目的 建立以毒素基因A/B为靶基因的产毒艰难梭菌的快速定量检测方法.方法 通过设计艰难梭菌毒素A/B基因的特异引物及探针,建立标准产毒菌株DNA(ng)含量与Ct值的标准曲线.结果 该方法仅对产毒艰难梭菌进行特异性扩增,11种其他常见的致病菌及非产毒艰难梭菌均不能扩增; tcdA和tcdB基因扩增标准曲线线性关系R值分别为0.9975、0.9984,检测低限均为2.5×10-3ng.结论 该研究建立的方法具有快速、灵敏、特异性高等优点,可用于艰难梭菌毒素基因的定量检测.     

腹泻新病原艰难梭菌DNA提取方法的比较研究

目的:比较提取高质量艰难梭菌基因组总DNA的方法。方法:采用4种不同方法提取艰难梭菌基因组DNA,比较作为模板用于扩增艰难梭菌看家基因磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的优缺点。结果:除沸水浴法,其他3种方法制备的艰难梭菌DNA均能成功用作PCR扩增的模板。CTAB/NaCl法进行提取可有效去除多糖成分,但操作要求较高。碱裂解法操作简便、省时、成本低经济可靠,提取的DNA量及纯度较合适;试剂盒抽提出的产物纯度和产量明显高于CTAB/NACL、碱裂解法(P<0.05),但成本高。结论:四种方法各具优缺点,应根据实验室条件和实验要求进行选择。     

Rapid detection of toxigenic Clostridium difficile from stool samples by a nested PCR of toxin B gene

Toxigenic Clostridium difficile is the aetiologic agent of most cases of antibiotic-associated diarrhoea and pseudomembranous colitis. The present standard method for C. difficile diagnosis is a cytotoxicity assay, performed on human fibroblast cultures. It is time consuming and requires special facilities. A nested-PCR assay detecting toxin B gene within a few hours was designed. One hundred and two stool samples were collected during four months. All samples were processed for toxin B-PCR, cultured for C. difficile and tested for cytotoxicity. This approach achieved 99% concordance with the cytotoxic assay. The sensitivity and specificity for the new PCR assay were 96.3% and 100% respectively. The procedure described is easy to perform, does not require special equipment and has produced excellent results. It deserves serious consideration for routine clinical microbiology laboratory use.     

香港海鸥形菌荧光PCR快速检测方法的建立

目的:建立检测香港海鸥形菌的实时荧光PCR方法。方法:根据香港海鸥形菌以16SrDNA基因设计探针和引物,建立检测香港海鸥形菌荧光PCR方法,并对建立的方法进行特异性、灵敏性的评价。结果:检测体系灵敏度高,菌液的最低检出限可达40 CFU/反应体系;特异性好,对329株细菌的检测符合率达100%。结论:建立的实时PCR检测方法可应用于食源性致病菌中香港海鸥形菌的快速检测。     

柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种检测柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3)的实时荧光定量RT-PCR方法,为临床CVB3的快速、准确检测提供一种新的方法。方法:针对CVB3基因的VP4区和管家基因β-actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-CVB3为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建CVB3的荧光定量RT-PCR标准曲线。结果:建立的方法在1.0×101～1.0×108copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2>0.999),扩增效率高于98.0%,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品。用CVB3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101copies。结论:建立的荧光定量RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVB3的快速诊断方法,为CVB3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据。     

多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究

目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌。方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点。结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测。检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

MGB-TaqMan探针实时荧光定量在快速检测产肠毒素大肠杆菌中的价值

目的 采用MGB-TaqMan探针建立产耐热肠毒素大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法.方法 针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素Ⅰ基因片段设计引物、MGB探针,采用外标法,绘制标准曲线,进行实时荧光定量PCR检测.评价该方法的特异性,灵敏度,准确度,检测范围,重复性及稳定性等.做阴性对照,排除假阳性,采用UNG酶抗污染.结果 实验结果表明引物、探针特异性良好,该方法的灵敏度可达到每反应3DNA拷贝,特异性强,检测范围在100～109拷贝每反应,重复性及稳定性较好,整个过程只需要2 h.结论 该方法能快速、灵敏、特异检出产耐热肠毒素大肠埃希菌,对控制由耐热肠毒素引起的腹泻性疾病具有重要意义.     

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。