甲型H_1N_1流感病毒株的HA和NA基因分析

目的研究2009年湖州市流感的病原甲型H1N1分离株A/Huzhou/09(H1)的HA和NA基因特征。方法采用MDCK细胞对患者咽拭子和漱口液标本进行病毒分离,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒HA和NA基因并进行序列测定,用DNAstar和MegAlign等软件分析处理。结果湖州市甲型H1N1分离株的HA和NA基因为1706个核苷酸和1401个核苷酸,与其他地区分离株核苷酸同源性在99.5%～100.0%和99.7%～100.0%。进化树分析显示,湖州市甲型H1N1分离株(A/Huzhou/09)的HA和NA基因与其他地区分离株变化不大,几乎完全一致。结论甲型H1N1分离株的变异特征及亲缘进化,分析对流感的流行病学研究具有重要意义。     

安徽省早期甲型H1N1流感病毒的血凝素基因序列分析

目的检测、分析安徽省甲型H1N1流感早期病例的病毒血凝素（HA）基因的序列特征。方法RT-PCR方法扩增我省早期流感样病例的病毒核酸并对其HA基因序列进行分析比对。结果我省早期甲型H1N1流感病例的病毒HA基因与2009年全球流行的甲型H1N1流感病毒高度同源,与古典型猪流感亲缘性较近,与欧洲和亚洲分离的A/H1N1猪流感和A/H1N1禽流感亲缘关系较远。结论我省早期流行的甲型H1N1流感毒株HA基因可能由古典型猪流感进化而来,与WHO选定的甲型H1N1疫苗候选株同源性较高,对于人季节性流感A/H1N1疫苗可能并不敏感。     

四川省甲型H1N1流感病毒血凝素基因特性和抗原性分析

目的 了解四川省甲型H1N1流感病毒的抗原性和血凝素(HA)基因的变异情况.方法 对四川省2009-2011年分离的流感病毒采用单项血凝抑制试验鉴定毒株型别,在此基础上选取分离自中国内地首发甲型H1N1流感病例、首起甲型H1N1流感疫情、甲型H1N1流感死亡病例以及哨点医院流感样病例标本的甲型H1N1流感病毒株共计11株,进行HA基因核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因特征分析.结果 与中国代表株A/四川/SWL1/2009(H1N1)相比,2009-2011年四川省甲型H1N1流感毒株单项血凝抑制效价均无4倍以上差异,与疫苗株A/California/7/2009(H1N1)相比,HA氨基酸具有高度同源性(96.6％ ～99.4％).结论 四川省甲型H1N1流感病毒的HA基因特性和抗原性没有发生明显变异.     

2008-2012年江西省甲型H3N2流感病毒HA1基因特征及与疫苗株差异分析

目的掌握2008-2012年江西省甲型H3N2亚型流感病毒HA1基因特征,在分子水平了解WHO甲3型疫苗推荐株对江西省甲3亚型流感病毒预防效果。方法采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的甲3型流感病毒毒株进行核酸的提取,扩增病毒HA1基因后进行核苷酸序列测定并对HA1基因特性进行分析。结果 2008-2012年共分离到甲3型流感病毒553株,对其中23株毒株进行HA1基因序列测定,各年份的毒株HA1序列分别与当年WHO对北半球推荐的疫苗株进行比对,结果为2008-2012年氨基酸同源性分别为98.4%~99.1%、96.6%~98.4%、97.2%~98.4%、96.2%~97.2%和96.6%~98.1%;抗原决定簇区氨基酸平均变异数分别为1.3个、3.2个、1.4个、3个和2.5个;其中2009年有3株在2个抗原决定簇区发生了4~5个的氨基酸替换。结论2008-2012年甲型H3N2亚型流感病毒分离株HA1基因在不断发生变异,疫苗对我省2008年度、2010年度和2012年度的甲型H3N2亚型流感保护效果良好,在2011年度保护效果存在滞后现象,对2009年甲型H3N2亚型流感保护效果较差。     

金华市首例甲型H1N1流感死亡病例病毒分离及HA基因序列分析

目的分离甲型H1N1流感病毒,分析金华市首例甲型H1N1流感死亡病例病毒分离株HA基因序列特征,为研究病毒进化、致病性、流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞和real-time PCR法进行病毒分离、鉴定;提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其HA基因片段,测定核苷酸序列;利用GeneBank中相关序列对病毒分离株A/Jinhua/01/2009（H1N1）进行基因进化树分析。结果从3份咽拭子样本中分离出1株甲型H1N1流感病毒。HA基因序列分析证明：该毒株与2009年大流行株高度同源,与古典型猪流感亲缘性较近,与欧亚地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。结论金华市首例甲型H1N1流感死亡病例分离病毒株与北美流行株高度同源,可能是由古典型猪流感进化而来,与WHO选定的甲型H1N1疫苗候选株同源性较高,对于人季节性流感A/H1N1疫苗可能不敏感。     

北京市西城区2009年-2011年乙型流感病毒血凝素HA1基因特性分析

目的:了解2009年10月-2011年9月期间北京市西城区乙型流感病毒的血凝素基因(HA1)的变异情况以及WHO推荐的流感疫苗株对北京地区人群的保护情况。方法:对流感样病例的咽拭子进行病毒分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸提取,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增其HA1基因,用DNAStar生物软件对HA1的序列进行分析处理,并与WHO推荐的疫苗株进行系统进化分析。结果:HA1片段序列分析显示本地区的乙型流感病毒属于Victoria系,与WHO推荐流感2009年-2010年疫苗株B/Brisbane/60/2008相比,其核苷酸、氨基酸的同源性分别为96.4%～99.1%和98.2%～99.1%。未发现核苷酸的丢失和插入。氨基酸序列中有3个位点发生改变。结论:本地区的优势流行株其抗原性未发生明显改变,提示2010年WHO推荐乙型流感疫苗株对北京地区人群仍有较好的保护效果。     

泉州市2009年甲型H1N1流感基因特性分析

目的 了解福建省泉州市2009年甲型H1N1流感病毒的HA和NA基因特征,探讨该病毒的遗传变异及分子特性.方法 采集泉州市甲型H1N1流感患者咽拭子,采用实时荧光聚合酶链反应方法检测病毒核酸及MDCK细胞培养进行病毒分离、鉴定,提取其中2株代表性毒株病毒核糖核酸(RNA),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒HA和NA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAstar megalign软件进行序列分析.结果 1020份咽拭子检出甲型H1N1流感病毒核酸阳性200份;季节性流感病毒核酸阳性70份,其中H3N2亚型53份,H1N1亚型14份,B型3份,并分离到29株甲型H1N1流感病毒株;HA基因核苷酸序列测定显示,该毒株与北美流行株高度同源,由HA基因核苷酸序列推导的氨基酸系列与疫苗株A/Brisbane/59/2007比较,有22个位于抗原决定簇的氨基酸位点发生变异,但受体结合特异性仍为人样受体,NA基因耐药性位点分析显示,对达菲药物依然敏感.结论 2009年泉州市甲型H1N1流感流行毒株与北美流行株高度同源,相对于疫苗代表株出现了HA蛋白抗原性漂移.     

黑龙江省甲型H1N1流感病毒HA基因特性分析

目的测定流感病毒HA基因序列,从分子水平分析黑龙江省第1例甲型H1N1流感死亡病例病毒株以及2例2011年甲型H1N1流感病毒株HA基因的特点。方法采用MDCK细胞和Real-time PCR方法对甲型H1N1流感病毒HA基因片段进行分离、鉴定,并进行核苷酸序列测定和分析。结果将3例标本序列拼接后分别截取开放读码框内核苷酸同甲型H1N1代表株进行系统进化分析和同源性分析,结果显示新甲型H1N1流感病毒HA蛋白氨基酸与WHO推荐的疫苗株A/California/07/2009(H1N1)及中国的代表株A/Sichuan/1/2009(H1N1)亲缘关系最近,聚在一个分支上,同源性也较高,为98.6%～99.1%。结论目前的新甲型H1N1流感病毒的HA蛋白变异还很小,但应密切关注该病毒的变异情况。     

新甲型H1N1流感与中国甲型H1流感HA基因进化比较研究

目的比较新甲型H1N1流感与中国甲型H1亚型流感病毒HA基因的进化。方法用非度量多维尺度法分析下载自GenBank的中国人和猪甲型H1亚型流感HA序列及WHO北半球流感疫苗推荐株HA序列和新甲型H1N1流感HA序列,构建HA基因进化图谱。结果新甲型H1N1流感病毒HA基因与猪甲型H1亚型流感病毒的亲缘关系较近,而和中国人甲型H1亚型流感病毒及WHO近年推荐的疫苗株亲缘关系很远,并且新甲型H1N1流感病毒HA序列在进化上与中国猪甲型H1亚型流感病毒仍然存在一定距离。结论从基因层面上提示我国人群既往免疫和疫苗对新甲型H1N1流感可能不能提供有效保护,病毒有可能会在人群中流行。同时分析结果提示了尚无证据表明这次始于北美的新甲型H1N1流感来自中国。     

2009年-2011年江西省新型甲型H1N1流感病毒HA1基因进化分析

目的分析江西省2009年-2011年新型甲型H1N1流感病毒HA1基因的特点,了解江西省流感病毒变异情况及WHO推荐疫苗株对人体的保护作用,为新型甲型H1N1流感的监测和防控提供理论依据。方法采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,从江西省流感监测网中随机选择19株新型甲型H1N1流感病毒,经核酸提取和one-step RT-PCR扩增HA1基因片段,双向序列测定,采用DNAStar 5.0和MEGA 3.0软件分析HA1基因特征。结果 2009年-2011年江西省新型甲型H1N1流感病毒HA1基因序列与疫苗推荐株具有高度同源性,但毒株变异位点逐年增加,部分变异在抗原决定簇位点。结论目前的疫苗仍对人群有保护作用,但存在新型甲型H1N1流感再次流行的风险。     

湖州市乙型流感病毒HA1基因分析

目的:了解湖州市乙型流感病毒的基因变异情况和WHO推荐流感疫苗株对湖州市人体的保护情况。方法:采集类流感样本进行流感病毒的分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1。基因核苷酸序列测定,用DNAMAN和MegAlign生物软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐疫苗株基因进行比对。结果:分离到的毒株为Victoria系的乙型流感病毒,未发现核苷酸的丢失和插入,糖基化位点没有太大改变。毒株HA1区域的核苷酸序列长度为1015 bp,推导的氨基酸序列长度为339个,相比Yamagata系毒株在163位上都多1个天冬酰胺(N)。结论:2010年WHO推荐乙型流感疫苗株与湖州市的流行株为同一谱系毒株,预防保护效果较好。     

天津地区2005年甲1亚型流感病毒HA1区基因特性分析

目的 了解天津地区夏季一起小学校流感样暴发疫情中分离出2株甲1亚型流感病毒株HA1基因变异情况。方法MDCK细胞和鸡胚双腔法分离流感病毒，收获病毒液提取病毒的RNA，进行RT—PCR，扩增产物纯化后测序，用DNASTAR软件进行序列分析。结果新分离株HA1基因长度为325个氨基酸，与国际疫苗株A／NewCaledonia／20／99相比氨基酸同源性高于98％，氨基酸替换位点有5个，其中165位位于抗原决定簇Cal区。结论天津地区新分离甲1亚型流感病毒抗原性发生进一步漂移，但变异程度不大。     

2004～2006年江西省乙型流感病毒HA1基因特性分析

目的：了解江西省2004～2006年分离的B型流感病毒株HA1基因变异特征。方法：采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的B型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒基因后进行核苷酸序列测定,用DNAStar5.0、BioEdit（Version5.0）、Mage生物软件对测序结果进行分析处理,推导出氨基酸序列,进行基因特性分析。结果：2004年和2005年分离到的B型流感病毒均为B型的Yamagata系;2006年以Victoria系为优势株,但有Yamagata系的活动。9株Yamagata系B型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为1014 bp,未发现核苷酸的丢失和插入,与疫苗推荐株B/Shanghai/361/2002 HA1区相比较,不同毒株氨基酸同源性为96.4%～97.3%,替换数在10～11个,所有毒株均在9个相同的氨基酸位点发生了相同的替换,在196位增加了一个糖基化位点。12株Victoria系B型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为1017 bp,未发现核苷酸的丢失和插入,与疫苗推荐株B/Malaysia/2506/2004的HA1区相比较,不同毒株氨基酸同源性为98.4%～99.5%,替换数在2～4个,所有毒株均在2个相同的氨基酸位点发生了相同的替换,在197位增加了一个糖基化位点。结论：江西省2004～2006年Yamagata系B型流感病毒HA1基因特性已发生改变,从基因水平说明Yamagata系B型流感病毒抗原性发生了改变。2006年Victoria系B型流感病毒HA1基因特性有所改变,疫苗仍有预防效果。     

石家庄市2009年H3N2亚型流感病毒血凝素重链区基因变异分析

目的:了解石家庄市2009年H3N2亚型流感病毒流行情况,研究2009年分离H3N2亚型流感病毒株血凝素重链(HA1)的基因特性及变异情况。方法:用MDCK细胞分离流感病毒,采用血抑实验分型鉴定。随机选取24株H3N2亚型流感毒株进行RNA提取、逆转录扩增获得HA1基因产物,将其进行基因序列测定,之后用DNAStar软件的MegAlign功能进行序列比对和分析。结果:经MegAlign将24株毒株与WHO疫苗推荐株A/Wisconsin/67/200(07～08)、A/Bris-bane/10/2007(08～10)进行比对,发现与同年疫苗株同源性较高,为98.2%～98.6%,仅有个别位点出现氨基酸替换。结论:2009年石家庄市H3N2亚型流感毒株HA1区与同年疫苗株基因序列符合率较高,尚未形成一个新的变异株。     

北京市1998-2004年婴幼儿A3型流感病毒分离株HA1基因序列分析

目的 了解1998-2004年北京地区婴幼儿中流行的A3（H3N2）亚型流感病毒血凝素基因HA1区的基因变异特点。方法 提取该期间采集的呼吸道标本中H3N2亚型流感病毒的RNA，经逆转录多聚酶链反应扩增得到HA1区基因片段。通过目的基因的克隆、测序或PCR产物直接测序，进行序列分析。结果 19982004年问北京地区婴幼儿中流行的H3N2亚型流感病毒血凝素HA1区基因均为987bp，编码一个含329个氨基酸的蛋白质。这些H3N2亚型流感病毒血凝素HA1区的核苷酸和氨基酸同源性分别在95．5％～100．0％和93．0％～100．0％之间，分离年份越近同源性越高。在HA1区有7个糖基化位点非常保守，分别位于8、22、38、63、126、165和285位氨基酸。与1997年以前的毒株相比，1997年以后的毒株均在122和133位增加了一个糖基化位点。自1999年以后的毒株均在144位增加了一个糖基化位点。每年流行的毒株都较前一年的毒株出现了位于不同抗原决定簇或者受体结合位点的氨基酸替换。进化分析显示，每年分离的毒株均与以前的毒株出现了不同程度的变化，不断出现新的进化分支。结论 1998—2004年间北京地区婴幼儿中流行的H3N2亚型流感病毒持续不断地发生着点突变，导致抗原性不断发生漂移。加强监测和密切关注其变异动向对防控流感流行有极其重要的意义。     

2017 - 2018年度陕西省甲型H1N1流感病毒基因特征分析

目的 了解陕西省2017 - 2018年度甲型H1N1流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因变异情况。方法 选取2017 - 2018年度分离的6株甲型H1N1流感毒株进行全基因测序,利用生物信息学软件对分离株的HA和NA基因进行进化和变异分析,并与北半球疫苗株A/Michigan/45/2015进行对比;采用MEGA（5.05） 软件NJ法构建基因进化树,进行系统进化分析。结果 陕西省2017 - 2018年度甲型H1N1流感病毒阳性占比36.85%,流行高峰为2017年12月和2018年1月。6株甲型H1N1流感病毒测序得到的HA、NA序列与疫苗株比对,分别有12、11个氨基酸位点发生变异,其中HA有7个位点变异发生在抗原决定簇,受体结合位点、潜在糖基化位点比较稳定;NA序列没有发现耐药位点变异。结论 2017 - 2018年度陕西省甲型H1N1流感病毒为优势流行株。目前甲型H1N1流感病毒与WHO推荐的新疫苗株高度同源。     

湖南省2006--2009年人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)分子特征研究

目的 分析湖南省2006-2009年4例人感染高致病性禽流感病例感染病毒的可能来源、基因重配情况以及分子特征.方法 鸡胚分离核酸检测H5N1病毒阳性标本,获得高致病性H5N1病毒,对病毒进行全基因组序列测定,采用BLAST和MEGA4.0进行同源性比对、基因进化分析和各基因分子特征分析.结果 4株病毒的基因片段均为禽源,并未发现与人季节性流感病毒之间发生重配,且与当地禽类中分离的病毒高度同源.全基因组进化树分析显示,4株病毒在分支2.3.4中,2株为基因型V、2株为新的基因型.分子特征分析显示,4株病毒的血凝素(HA)分子裂解位点均为PLRERRKR/G,均出现A160T位点突变,神经氨酸酶(NA)分子49～68位均出现20个氨基酸(aa)缺失,非结构蛋白1(NSI)分子80～84位均出现5个aa的缺失.在HA分子大部分位点,4株病毒仍然表现出与禽类受体的亲和性,HN/1/09和HN/2/09出现可能使病毒对α-2,6连接的唾液酸人类受体的亲和性增强的T192I突变.HN/1/08的PB2基因出现增加小鼠致病力的D701N改变.耐药性基因片段分析显示,4株病毒对金刚烷胺和奥司他韦均敏感.结论 2006-2009年湖南省4株人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)为禽源,但存在多种基因型,而且发生了部分位点的突变.

Abstract：

Objective To understand the possible origins,genetic re-assortment and molecular characterization of 4 highly pathogenic avian influenza A(H5N1)viruses isolated from humans in Hunan province,between 2006 and 2009,Methods H5N1 PCR test-positive specimens were inoculated in embryonated eggs while H5N1 virus was isolated and genomes sequenced.Genome homology and genetic molecular characterization were analyzed by BLAST and MEGA 4.0.Results All gene segments of the 4 viruses were avian in origin.No re-assortment was found between avian influenza A(H5N1)viruses and human seasonal influenza viruses.Virnses that isolated from domestic poultry shared high similarity with the 4 human viruses in gene homology.Data from the whole genome phylogenetic analysis showed that the 4 viruses were in clade 2.3.4,while 2 viruses belonged to genotype V,and another 2 were new genotypes.Results from molecular characterization showed that amino acid sequences of HA cleavage site of the 4 viruses were PLRERRKR/G.All 4 viruses had A160T mutation in HA,a 20 amino acid deletion in the neuraminidase(NA)stalk at position 49-68,and a 5 amino acid deletion in the non-structural protein 1(NS1).Most sites in the HA molecules showed that the viruses preferentially bound to avian influenza virus receptor.However,T192I mutation that might enhance the α2,6-linked sialic acid human influenza receptor binding had emerged in HN/1/09 and HN/2/09.D701N mutation of PB2 that increased the virulence in mice was found in HN/1/08.Analysis on drug resistance gene amino acid showed that all 4 viruses were sensitive to amantadine and oseltamivir.Conclusion Highly pathogenic avian influenza A(H5N1)viruses isolated from humans in Hunan province from 2006 to 2009 were avian in origin,and the 4 viruses belonged to different genotypes.Some mutations that related to virulence and receptor binding positions had emerged in some of the strains.     

Development of broadly reactive H5N1 vaccine against different Egyptian H5N1 viruses

The H5N1 highly pathogenic avian influenza (HPAI) virus was isolated for the first time in Egypt in 2006, since then, the virus has become endemic causing a significant threat to the poultry industry and humans. H5N1 HPAI outbreaks continue to occur despite extensive vaccination programs that have been implemented nationwide in different poultry species. Several studies showed that the co-circulating H5N1 viruses in Egypt are genetically and antigenically distant raising a question on the cross protective efficacy of commercial vaccines. In this study, we introduced mutations at the antigenic sites of the hemagglutinin (HA) to broaden reactivity of the Egyptian H5N1 virus. A reverse genetically created variant H5N1 virus (A/chicken/Egypt/1063/2010) with five amino acid mutations (G140R, Y144F, I190L, K192Q, D43N) in the HA gene showed enhanced cross reactivity. This virus showed up to 16 fold increase in reactivity to the classic-lineageH5N1viruses measured by hemagglutination inhibition (HI) assay while maintaining similar level of reactivity with the variant-lineage viruses compared to wild-type virus. In addition, a single amino acid substitution (N165H), which removes potential glycosylation site at the HA globular head of two classic strains (A/chicken/Egypt/527/2012 and A/chicken/Egypt/102d/2010) broadened the reactivity to antisera generated against H5N1 viruses from different clusters. The broadened reactivity of the mutant viruses were also confirmed by testing reactivity of antisera prepared from the mutant viruses against reference viruses from both classic and variant clades. The virus neutralization test using selected antisera and viruses further confirmed the cross HI results. This study highlights that targeted mutation in the HA may be effectively used as a tool to develop broadly reactive influenza vaccines to cope with the continuous antigenic evolution of viruses.     

湖北省甲3型流行性感冒病毒株HA1基因特性分析

目的探讨湖北省流感病毒分离株的变异、进化发展过程,比较这些毒株之间的遗传进化亲缘关系,探讨湖北省流感病毒血凝素基因变异规律,为湖北省流感防治提供理论基础。方法对省内1983-2002年分离到的8株H3N2亚型流感病毒HA1区基因进行序列测定,并用生物信息学研究方法,分析比较各年代病毒分离株的进化关系。结果随着时间的变化,湖北省内流感病毒HA1基因间核甘酸替换数增加,随之抗原决定簇A和B的氨基酸有改变。结论分析1983-2002年8株流感病毒株,根据其HA1基因序列,按年代特征划分为两个谱系。其中一个谱系是1985年及其以前分离的毒株。上个世纪90年代后分离的毒株为一个谱系,90年代及2002年的毒株在进化树上和80年代处于不同分支。     

辽宁省甲1亚型流感病毒HA1基因变异分析

目的 了解2000~2006年辽宁省甲1亚型流感病毒HA1基因变异特征。方法 利用辽宁省流感监测的咽拭分离株中的甲1亚型流感病毒核酸,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,测序,并推导出其氨基酸序列,进行基因进化特征分析。结果 辽宁省2000~2002年均分离到甲1亚型流感病毒,但消失了近3年后,2005年底又出现,且基因序列碱基发生变异,与2005年以前的病毒株和疫苗株A/New Caledonia/20/1999比较^〔1〕,在其HA1蛋白分子上存在有4个氨基酸位点(187位W>R,188位Y>F,209位Q>K,249位V>A)发生了替换。基因序列及氨基酸序列同源性均有下降。结论 辽宁省2000~2006年甲1亚型流感病毒基因序列发生了明显变异,与甲1亚型疫苗株A/New Caledonia/20/1999同源性有下降趋势,提示其抗原可能发生部分漂移或更换,这对流行季节疫苗选择和流行病学研究都具有重要意义。