哺乳动物RNA干扰中的小干扰RNA表达载体

载体表达小干扰RNA的方法因便宜，稳定，操作方便的优点，在哺乳动物RNA干扰研究中有非常大的潜力和优势。本文对当前哺乳动物RNA干扰研究中的小干扰RNA表达用载体作一综述。小干扰RNA载体表达方法的广泛应用，将对功能基因组研究以及抗病毒和肿瘤的基因治疗产生深远的影响。     

哺乳动物RNA干扰中的小干扰RNA表达载体

载体表达小干扰RNA的方法因便宜,稳定,操作方便的优点,在哺乳动物RNA干扰研究中有非常大的潜力和优势。本文对当前哺乳动物RNA干扰研究中的小干扰RNA表达用载体作一综述。小干扰RNA载体表达方法的广泛应用,将对功能基因组研究以及抗病毒和肿瘤的基因治疗产生深远的影响。     

哺乳动物RNA干扰中小干扰RNA载体表达策略及其表达盒

RNA干扰是一种典型的转录后基因调控方法 ,也是体内抵御外在感染的保护机制之一。在哺乳动物功能基因组学及病毒感染性疾病和肿瘤治疗研究中具有很大的应用前景。构建在细胞内稳定表达小干扰RNA的载体因价廉、稳定、操作方便 ,被认为是一种较理想的产生RNA干扰的方法 ,目前广泛应用于哺乳动物RNA干扰研究中。本文对小干扰RNA载体的表达策略及其表达盒作一阐述。     

哺乳动物RNA干扰中小干扰RNA载体表达策略及其表达盒

RNA干扰是一种典型的转录后基因调控方法，也是体内抵御外在感染的保护机制之一。在哺乳动物功能基因组学及病毒感染性疾病和肿瘤治疗研究中具有很大的应用前景。构建在细胞内稳定表达小干扰RNA的载体因价廉、稳定、操作方便，被认为是一种较理想的产生RNA干扰的方法，目前广泛应用于哺乳动物RNA干扰研究中。本文对小干扰RNA载体的表达策略及其表达盒作一阐述。     

shRNA表达载体构建及其对HBV体外抑制作用

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)基因X区和P区的shRNA表达载体,通过纳米聚合物将其转入HBV感染的细胞模型,并检测其对HBV复制的抑制作用。方法设计3条针对HBV基因编码区的干扰RNA序列,合成3对64nt的寡核苷酸,插入载体pRNAT-U6,构建重组干扰质粒Sl、S2和S3,利用纳米转染剂转入HBV感染的HepG2细胞。用实时荧光定量法检测HBVmRNA含量。结果干扰质粒S1、S2对HBv的复制有明显抑制作用,荧光定量检测转染后HBVmRNA表达水平发现,HBVmRNA含量分别减少至空白对照组的70.2%和61.2%,无关对照质粒则无抑制作用。结论成功构建针对HBv编码区的shRNA表达载体,并能在体外有效抑制HBVmRNA。     

靶向GCSsi RNA表达载体与胃癌细胞耐药性

目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）小干扰RNA（SiRNA）表达载体,观察其对胃癌耐药细胞（SGC7901/VCR）GCS基因表达和耐药性的影响。方法根据siRNA的设计原则,针对人GCS的mRNA序列设计并合成编码siRNA的寡核苷酸序列,并将其克隆入SiRNA的表达载体,构建重组质粒,将重组质粒转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901/VCR,通过蛋白印迹实验（WB）等方法检测转染细胞GCS的表达水平,采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测细胞耐药情况。结果构建的GCS siRNA表达载体经限制性酶切分析,证实释放出的片段大小与预期结果一致;转染SGC7901/VCR细胞后,可使细胞中GCS的表达受抑制,并使细胞对VCR的敏感性增加。结论GCS siRNA表达载体的成功构建及其对GCS表达的抑制和细胞耐药的逆转,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新手段。     

干扰性小RNA对HCV RNA复制的干扰作用

丙型肝炎因其较高的发病率和极其严重的后果日益受到人们的关注,但针对性治疗又相当有限。近年的研究表明,干扰性小RNA(siRNA)可以通过降解双链RNA起到抗病毒作用,从而为丙型肝炎的治疗提供了一种新的思路和方法。本文对RNA的干扰作用及siRNA干扰HCV RNA复制的研究状况作了综述。     

人血管内皮细胞生长因子受体2小干扰RNA的设计及其表达载体的构建

目的寻找并探讨干扰效果强的人血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelialgrowth factor receptor2,VEGFR-2）小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）,以抑制白血病细胞。方法设计人VEGFR-2siRNA,并转染HL60细胞,MTT法筛选最有效siRNA;合成VEGFR-2shRNA,并构建VEGFR-2shRNA表达载体;比较VEGFR-2shRNA表达载体转染HL60细胞后干扰的效果。结果筛选出最有效siRNA;VEGFR-2shRNA正确正向克隆入pENTR TM/U6,成功构建VEGFR-2shRNA表达载体;以其将VEGFR-2shRNA瞬时转染入HL60细胞后,细胞生长抑制率为84.9%,P〈0.01;VEGFR-2蛋白表达明显减少。结论通过必要和有效的筛选机制,才能找到抑制效果相对高的siRNA靶序列;VEGFR-2shRNA表达载体可在细胞内简单、快速地克隆shRNA,VEGFR-2的表达抑制率高。     

RNA干扰作用--治疗HIV的新途径

RNA干扰作用(RNAi)是生物界一种古老且进化上高度保守的现象，是基因转录后沉默作用(PTGS)的重要机制之一，RNA干扰作为抑制基因表达的有利工具．首次在无脊椎动物和植物中对付外目的基因，主要通过短的干扰RNA(siRNA，大约21个核苷酸的RNA的复合物)有效地抑制同源性基因的表达。最近的研究表明，用siRNA抑制HIV-1的复制，即通过它抑制病毒或者细胞内的基因，取得了重要的成效。RNAi开辟了新的基因治疗药物研究途径，本文就RNAi用于抑制HIV作一综述。     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的应用研究

RNA干扰原理的发现及深入研究为治疗慢性乙型肝炎开辟了一条新的途径.该文就RNA干扰技术在治疗慢性乙型肝炎领域中,针对靶序列和载体的选择、小干扰RNA抑制病毒量效关系及该技术在拉米夫定耐药毒株中的作用等方面的研究现状进行综述,并对其应用前景进行展望.     

乙型肝炎病毒不同基因区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制和表达的实验研究

目的针对乙型肝炎病毒(HBV)不同基因区设计siRNA,观察其对HBV表面抗原、e抗原分泌和HBVDNA复制的影响。方法靶向HBV基因区S、C、X的siRNA分别转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,Real-timePCR定量检测HBVDNA拷贝数。结果靶向不同基因区的siRNA均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌和HBVDNA的复制,其中S区siRNA对HBsAg呈现非常显著的抑制作用,抑制率为91.88%(P﹤0.01),对HBeAg表达的抑制作用较弱,抑制率为24.85%(P﹤0.05),对HBVDNA的抑制率为63.07%(P﹤0.01);C区siRNA对HBeAg和HBVDNA抑制作用较强,分别为54.77%(P﹤0.01)和76.97%(P﹤0.01),但对HBsAg的表达无明显影响(P﹥0.05);X区siRNA对HBsAg和HBeAg、HBVDNA均有抑制作用,抑制率分别为90.83%(P﹤0.01)、34.85%(P﹤0.01)和70.31%(P﹤0.01)。靶向不同基因区的siRNA对HBsAg、HBeAg、HBVDNA的抑制作用在一定的程度上存在剂量效应,而无关序列对HBsAg、HBeAg和HBVDNA的复制和表达几乎无干扰作用(P﹥0.05)。结论靶向HBVC、S、X基因区的siRNA可特异、高效、稳定地抑制HBV的复制和表达,为应用RNA干扰治疗乙型肝炎病毒奠定了一定基础。     

修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体的构建

目的 构建人修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.方法 提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hMTHI基因cDNA保守序列，经pGEMT载体克隆后双酶切，将cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl，构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，并转染细胞。用Western-blot法检验载体抑制hMTH1蛋白表达的效率。结果 经RT-PCR获得423bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为hMTH1基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，测序后确证。该载体转染细胞后，可使hMTH1蛋白水平下降约46％。结论 成功构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.     

小分子干扰RNA干扰相关基因表达对卵巢癌化疗敏感性影响的研究进展

卵巢癌是女性生殖系统常见3大恶性肿瘤之一,导致的患者病死率居妇科恶性肿瘤首位,严重威胁女性的健康与生命。目前卵巢癌以手术和化疗为主要治疗方法,而肿瘤对化疗药物产生耐药,是导致治疗失败的重要原因之一。因此,研究卵巢癌细胞的耐药性逆转作用,对提高临床治疗效果意义重大。而小分子干扰RNA(siRNA)是由双链RNA在多种酶共同作用下产生的小片段双链RNA,可与同源的靶mRNA互补结合,特异性降解靶mRNA。因此,通过设计针对性的siRNA干扰与肿瘤发生、发展相关的基因,如Id1、STAT3、MDR1、BAF57及CXCR4等表达,可提高卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性,为卵巢癌细胞耐药性逆转研究提供初步理论依据。     

乙型肝炎病毒X基因载体的构建及鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X基因高效真核表达载体,为进一步研究乙型肝炎病毒X基因的功能及乙型肝炎病毒母婴垂直传播的可能机制奠定基础.方法 设计并合成乙型肝炎病毒X基因的引物,以我国急性肝炎患者血清中获得的全长乙型肝炎病毒序列C基因型作为构建载体X基因序列的母板进行扩增,将扩增产物X基因连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等鉴定所构建的真核表达载体.结果 以重组载体为模板、用乙型肝炎病毒X基因引物PCR扩增得到的目的 片段为500bp,与已知乙型肝炎病毒X基因大小相同,酶切后发现在500bp左右及5kb左右出现两条特异性条带,分别与已知X基因序列相同.结论 成功构建了乙型肝炎病毒X基因真核表达载体,为进一步研究乙型肝炎病毒X基因的功能及宫内感染的可能机制奠定了基础.     

腺病毒载体在抗HBV基因治疗中的应用

HBV持续感染是导致慢性肝炎后肝硬化、肝细胞癌等疾病的重要原因,尚缺乏能彻底治疗的手段。基因治疗是近年迅速发展的一种治疗HBV感染的方法。理想的基因治疗载体是基因治疗的一个重要方面。腺病毒载体由于其特有的一些优点在抗HBV的基因治疗中受到重视。文中就腺病毒载体在抗HBV基因治疗中的应用作了综述。     

应用干扰RNA慢病毒技术抑制人脑胶质瘤细胞中红细胞生成素受体mRNA的表达

目的探讨重组红细胞生成素受体(EPOR)干扰RNA慢病毒抑制人脑胶质瘤细胞中EPOR mRNA的表达情况。 方法选择人脑胶质瘤U251细胞株和人胚肾293T细胞株为研究对象。利用RNA干扰技术构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,进行病毒包装、病毒收集、病毒滴度检测后,感染人脑胶质瘤U251细胞,选择最佳MOI值;采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测U251细胞和感染重组EPOR干扰RNA慢病毒的U251细胞EPOR mRNA相对表达量,并计算重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞EPOR mRNA表达的干扰效率。 结果①本研究成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,并测定其病毒滴度为1×10¹⁴TU/L。②MOI值为100的重组EPOR干扰RNA慢病毒感染U251细胞的荧光蛋白表达量最高,MOI值为1的荧光蛋白表达量最低。③重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞的干扰效率为69%,并使EPOR mRNA表达明显受到抑制。 结论成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,使U251细胞的EPOR mRNA相对表达量明显降低,为后续EPOR转录水平变化的相关研究奠定实验基础。     

蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

人神经病靶标酯酶RNAi表达载体的构建及其对哺乳动物细胞中NTE表达的抑制

目的构建人神经病靶标酯酶（NTE）双链RNA的稳定表达载体。方法用SpeI和XhoI将pSUPER质粒中的H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子及多克隆位点部分切下替换pcDNA3．1（＋）载体中的巨嗜细胞病毒（CMV）启动子及其多克隆位点，构建了适合在哺乳动物细胞中表达具有干涉作用的小RNA的载体pSUPER／neo，进而将针对NTE表达的双链DNA插入到Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切的载体pSUPER／neo中构建NTE的双链RNA表达载体pSUPER/neo-NTE，后者被转染到COS7和SH-SYSY细胞中，采用蛋白质杂交和酶活力测定的方法，检测其表达效率并验证载体构建的TF确性。结果构建了适合在真核细胞用抗生素筛选的NTE双链RNA表达载体pSUPER／neo-NTE。蛋白质杂交检测显示，转染细胞能有效抑制外源性NTE的表达；酶活力测定则显示其能有效地抑制内源性NTE的表达．结论采用启动子替换的策略，成功构建了NTE双链RNA的表达载体并在哺乳动物细胞内有效抑制NTE的表达。     

靶向EZH2基因的shRNA干扰对人卵巢癌细胞Drosha基因表达的影响

目的:探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因对卵巢癌细胞株A2780的Drosha基因表达的影响。方法:获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的人卵巢癌细胞株A2780-shEZH2,实时定量PCR法(qRT-PCR)和免疫印记法(Western blot)检测转染株的Drosha基因表达。结果:以未转染组A2780细胞Drosha的表达水平为100%,EZH2-shRNA转染组A2780-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.02±4.32)%和(51.26±1.35)%,与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论:沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。     

短发夹状RNA介导TNF-α基因沉默及抑制细胞凋亡的作用

目的探讨特异性的短发夹状RNA（shRNA）沉默肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因及抑制细胞凋亡的作用效果。方法构建针对大鼠TNF-α基因编码区的短发夹状RNA真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-TNF-αshRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达TNF-αshRNA的细胞系。实验分为3组,⑴正常对照组：未转染的RK3E细胞;⑵阴性对照组：转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;⑶实验组：转染TNF-αshRNA的RK3E细胞系。经脂多糖（LPS）孵育12h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达。结果成功构建大鼠TNF-α基因的短发夹状RNA真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-TNF-αshRNA;经LPS刺激后,与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低（P〈0.01）,TNF-α的mRNA含量显著降低（P〈0.05）。结论针对TNF-α的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的RK3E细胞凋亡。