大鼠正常与退变性髓核突出导致神经根性疼痛的对比研究

目的探讨正常与退变髓核突出对大鼠疼痛阈值以及背根神经节中TNF-α表达的影响,研究椎间盘退变与神经根性疼痛之间的关系。方法72只大鼠随机分为4组:正常对照组(n=18)、假手术组(n=19)、正常髓核(N-NP)组(n=16)和退变髓核(P-NP)组(n=19)。对P-NP组大鼠利用尾椎椎间盘纤维环穿刺的方法建立椎间盘退变模型。分别取出N-NP组和P-NP组大鼠自体的正常髓核与退变髓核组织,置于手术显露后的腰5左侧神经根处,建立髓核突出致神经根性疼痛动物模型。采用行为学测试的方法分别观察各组大鼠术前1天,术后1、4、7、10、14、21天机械刺激阈值与热刺激阈值的变化;采用免疫组化方法分别检测术后第4、14天各组大鼠背根神经节中TNF-α的表达。结果行尾椎间盘纤维环穿刺后2周,组织学与MRI检查均证实椎间盘组织发生明显退变。对照组和假手术组动物未出现明显的痛觉过敏现象,N-NP组和P-NP组大鼠机械性刺激阈值均显著下降,该痛觉过敏现象持续至术后2周消失;与正常髓核组织相比,退变髓核所致机械性刺激阈值下降程度更为严重。各实验组均未发生热刺激阈值的规律性变化。术后第4、14天对照组和假手术组背根神经节中未见TNF-α明显表达,而正常及退变髓核组TNF-α表达量均显著升高。结论大鼠尾椎纤维环穿刺是建立大鼠椎间盘退变模型的一种有效方法。与正常髓核组织相比,发生退变的髓核组织可导致神经根性疼痛的加重,提示椎间盘退变过程中释放的炎症因子在疼痛的发生机制中可能起到了重要作用。     

TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察

目的探讨TGF-β3基因修饰后退变髓核细胞生物学效应以及植入兔退变椎间盘后对退变椎间盘的影响。方法将重组腺病毒载体Ad-TGF-β3与第2代退变髓核细胞按10∶1比例混合培养转染(Ad-TGF-β3组),待细胞融合后传代,MTT检测转染细胞增殖活性,Western blot检测TGF-β3蛋白含量,免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率;采用病毒空载体转染髓核细胞(Adv组)和未经转染髓核细胞(空白组)作为对照。取30只新西兰兔,体重3.2～3.5 kg,雌雄不限,通过针刺L3、4、L4、5和L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型。将实验动物按照随机数字法分为3组,转染细胞组(A组,n=12)、退变细胞组(B组,n=12)和空白对照组(C组,n=6)。A、B组将100μL浓度为1×105个/mL对应细胞悬液注射入退变椎间盘,C组同法注入等量PBS。注射后6、10、14周取A、B组各4只、C组2只实验动物处死,取L3、4、L4、5和L5、6椎间盘行组织学观察,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达。结果 Ad-TGF-β3转染后髓核细胞活性明显改善;转染后3、7、14 d,TGF-β3在髓核细胞内表达逐渐升高;Ad-TGF-β3组髓核细胞细胞质内见棕黄色Ⅱ型胶原阳性染色,阳性率显著高于Adv组及空白组(P<0.05)。组织学观察示,A组椎间盘退变程度较B、C组明显减轻。6、10、14周A组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达显著高于B、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物活性,转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。     

1-磷酸鞘氨醇受体在不同退变程度髓核组织中的表达变化

目的 :比较不同退变程度人椎间盘髓核组织中3种1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR1/2/3)表达水平的差异,探讨椎间盘中S1PR表达水平与椎间盘退变的关系。方法:收集腰椎间盘退行性病变患者手术切除的椎间盘组织,其中轻度退变(Pfirrmann分级Ⅳ级)22例,严重退变(Pfirrmann分级Ⅴ级)14例;同时取6例无椎间盘退变患者(单纯腰椎椎体骨折,Pfirrmann分级Ⅱ级)手术切除的椎间盘组织作为对照组;通过HE染色以及Saf-O染色观察不同退变程度椎间盘的组织学变化,免疫组化检测不同退变程度组织中的S1PR表达水平;Ⅱ型胶原酶消化分离提取原代髓核细胞,通过Real-time PCR、Western-bolt检测不同退变程度椎间盘髓核细胞中S1PR的表达水平,并通过细胞免疫化学方法对S1PR进行定位。结果:HE染色及Saf-O染色结果显示退变椎间盘的纤维环出现破损,髓核细胞形成明显的集落,细胞外基质减少。免疫组化结果显示正常和轻度退变的髓核组织中3种受体(S1PR1/2/3)都有表达,严重退变的组织中表达极弱;Real-time PCR结果显示对照组髓核细胞中S1PR1/2/3的m RNA表达水平分别是严重退变组的5.34±0.52倍、7.25±0.04倍、1.92±0.06倍,轻度退变组S1PR1/2/3的m RNA表达水平分别是严重退变组的4.35±2.45倍、4.96±3.44倍、2.19±0.82倍;Western-blot发现对照组和轻度退变组髓核细胞中S1PR1/2/3均有表达,严重退变组表达水平较低;免疫细胞化学显示S1PR主要集中在髓核细胞的细胞质和细胞膜上。结论:髓核组织中主要表达S1PR1/2/3,在严重退变的髓核组织和细胞中其表达水平明显下降,S1P及其受体可能参与椎间盘髓核组织的退变过程。     

基质细胞衍生因子-1在人正常和退变椎间盘中的表达、分布及意义

目的:比较人正常和退变椎间盘髓核中央区、髓核与纤维环交界区、纤维环外层、纤维环内层及软骨终板5个相邻部位的基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)的表达情况,探讨退变椎间盘SDF-1的表达在上述五个相邻部位是否具有差异.方法:获取20例腰椎间盘突出症患者的椎间盘(L4/5,病理证实为退变椎间盘组织),并纳入退变组;7例急性腰椎爆裂骨折患者的椎间盘(L3/4)及3例脊柱侧凸患者的椎间盘(L2/3,病理证实为正常椎间盘组织),纳入正常组.HE染色观察两组椎间盘的组织学结构,免疫组织化学、Western-blot、rt-PCR检测椎间盘髓核中央区、髓核与纤维环交界区、纤维环内层、纤维环外层及软骨终板5个部位的SDF-1表达情况及分布,并将退变椎间盘上述5个部位的SDF-1免疫组化积分光密度值与供者年龄、椎间盘Thompson分级作相关分析.结果:正常组的上述5个部位SDF-1免疫组化积分光密度值分别为420.87±89.93、407.80±100.76、380.02±85.05、342.89±63.76、344.06±88.97;Western-blot灰度比值分别为0.08±0.03、0.08±0.05、0.07±0.04、0.05±0.03、0.05±0.02;rt-PCR灰度比值分别为0.22±0.06、0.22±0.05、0.20±0.04、0.20±0.04、0.20±0.04.退变组上述5个部位SDF-1免疫组化积分光密度值分别为7355.13±2271.74、5959.58±2436.23、5397.49±3044.80、1605.44±825.31、361.91±104.22; Western-blot灰度比值分别为0.55±0.29、0.52±0.28、0.42±0.18、0.21±0.12、0.06±0.04;rt-PCR灰度比值分别为0.75±0.30、0.71±0.26、0.55±0.22、0.36±0.17、0.22±0.13.退变椎间盘5个部位的SDF-1表达均高于正常组(P＜0.05),且SDF-1表达量髓核中央区＞纤维环内层＞纤维环外层＞软骨终板,差异有统计学意义(P＜0.05),而髓核中央区和髓核与纤维环交界区比较无统计学差异(P＞0.05);退变椎间盘上述5个部位的SDF-1表达与椎间盘Thompson分级、年龄呈正相关性(P＜0.05).结论:SDF-1广泛表达于退变和正常的椎间盘中,其表达在退变椎间盘中上述5个相邻部位存在差异.     

外源性肿瘤坏死因子-α诱发兔椎间盘退变中β-catenin蛋白的表达及意义

目的 通过外源性肿瘤坏死因子(TNF)-α注射构建兔椎间盘退变动物模型,探讨该模型中β-catenin蛋白的表达及意义和炎性细胞因子在促进腰椎间盘退变过程中Wnt/β-catenin信号通路的作用.方法 选取12只健康成年日本白兔,雌雄随机,体质量2.5～3.0kg.手术暴露L2～5 3个间隙共36个椎间盘.随机分为4组,分别注入生理盐水、TNF-α 5 ng、TNF-α 10ng、TNF-α 20 ng,于术后第8周统一处死,取椎间盘髓核组织作苏木素-伊红(HE)-番红O染色病理切片进行形态学观察;各组分别随机选取4个椎间盘髓核组织标本,采用蛋白印迹法(Western blot)测定β-catenin蛋白含量并比较各组间差异.结果 HE-番红O染色病理切片显示,在5、10、20 ng组椎间盘组织中髓核细胞数量减少,正常网状结构破坏,细胞形态发生改变,出现肥大空泡样软骨细胞,组织基质蛋白聚糖含量明显降低,番红O淡染,生理盐水对照组椎间盘形态基本正常,无退变发生.蛋白印迹结果显示β-catenin蛋白含量在注射TNF-α组明显增加,各组吸光度比值分别为:0.142±0.036、0.351±0.041、0.472±0.052和0.710±0.063,组间差异有统计学意义(P＜0.05)且与TNF-α浓度相关.结论 通过外源性TNF-α盘内注射能够成功构建兔椎间盘退变动物模型,且退变程度与TNF-α呈浓度依赖性;在退变模型髓核组织中β-catenin蛋白含量增高且与TNF-α浓度正相关,提示炎症细胞因子触发了Wnt/β-catenin信号通路,在椎间盘退变过程中可能发挥了重要作用.     

促炎因子与抗炎因子在突出腰椎间盘组织中的表达及其意义

目的观察促炎因子白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α及抗炎因子白介素(IL)-4在退变椎间盘组织内的表达,并探讨其意义。方法收集30例单节段椎间盘突出症患者及10例经前路松解手术的特发性脊柱侧弯患者的髓核组织,术前患者临床症状严重程度均予Oswestry功能障碍指数(ODI)评定,23例行MRI检查的患者,根据Schneiderman分级评定椎间盘退变程度,术后应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定髓核组织中IL-6、TNF-α和IL-4的含量。结果退变髓核中IL-6的含量(11.2±7.5)ng/L较对照组(6.4±0.8)ng/L高(P<0.01)、TNF-α的含量(186.8±86.0)ng/L亦较对照组(122.3±23.5)ng/L高(P<0.05);IL-4的表达仅存在于TNF-α表达较高的髓核组织中;IL-6及TNF-α的同时表达与ODI评分高低正相关(IL-6:B=0.481,β=0.229,P<0.05;TNF-α:B=6.945E-2,β=0.522,P<0.01);椎间盘退变MRI分级与促炎因子和抗炎因子的高低无明显相关。结论促炎因子TNF-α与IL-6的表达增高为椎间盘退变的重要原因,亦为临床症状加重的重要原因之一;促炎因子与抗炎因子表达的不平衡亦可能为椎间盘退变进展的重要因素。     

雌激素受体在椎间盘组织中的表达及意义

【摘要】 目的：通过观察雌激素α、β受体在正常与退变的人椎间盘组织的表达,探讨雌激素受体（ER）与椎间盘退变的关系。方法：根据改良Pfirrmann分级将收集的椎间盘组织分为三组：对照组,外伤导致腰椎爆裂性骨折手术取出的正常髓核组织（Pfirrmann分级1~2级）;观察组,女性腰椎滑脱及腰椎间盘突出症手术取出的退变髓核组织,Pfirrmann分级3～4级为A组,5级为B组。用HE染色法观察对照组和A、B组各15例人腰椎椎间盘髓核组织及髓核细胞的形态学变化;用免疫组织化学染色法（Elivison二步法）检测对照组和A、B组髓核组织中ER-α、ER-β的表达;采用Western-blot法检测对照组和观察组髓核组织中ER-α、ER-β的表达。结果：HE染色示对照组髓核组织中髓核细胞分布均匀,形态完整,未见明显细胞凋亡现象,细胞外基质染色鲜亮,分布均匀;A、B两组髓核细胞分布不均匀,形态不规则,凋亡现象明显,细胞核增大,染色深,细胞外基质减少,色彩灰暗,B组较A组更为明显。免疫组织化学染色示ER-α、ER-β在对照组的髓核组织见有明显棕黄色颗粒,在A、B两组表达减少,以ER-β减少最显著,经统计学分析,A、B两组与对照组间ER-β的表达有显著性差异（P＜0.01）,ER-α的表达较对照组无统计学差异（P＞0.05）,其中A组和B组间无明显差异（P＞0.05）。Western-blot方法检测,ER-α表达A组（0.876±0.058）、B组（0.757±0.045）较对照组（0.885±0.036）降低,但无统计学差异（P>0.05）;ER-β表达A组（0.947±0.043）、B组（0.626±0.042）较对照组（1.275±0.150）显著降低（P＜0.01）,B组较A组表达明显减少（P＜0.01）。结论：在人的髓核组织中的髓核细胞（类软骨细胞）的胞核和胞浆中均存在ER。ER-α、ER-β在退变的椎间盘组织都明显减少,以ER-β最为明显,提示雌激素可能通过ER-β的介导对髓核细胞功能起调控作用。     

重组腺相关病毒2介导hTGF-β_1基因体内转染兔退变髓核细胞对蛋白多糖含量的影响

目的应用重组腺相关病毒2(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)介导hTGF-β1基因体内转染兔退变椎间盘髓核细胞,观察基因产物的表达及其对退变髓核细胞蛋白多糖合成的生物调节作用。方法于24只成年新西兰大白兔,雌雄不限,体重1.7～2.2kg,L1、2、L2、3、L3、4、L4、5椎间盘注射25μL浓度为1mmol/L的纤维结合素片段(fi bronectin fragment,Fn-f)制备椎间盘退变模型,注射Fn-f4周时的造模椎间盘模拟早期退变的椎间盘。将24只兔随机分为3组(n=8),A、B、C组分别于造模椎间盘髓核内注射25μL rAAV2-hTGF-β1(1×1012vg/mL)、rAAV2-增强绿色荧光蛋白(enhanced green?uorescent protein,EGFP,rAAV2-EGFP)、PBS。术后1周A、C组各处死2只兔,取髓核组织采用免疫组织化学染色观察hTGF-β1的表达;术后4、8、12周每组取2只兔髓核组织,35S整合分析法检测新合成蛋白多糖的含量;术后12周处死B组2只兔,荧光显微镜观察髓核组织中EGFP的表达。结果术后1周,免疫组织化学染色示A组髓核细胞及基质中广泛存在强阳性染色颗粒,C组仅存在少量阳性颗粒。35S整合法检测示,各时间点A组35S蛋白多糖合成率均高于B、C组,比较差异有统计学意义(P0.05);B、C组间比较差异无统计学意义(P0.05)。术后12周,荧光显微镜下观察B组盘髓核组织可见大量绿色荧光表达。结论新型基因转导载体rAAV2可有效介导hTGF-β1基因体内转染兔退变髓核细胞,基因产物可持续表达超过12周,hTGF-β1可有效促进退变髓核细胞蛋白多糖的合成。     

水通道蛋白1在不同程度退变腰椎间盘中的表达及意义

目的 观察水通道蛋白1在退变腰椎间盘组织中的表达变化,研究其与椎间盘退变的关系。方法 实验组取材于经手术治疗腰椎间盘突出症患者椎间盘标本30例,突出型、脱出型、游离型各10例;对照组取材于腰椎损伤致椎体骨折患者切除椎间盘10例。应用免疫组织化学法检测水通道蛋白1在椎间盘组织中的表达。结果 （1）苏木精-伊红染色显示,对照组椎间盘组织仍保持着致密的板层结构,实验组椎间盘组织多呈纤维化样改变。（2）各组髓核细胞中水通道蛋白1表达均明显高于同组纤维环细胞中的表达(P≤0.01)。（3）实验组突出型椎间盘标本髓核及纤维环细胞中水通道蛋白1表达明显低于对照组(P＜0.01),脱出型和游离型椎间盘标本中水通道蛋白1表达明显低于突出型 (P＜0.01)。结论 水通道蛋白1随着椎间盘突出、脱出、游离不同程度退变,表达呈逐渐下降趋势。     

大鼠退变椎间盘中环氧化酶-2、缺氧诱导因子-1α的表达及其与血管生成的关系

目的探讨环氧化酶-2(COX-2)与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在退变的大鼠椎间盘的表达相关性,以及它们与椎间盘内新生毛细血管生成的相关性。方法选取3个月龄的大白鼠20只,随机分为实验组与对照组。将实验组10只大鼠手术切除腰1-骶1棘突、关节突,棘上、棘间韧带,切断双侧竖棘肌,然后缝合切口。对照组不行手术。12周后,处死所有大鼠,立即取L4-5椎间盘。通过免疫组化方法检测两组实验动物椎间盘中COX-2、HIF-1α表达情况及微血管的密度(MVD)。并通过统计分析描述COX-2与HIF-1α之间的关系及它们分别与椎间盘微血管密度(MVD)之间的关系。结果实验组的髓核中HIF-1α、COX-2阳性细胞率明显增高,在对照组的髓核组织中极少出现阳性细胞。此外,实验组椎间盘中的微血管密度明显增加。用直线相关分析表明,实验组动物椎间盘髓核组织内HIF-1α、COX-2之间呈显著正相关关系(P<0.05,r=0.678)。经多元线性回归分析实验组椎间盘髓核组织中MVD值与HIF-1α的表达之间和MVD与COX-2的表达之间具有相关性(P均<0.05)。结论 1.大鼠椎间盘退变过程中HIF-1α、COX-2的表达有相互促进作用;2.退变椎间盘的MVD值与HIF-1α及COX-2的高表达具有相关关系。