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1.
病毒胸苷激酶基因治疗人胃癌的实验研究 总被引:4,自引:0,他引:4
为观察单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)基因治疗系统对胃癌细胞的杀伤作用,将HSV-TKcDNA定向克隆入逆转录病毒载体pDOR-neo中,用LIPOFECTAMINE法将该HSV-TK基因转染胃癌细胞系SGC-7901,测定阳性转染细胞(SGC-7901/TK)在体内外对GCV的敏感性。结果示GCV在体外对SGC-7901/TK细胞有明显的杀伤作用,其作用呈现剂量和时间依赖性特点,且同时表现出对周围亲代SGC-7901细胞的杀伤效应(旁观者效应)。体内实验表明GCV可抑制HSV-TK阳性胃癌细胞的生长,使已形成的肿瘤逐渐消失。提示逆转录病毒载体介导的HSV-TK基因转移胃癌细胞,配合以GCV治疗,是胃癌基因治疗的又一途径。 相似文献
2.
逆转录病毒介导单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因治疗胰腺癌的实验研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 探讨应用逆转录病毒载体介导单纯疮疹病毒-胸苷激酶(herpes simplex virus type Ⅰthymidine kinase gene,HSV-TK)基因治疗实验性人胰腺癌细胞系8988的价值。方法 HSV-TK被定向克隆入逆转录病毒载体pMNDM的DV40下游。重组逆转录病毒包装细胞PA317细胞,产生的重组病毒将HSV-TK转入人胰腺癌细胞系8988细胞内。结果 Sorthern blot试验及药敏试验均证实HSV-TK基因已整合至细 相似文献
3.
逆转录病毒介导的HSV-tk/GCV对肝癌细胞的影响 总被引:3,自引:0,他引:3
目的观察单纯疮疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因治疗系统在体内外对人肝癌的杀伤效应。方法构建携带HSV-tk基因的逆转录病毒载体,将该重组逆转录病毒感染人肝癌细胞HCC9204,筛选稳定表达tk的细胞克隆HCC9204/tk,并测定其在体外对GCV的敏感性;HCC9204/tk细胞在裸鼠皮下成瘤,用GCV治疗并观察疗效。结果GCV在体外对HCC9204/tk细胞有明显的杀伤作用和旁杀伤效应,裸鼠体内exvivo实验得到相似结果,在体内外对未转染细胞则无明显毒性.结论在invitro水平(指完全体外)和exvivo水平(指一部分体外一部分体内),表达HSV-tk基因的肿瘤细胞均可被GCV有效杀伤,逆转录病毒介导的HSV—tk/GCV自杀基因治疗系统有可能成为肝癌的有效治疗方法。 相似文献
4.
用中性红吸收分析法和放射配体结合法分析基因重组干扰素-α(rIFN-α)对胃癌细胞(SGC7901、KATOⅢ)增殖及其表皮生长因子受体(EGF-R)表达的影响。结果显示rIFN-α可明显抑制SGC7901细胞增殖,与作用时间、剂量相关,而对KATOⅢ增殖无明显抑制作用。采用氯胺T法自行标记表皮生长因子(EGF),配体结合实验Scatchard分析结果SGC7901、KATOⅢ均高表达单一亲和性的EGF-R。rIFN-α降低SGC7901细胞EGF-R数量,与作用时间、剂量相关,EGF-R亲和性无变化,而对KATOⅢ细胞EGF-R的数量及亲和性均无明显影响。结果提示rIFN-α抑制胃癌细胞生长可能和其下调细胞EGF-R相关。 相似文献
5.
1.材料与方法:乳哺动物细胞表达载体pBK-CMV,长约4.5kb,带有T_7公用序列。pCP10是pBR322EcoRI位点中插入双拷贝头尾相接的HBVayw亚型全基因HBVDNA重组质粒。PCR引物XI1:1428-1448nt5'CGT CCCGTC GGCGCTGAATCC3',XI_2:1672-1653nt5'AGTCCAAGAGTCCTCTTAAG3'。人肝癌细胞系SMMC-7721,出上海细胞所提供。将EcoRI酶切后回收的全基因HBV片段。在T_4DNA连接酶作用下,与EcoRI酶切… 相似文献
6.
白细胞介素12对小鼠肝癌基因治疗的实验研究 总被引:4,自引:0,他引:4
目的:研究白细胞介素12对小鼠肝癌细胞基因治疗效果。方法:利用脑心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰质炎(Po-lio)病毒内核糖体进入位点(IRES),连接mIL-12 P40及p35 cDNAs和筛选基因新霉术磷酸转移酶(NeoR),克隆至逆转录病毒载体pGCEN中,使三个基因同时受逆转录病毒载体5’端LTR启动子控制,转录至同一mRNA转录本上,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体,即pGCEN/mIL-12。在LipofectAMINE介导下将pGCEN/mIL-12转染包装细胞PA317,G418筛选,直至出现阳性克隆(命名为:M45/mIL-12),挑取抗性克隆,扩大培养,收集上清,用小鼠成纤维细胞NIH3T3测定病毒滴度。然后用重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li,G418筛选,直至出现阳性克隆,扩大培养,对阳性克隆进行鉴定。将60Co照射(60 Gy)M45/mIL-12细胞对荷瘤小鼠进行瘤内接种,每周一次,连续治疗三次,观察其治疗效果。结果:病毒上清中重组逆转录病毒滴度为5×10~5CFU/ml。 PCR及RT-PCR证明外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中,以及外源基因在mRNA水平上的表达。 相似文献
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目的 进一步研究丙型肝炎病毒5‘NCR对结构蛋白编码基因的表达调控。方法 以拼接好的HCV5’NCR〈C,E1和E2/NS1区基因共长2547个核苷酸片段克隆于逆转录病毒载体LNSX得重组体pLHC2547,用聚合酶锭反应(PCR)及核苷酸序列分析等方法对重组体进行鉴定。通过磷酸钙-DNA共沉淀法把经鉴定的重组体转染入PA317细胞,用G41进行克隆筛选,以NIH3T3细胞测其病毒滴度,提取转染细 相似文献
8.
目的:在自发型高血压和正常血压的Vistar-kyoto大鼠血管壁平滑肌细胞(SHR-VSMC和WKY-VSMC),比较几种内源性生长因子及它们受体的表达水平,从VSMC自分泌和旁分泌产生骨源性生长因子的角度,阐述SHR-VSMC和WKY-VSMC的差异。方法:以定量RT-PCR技术,在二株系VSMC,检测长型PDGF-A ,TGFβ1及它的受体mRNA的表达水平。结果:(1)在SHR-VSMC, 相似文献
9.
本实验将人的尿激酶原(Pro-UK)cDNA导人体外培养的胎牛主动脉内皮细胞(EC),得到了表达该基因的转化细胞,以期覆盖血管内支架或小口径人工血管(<4mm)等移植物达到防止血栓形成,提高移植物通畅率的目的。利用磷酸钙盐沉淀法将重组逆转录病毒载体pN2-CMV·UK导人包装细胞PA317,获得了含有重组逆转录病毒(Pro-UKRNA序列)的培养上滑。用机械刮取胎牛主动脉内腔面分离EC,进行常规培养。用重组逆转录病毒感染7代以内的牛EC,并经G4l8筛选得到抗性细胞。Southernblot分析表明ProUKcDNA已整合进EC基因组。以鼠抗人的Pro-UK单克隆抗体为一抗,作细胞免疫组化分析(L5A8法),抗性细胞胞浆中出现阳性棕色颗粒,对照细胞为阴性结果。溶圈实验测得尿激酶原分泌量约为23U/106细胞/24小时。上述结果证明人Pro-UKcDNA已整合入牛EC基因组,表达产物具有免疫活性和纤溶酶原激活作用。 相似文献
10.
汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 总被引:1,自引:0,他引:1
薛小平 《中国人兽共患病杂志》1999,15(2):1A-ChenS1
本文采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增了汉坦病毒陈株的S基因的编码区序列,克隆入真核表达载体PCMV4,构建了可表达汉坦病毒S基因的真核表达载体PCMV4-ChenS1.3。用电穿孔法转染COS-7细胞,免疫荧光和ELISA检测表明,目的基因在COS-7细胞中获得瞬时表达。 相似文献
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乙型肝炎病毒-S基因重组逆转录病毒载体诱导小鼠体液和细胞免疫反应 总被引:1,自引:3,他引:1
探索逆转录病毒载体在基因治疗乙型肝炎中的应用。方法用DNA重组技术构建HBV-S基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染PA317后,用假病毒颗粒感染HepG2、P815和EL-4细胞,并进行基因免疫。结果HBV-S基因在上述细胞获得高效表达,在免疫动物体内产生高滴度抗一HBS及有效的CTL反应。结论该载体肌肉注射后有效激发对HBsAde异性的体液免疫及细胞免疫反应,在细胞内稳定表达,是一种高效的基因转移系统,适用于基因治疗试验。 相似文献
12.
目的进一步研究丙型肝炎病毒5′NCR对结构蛋白编码基因的表达调控。方法以拼接好的HCV5′NCR,C,E1和E2/NS1区基因共长2547个核苷酸片段克隆于逆转录病毒载体LNSX得重组体pLHC2547,用聚合酶链反应(PCR)及核苷酸序列分析等方法对重组体进行鉴定。通过磷酸钙-DNA共沉淀法把经鉴定的重组体转染入PA317细胞,用G418进行克隆筛选,以NIH3T3细胞测其病毒滴度。提取转染细胞DNA及培养上清RNA分别用PCR和逆转录PCR进行鉴定。结果培养上清的病毒滴度为2×105CFU/ml,PCR及逆转录PCR(RT-PCR)分别可以从转染的细胞DNA及培养上清中扩增出HCV的基因片段。结论目的基因已整合到细胞的基因组中并得以表达 相似文献
13.
构建了人白细胞介素-2(IL-2)基因重组逆转录病毒表达载体pZIPhulL-,以DNA-磷酸钙共沉淀技术转染包装细胞系PA317,以G418筛选,得到分泌假病毒颗粒滴度达到106CFU/ml的细胞克隆。以8为感染倍数感染2.2.15细胞系,IL-2分泌表达水平为6I/m1,可显著抑制HBsAg的分泌表达,对HBeAg也有一定的抑制作用。但不含IL-2基因的逆转录病毒载体pZIPSV(X)的假病毒颗粒感染2.2.15细胞以后对乙肝病毒无显著影响。以6IU/ml的重组人IL-2也不能抑制HBsAg及HBeAg的表达。在细胞水平上,实现了人IL-2转基因表达及抗乙肝病毒的基因治疗。 相似文献
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敲除AT1a基因对血管紧张素II受体介导的信号传导作用 总被引:2,自引:0,他引:2
目的研究敲除血管紧张素Ⅱ受体亚型(AT1a)基因对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)信号传导的影响,明确AT1a在血管功能调节中的作用。方法应用缺乏AT1a基因小鼠的主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),采用钙荧光分析技术,观察G蛋白受体偶联和酪氨酸激酶相关的钙离子信号传导通路的变化。结果敲除AT1a基因,并不影响AngⅡ介导的VSMC钙增加,应用G蛋白拮抗剂和酪氨酸激酶抑制剂均能显著抑制AngⅡ反应。结论敲除AT1a基因,其他AT1受体亚型能起明显的代偿作用,AT1a受体亚型受G蛋白和酪氨酸激酶信号传导通路共同调节。 相似文献
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日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶DNA疫苗的研究及其保 … 总被引:11,自引:0,他引:11
本文对大陆株日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶(Sj26GST)的DNA疫苗进行研究,并观察了其免疫保护效果。分别构建含Sj26GST基因的重组质粒pCD-Sj26和pBK-Sj26,采用脂质体介导的基因转移将pCD-Sj26和pBK-Sj26分别导入NIH3T3成纤维细胞,用免疫荧光法(IFA)证实Sj26GST在真核细胞中的表达。分别将pCD-Sj26和pBK-Sj26及pBK-CMV肌注 相似文献
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细胞因子对树突状细胞抗肝癌作用的影响 总被引:6,自引:6,他引:0
目的研究人血树突状细胞(DC)和细胞因子TNF,GMCSF或IFNγ联合DC对淋巴因子和PHA激活的杀伤细胞(LPAK细胞)体外杀伤人肝癌细胞株BEL7402的影响.方法实验分为L组(LPAK),D组(LPAK+DC),T1组(LPAK+DC+TNF5000kU/L),T2组(LPAK+DC+TNF500kU/L),G1组(LPAK+DC+GM-CSF500kU/L),G2组(LPAK+DC+GM-CSF100kU/L),I1组(LPAK+DC+IFNγ500kU/L)和I2组(LPAK+DC+IFNγ100kU/L).每组效靶细胞比分别采用5∶1和10∶1两种.培养48h后用中性红比色法检测细胞毒活性.结果L,D,T2和T1组的细胞毒活性依次增强,各组间差异有显著性(P<001).G1和G2组均高于D组(P<001),但G1,G2组间差异无显著性.I1,I2组与D组相比,也无显著性差异.随效靶比增加,各组细胞毒活性均相应增强.结论DC能增强LPAK细胞对肝癌细胞BEL7402的细胞毒活性;TNF或GMCSF与DC联用,两者有协同作用;但与IFNγ联用,则无进一步增强作用 相似文献
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高龄慢性淋巴细胞白血病伴多发性骨髓瘤细胞的克隆来源 总被引:2,自引:0,他引:2
为进一步研究,慢性淋巴细胞白血病(CLL)伴多发性骨髓瘤(MM)细胞的克隆来源。报告1例高龄CLL合并MM的病例,结合临床形态学特征,用单克隆抗体,免疫球蛋白(Ig)基因和T-细胞受体(TCR)γ做标志,分析其恶性细胞的克隆来源。经过骨髓和外周血IgH重排基因的单链构象多态性(SSCP)指纹图谱以及异源双链形成法(HDF)分析发现,尽管CLL细胞和MM细胞的形态学特征不同,分泌IgM和IgA两种不同的免疫球蛋白,但是外周血和骨髓都能够用聚合酶链反应获得同样长度的Ig重链基因的V-D-J基因重排片段,都没有TCRγ基因的重排。SSCP指纹图谱和HDF法分析Ig基因序列特征显示CLL和MM细胞的V-D-J重排片段序列是一致的。说明其CLL和MM来源于同一个B-淋巴系统的祖细胞。 相似文献
18.
目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中nm23-H1基因的存在状况及其转录表达水平,分析肺癌恶性转移与该基因异常的关系。方法采用PCR-SSCP和半定量RT-PCR方法,以正常癌旁组织及正常肺组织为对照,观察了31例原发性NSCLC中nm23-H1基因的突变和mRNA表达情况。结果31例肺癌中未发现1例存在nm23-H1基因突变。在20例具淋巴结转移的NSCLC中nm23-H1基因mRNA表达降低14例(14/20),明显高于未发生淋巴转移的非小细胞肺癌(3/11)(P<0.05)。结论以上结果显示,nm23-H1为一种可在肺癌转移过程中发挥负调节作用的转移抑制基因,该基因表达水平可望作为一个肺癌转移的预测因子。 相似文献
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在大肠杆菌中高效表达人I型免疫缺陷病毒p24蛋白 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 表达人I型免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白p24,为制备抗p24单克隆抗体及其诊断抗原奠定基础。方法 将编码HIV-1p24蛋白的p24^gag基因片段,克隆到原核表达载体pET-17b的T7噬菌体启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠肝菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,表达产物以SDS-PAGE,Westernblotting及点免疫印迹分析,结果 构建成功重组表达质粒pET24经I 相似文献