病毒胸苷激酶基因治疗人胃癌的实验研究

为观察单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）基因治疗系统对胃癌细胞的杀伤作用，将ＨＳＶ－ＴＫｃＤＮＡ定向克隆入逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，用ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ法将该ＨＳＶ－ＴＫ基因转染胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１，测定阳性转染细胞（ＳＧＣ－７９０１／ＴＫ）在体内外对ＧＣＶ的敏感性。结果示ＧＣＶ在体外对ＳＧＣ－７９０１／ＴＫ细胞有明显的杀伤作用，其作用呈现剂量和时间依赖性特点，且同时表现出对周围亲代ＳＧＣ－７９０１细胞的杀伤效应（旁观者效应）。体内实验表明ＧＣＶ可抑制ＨＳＶ－ＴＫ阳性胃癌细胞的生长，使已形成的肿瘤逐渐消失。提示逆转录病毒载体介导的ＨＳＶ－ＴＫ基因转移胃癌细胞，配合以ＧＣＶ治疗，是胃癌基因治疗的又一途径。     

逆转录病毒介导单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因治疗胰腺癌的实验研究

目的 探讨应用逆转录病毒载体介导单纯疮疹病毒－胸苷激酶（herpes simplex virus type Ⅰthymidine kinase gene,ＨＳＶ－ＴＫ）基因治疗实验性人胰腺癌细胞系８９８８的价值。方法 ＨＳＶ－ＴＫ被定向克隆入逆转录病毒载体pＭＮＤＭ的ＤＶ４０下游。重组逆转录病毒包装细胞ＰＡ３１７细胞,产生的重组病毒将ＨＳＶ－ＴＫ转入人胰腺癌细胞系８９８８细胞内。结果 Ｓorthern blot试验及药敏试验均证实ＨＳＶ－ＴＫ基因已整合至细     

逆转录病毒介导的HSV-tk/GCV对肝癌细胞的影响

目的观察单纯疮疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）自杀基因治疗系统在体内外对人肝癌的杀伤效应。方法构建携带ＨＳＶ－ｔｋ基因的逆转录病毒载体,将该重组逆转录病毒感染人肝癌细胞ＨＣＣ９２０４,筛选稳定表达ｔｋ的细胞克隆ＨＣＣ９２０４／ｔｋ,并测定其在体外对ＧＣＶ的敏感性;ＨＣＣ９２０４／ｔｋ细胞在裸鼠皮下成瘤,用ＧＣＶ治疗并观察疗效。结果ＧＣＶ在体外对ＨＣＣ９２０４／ｔｋ细胞有明显的杀伤作用和旁杀伤效应,裸鼠体内ｅｘｖｉｖｏ实验得到相似结果,在体内外对未转染细胞则无明显毒性．结论在ｉｎｖｉｔｒｏ水平（指完全体外）和ｅｘｖｉｖｏ水平（指一部分体外一部分体内）,表达ＨＳＶ－ｔｋ基因的肿瘤细胞均可被ＧＣＶ有效杀伤,逆转录病毒介导的ＨＳＶ—ｔｋ／ＧＣＶ自杀基因治疗系统有可能成为肝癌的有效治疗方法。     

rIFN－a对胃癌细胞表皮生长因子受体表达的调节

用中性红吸收分析法和放射配体结合法分析基因重组干扰素－α（ｒＩＦＮ－α）对胃癌细胞（ＳＧＣ７９０１、ＫＡＴＯⅢ）增殖及其表皮生长因子受体（ＥＧＦ－Ｒ）表达的影响。结果显示ｒＩＦＮ－α可明显抑制ＳＧＣ７９０１细胞增殖，与作用时间、剂量相关，而对ＫＡＴＯⅢ增殖无明显抑制作用。采用氯胺Ｔ法自行标记表皮生长因子（ＥＧＦ），配体结合实验Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析结果ＳＧＣ７９０１、ＫＡＴＯⅢ均高表达单一亲和性的ＥＧＦ－Ｒ。ｒＩＦＮ－α降低ＳＧＣ７９０１细胞ＥＧＦ－Ｒ数量，与作用时间、剂量相关，ＥＧＦ－Ｒ亲和性无变化，而对ＫＡＴＯⅢ细胞ＥＧＦ－Ｒ的数量及亲和性均无明显影响。结果提示ｒＩＦＮ－α抑制胃癌细胞生长可能和其下调细胞ＥＧＦ－Ｒ相关。     

HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达

１．材料与方法：乳哺动物细胞表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ,长约４．５ｋｂ,带有Ｔ_７公用序列。ｐＣＰ１０是ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ位点中插入双拷贝头尾相接的ＨＢＶａｙｗ亚型全基因ＨＢＶＤＮＡ重组质粒。ＰＣＲ引物ＸＩ１：１４２８－１４４８ｎｔ５'ＣＧＴ　ＣＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ３',ＸＩ_２：１６７２－１６５３ｎｔ５'ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧ３'。人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１,出上海细胞所提供。将ＥｃｏＲＩ酶切后回收的全基因ＨＢＶ片段。在Ｔ_４ＤＮＡ连接酶作用下,与ＥｃｏＲＩ酶切…     

白细胞介素12对小鼠肝癌基因治疗的实验研究

目的：研究白细胞介素１２对小鼠肝癌细胞基因治疗效果。方法：利用脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ）及脊髓灰质炎（Ｐｏ－ｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）,连接ｍＩＬ－１２ Ｐ４０及ｐ３５ ｃＤＮＡｓ和筛选基因新霉术磷酸转移酶（ＮｅｏＲ）,克隆至逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ中,使三个基因同时受逆转录病毒载体５’端ＬＴＲ启动子控制,转录至同一ｍＲＮＡ转录本上,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体,即ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２转染包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选,直至出现阳性克隆（命名为：Ｍ４５／ｍＩＬ－１２）,挑取抗性克隆,扩大培养,收集上清,用小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３测定病毒滴度。然后用重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,Ｇ４１８筛选,直至出现阳性克隆,扩大培养,对阳性克隆进行鉴定。将６０Ｃｏ照射（６０ Ｇｙ）Ｍ４５／ｍＩＬ－１２细胞对荷瘤小鼠进行瘤内接种,每周一次,连续治疗三次,观察其治疗效果。结果：病毒上清中重组逆转录病毒滴度为５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ。 ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ证明外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中,以及外源基因在ｍＲＮＡ水平上的表达。     

HCV5‘NCR和结构蛋白编码序列的克隆及对PA317细胞的转染

目的 进一步研究丙型肝炎病毒５‘ＮＣＲ对结构蛋白编码基因的表达调控。方法 以拼接好的ＨＣＶ５’ＮＣＲ〈Ｃ，Ｅ１和Ｅ２／ＮＳ１区基因共长２５４７个核苷酸片段克隆于逆转录病毒载体ＬＮＳＸ得重组体ｐＬＨＣ２５４７，用聚合酶锭反应（ＰＣＲ）及核苷酸序列分析等方法对重组体进行鉴定。通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法把经鉴定的重组体转染入ＰＡ３１７细胞，用Ｇ４１进行克隆筛选，以ＮＩＨ３Ｔ３细胞测其病毒滴度，提取转染细     

SHR血管平滑肌PDGF—A链,TGFβ1及其受体mRNA表达的研究

目的：在自发型高血压和正常血压的Ｖｉｓｔａｒ－ｋｙｏｔｏ大鼠血管壁平滑肌细胞（ＳＨＲ－ＶＳＭＣ和ＷＫＹ－ＶＳＭＣ）,比较几种内源性生长因子及它们受体的表达水平,从ＶＳＭＣ自分泌和旁分泌产生骨源性生长因子的角度,阐述ＳＨＲ－ＶＳＭＣ和ＷＫＹ－ＶＳＭＣ的差异。方法：以定量ＲＴ－ＰＣＲ技术,在二株系ＶＳＭＣ,检测长型ＰＤＧＦ－Ａ ,ＴＧＦβ１及它的受体ｍＲＮＡ的表达水平。结果：（１）在ＳＨＲ－ＶＳＭＣ,     

人尿激酶原cDNA在牛内皮细胞中的表达

本实验将人的尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）ｃＤＮＡ导人体外培养的胎牛主动脉内皮细胞（ＥＣ），得到了表达该基因的转化细胞，以期覆盖血管内支架或小口径人工血管（＜４ｍｍ）等移植物达到防止血栓形成，提高移植物通畅率的目的。利用磷酸钙盐沉淀法将重组逆转录病毒载体ｐＮ２－ＣＭＶ·ＵＫ导人包装细胞ＰＡ３１７，获得了含有重组逆转录病毒（Ｐｒｏ－ＵＫＲＮＡ序列）的培养上滑。用机械刮取胎牛主动脉内腔面分离ＥＣ，进行常规培养。用重组逆转录病毒感染７代以内的牛ＥＣ，并经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＰｒｏＵＫｃＤＮＡ已整合进ＥＣ基因组。以鼠抗人的Ｐｒｏ－ＵＫ单克隆抗体为一抗，作细胞免疫组化分析（Ｌ５Ａ８法），抗性细胞胞浆中出现阳性棕色颗粒，对照细胞为阴性结果。溶圈实验测得尿激酶原分泌量约为２３Ｕ／１０６细胞／２４小时。上述结果证明人Ｐｒｏ－ＵＫｃＤＮＡ已整合入牛ＥＣ基因组，表达产物具有免疫活性和纤溶酶原激活作用。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达

本文采用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了汉坦病毒陈株的Ｓ基因的编码区序列，克隆入真核表达载体ＰＣＭＶ４，构建了可表达汉坦病毒Ｓ基因的真核表达载体ＰＣＭＶ４－ＣｈｅｎＳ１．３。用电穿孔法转染ＣＯＳ－７细胞，免疫荧光和ＥＬＩＳＡ检测表明，目的基因在ＣＯＳ－７细胞中获得瞬时表达。     

乙型肝炎病毒-S基因重组逆转录病毒载体诱导小鼠体液和细胞免疫反应

探索逆转录病毒载体在基因治疗乙型肝炎中的应用。方法用ＤＮＡ重组技术构建ＨＢＶ－Ｓ基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染ＰＡ３１７后,用假病毒颗粒感染ＨｅｐＧ２、Ｐ８１５和ＥＬ－４细胞,并进行基因免疫。结果ＨＢＶ－Ｓ基因在上述细胞获得高效表达,在免疫动物体内产生高滴度抗一ＨＢＳ及有效的ＣＴＬ反应。结论该载体肌肉注射后有效激发对ＨＢｓＡｄｅ异性的体液免疫及细胞免疫反应,在细胞内稳定表达,是一种高效的基因转移系统,适用于基因治疗试验。     

HCV 5′NCR和结构蛋白编码序列的克隆及对PA317细胞的转染

目的进一步研究丙型肝炎病毒５′ＮＣＲ对结构蛋白编码基因的表达调控。方法以拼接好的ＨＣＶ５′ＮＣＲ，Ｃ，Ｅ１和Ｅ２／ＮＳ１区基因共长２５４７个核苷酸片段克隆于逆转录病毒载体ＬＮＳＸ得重组体ｐＬＨＣ２５４７，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及核苷酸序列分析等方法对重组体进行鉴定。通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法把经鉴定的重组体转染入ＰＡ３１７细胞，用Ｇ４１８进行克隆筛选，以ＮＩＨ３Ｔ３细胞测其病毒滴度。提取转染细胞ＤＮＡ及培养上清ＲＮＡ分别用ＰＣＲ和逆转录ＰＣＲ进行鉴定。结果培养上清的病毒滴度为２×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，ＰＣＲ及逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分别可以从转染的细胞ＤＮＡ及培养上清中扩增出ＨＣＶ的基因片段。结论目的基因已整合到细胞的基因组中并得以表达     

人白细胞介素－2基因表达载体的构建及抗乙肝病毒作用

构建了人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因重组逆转录病毒表达载体ｐＺＩＰｈｕｌＬ－，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染包装细胞系ＰＡ３１７，以Ｇ４１８筛选，得到分泌假病毒颗粒滴度达到１０６ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。以８为感染倍数感染２．２．１５细胞系，ＩＬ－２分泌表达水平为６Ｉ／ｍ１，可显著抑制ＨＢｓＡｇ的分泌表达，对ＨＢｅＡｇ也有一定的抑制作用。但不含ＩＬ－２基因的逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒感染２．２．１５细胞以后对乙肝病毒无显著影响。以６ＩＵ／ｍｌ的重组人ＩＬ－２也不能抑制ＨＢｓＡｇ及ＨＢｅＡｇ的表达。在细胞水平上，实现了人ＩＬ－２转基因表达及抗乙肝病毒的基因治疗。     

敲除AT1a基因对血管紧张素II受体介导的信号传导作用

目的研究敲除血管紧张素Ⅱ受体亚型（ＡＴ１ａ）基因对血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）信号传导的影响,明确ＡＴ１ａ在血管功能调节中的作用。方法应用缺乏ＡＴ１ａ基因小鼠的主动脉血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）,采用钙荧光分析技术,观察Ｇ蛋白受体偶联和酪氨酸激酶相关的钙离子信号传导通路的变化。结果敲除ＡＴ１ａ基因,并不影响ＡｎｇⅡ介导的ＶＳＭＣ钙增加,应用Ｇ蛋白拮抗剂和酪氨酸激酶抑制剂均能显著抑制ＡｎｇⅡ反应。结论敲除ＡＴ１ａ基因,其他ＡＴ１受体亚型能起明显的代偿作用,ＡＴ１ａ受体亚型受Ｇ蛋白和酪氨酸激酶信号传导通路共同调节。     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶DNA疫苗的研究及其保 …

本文对大陆株日本血吸虫２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）的ＤＮＡ疫苗进行研究，并观察了其免疫保护效果。分别构建含Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的重组质粒ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６，采用脂质体介导的基因转移将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６分别导入ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，用免疫荧光法（ＩＦＡ）证实Ｓｊ２６ＧＳＴ在真核细胞中的表达。分别将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６及ｐＢＫ－ＣＭＶ肌注     

细胞因子对树突状细胞抗肝癌作用的影响

目的研究人血树突状细胞（ＤＣ）和细胞因子ＴＮＦ,ＧＭＣＳＦ或ＩＦＮγ联合ＤＣ对淋巴因子和ＰＨＡ激活的杀伤细胞（ＬＰＡＫ细胞）体外杀伤人肝癌细胞株ＢＥＬ７４０２的影响．方法实验分为Ｌ组（ＬＰＡＫ）,Ｄ组（ＬＰＡＫ＋ＤＣ）,Ｔ１组（ＬＰＡＫ＋ＤＣ＋ＴＮＦ５０００ｋＵ／Ｌ）,Ｔ２组（ＬＰＡＫ＋ＤＣ＋ＴＮＦ５００ｋＵ／Ｌ）,Ｇ１组（ＬＰＡＫ＋ＤＣ＋ＧＭ－ＣＳＦ５００ｋＵ／Ｌ）,Ｇ２组（ＬＰＡＫ＋ＤＣ＋ＧＭ－ＣＳＦ１００ｋＵ／Ｌ）,Ｉ１组（ＬＰＡＫ＋ＤＣ＋ＩＦＮγ５００ｋＵ／Ｌ）和Ｉ２组（ＬＰＡＫ＋ＤＣ＋ＩＦＮγ１００ｋＵ／Ｌ）．每组效靶细胞比分别采用５∶１和１０∶１两种．培养４８ｈ后用中性红比色法检测细胞毒活性．结果Ｌ,Ｄ,Ｔ２和Ｔ１组的细胞毒活性依次增强,各组间差异有显著性（Ｐ＜００１）．Ｇ１和Ｇ２组均高于Ｄ组（Ｐ＜００１）,但Ｇ１,Ｇ２组间差异无显著性．Ｉ１,Ｉ２组与Ｄ组相比,也无显著性差异．随效靶比增加,各组细胞毒活性均相应增强．结论ＤＣ能增强ＬＰＡＫ细胞对肝癌细胞ＢＥＬ７４０２的细胞毒活性;ＴＮＦ或ＧＭＣＳＦ与ＤＣ联用,两者有协同作用;但与ＩＦＮγ联用,则无进一步增强作用     

高龄慢性淋巴细胞白血病伴多发性骨髓瘤细胞的克隆来源

为进一步研究，慢性淋巴细胞白血病（ＣＬＬ）伴多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞的克隆来源。报告１例高龄ＣＬＬ合并ＭＭ的病例，结合临床形态学特征，用单克隆抗体，免疫球蛋白（Ｉｇ）基因和Ｔ－细胞受体（ＴＣＲ）γ做标志，分析其恶性细胞的克隆来源。经过骨髓和外周血ＩｇＨ重排基因的单链构象多态性（ＳＳＣＰ）指纹图谱以及异源双链形成法（ＨＤＦ）分析发现，尽管ＣＬＬ细胞和ＭＭ细胞的形态学特征不同，分泌ＩｇＭ和ＩｇＡ两种不同的免疫球蛋白，但是外周血和骨髓都能够用聚合酶链反应获得同样长度的Ｉｇ重链基因的Ｖ－Ｄ－Ｊ基因重排片段，都没有ＴＣＲγ基因的重排。ＳＳＣＰ指纹图谱和ＨＤＦ法分析Ｉｇ基因序列特征显示ＣＬＬ和ＭＭ细胞的Ｖ－Ｄ－Ｊ重排片段序列是一致的。说明其ＣＬＬ和ＭＭ来源于同一个Ｂ－淋巴系统的祖细胞。     

非小细胞肺癌淋巴结转移与nm23-H_1基因突变及mRNA表达异常关系研究

目的观察非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）组织中ｎｍ２３－Ｈ１基因的存在状况及其转录表达水平，分析肺癌恶性转移与该基因异常的关系。方法采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和半定量ＲＴ－ＰＣＲ方法，以正常癌旁组织及正常肺组织为对照，观察了３１例原发性ＮＳＣＬＣ中ｎｍ２３－Ｈ１基因的突变和ｍＲＮＡ表达情况。结果３１例肺癌中未发现１例存在ｎｍ２３－Ｈ１基因突变。在２０例具淋巴结转移的ＮＳＣＬＣ中ｎｍ２３－Ｈ１基因ｍＲＮＡ表达降低１４例（１４／２０），明显高于未发生淋巴转移的非小细胞肺癌（３／１１）（Ｐ＜０．０５）。结论以上结果显示，ｎｍ２３－Ｈ１为一种可在肺癌转移过程中发挥负调节作用的转移抑制基因，该基因表达水平可望作为一个肺癌转移的预测因子。     

乙型肝炎病毒S基因重组逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达

目的 探索逆转录病毒载体在基因治疗中的应用。方法 用ＤＮＡ重组技术构建ＨＢＶ－Ｓ基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染ＰＡ３１７后,筛选高表达克隆,用假病毒颗粒感染ＨｅｐＧ２、Ｐ８１５和ＥＬ４细胞,分别用ＲＴ－ＰＣＲ及ＥＬＩＳＡ法检测目的基因表达。结果 ＨＢｓＡｇ在上述细胞中获得不同程度的表达,细胞上清液（４８ｈ）中ＨＢｓＡｇ含量（吸光度值）分别为０．９２、０．０９和０．４７。结论 逆转录病毒用载体,     

在大肠杆菌中高效表达人I型免疫缺陷病毒p24蛋白

目的 表达人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白ｐ２４，为制备抗ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原奠定基础。方法 将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４＾ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建重组表达质粒，转化大肠肝菌ＢＬ２（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及点免疫印迹分析，结果 构建成功重组表达质粒ｐＥＴ２４经Ｉ