结核分支杆菌H37Rv株菌体抗原单克隆抗体制备,特性？…

目的 利用单克隆抗体技术分析分支杆菌多肽抗原的共性和个性,建立纯化单克隆抗体的最佳方法。方法 按常规方法制备单克隆抗体。分泌单克隆抗体阳性杂交细胞株的筛选采用ＥＬＩＳＡ法,确认采用免疫印迹法。２４种分支杆菌菌株均生长于改良罗氏培养基上,Ｈ３７Ｒｖ株分别生长于改良罗氏培养基和苏通液体培养基上。单克隆抗体的纯化采用硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法和离子交换法。结果 经筛选获得１４株单克隆抗体杂交细胞瘤。其中,     

结核分支杆菌H37Rv与H37Ra株mRNA基因差异显示研究

目的　采用mRNA差异显示技术研究H3 7Rv株与H3 7Ra株的基因差异 ,为获取结核分支杆菌毒力相关基因奠定基础。方法　提取结核分支杆菌H3 7Rv株和H3 7Ra株RNA ,经逆转录、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行mRNA的差异显示。回收差异条带、再扩增和序列分析 ,进行同源性查询。结果　经差异显示后 ,共回收与H3 7Ra株不同的H3 7Rv株mRNA差异条带 10条。经结果查询 ,发现其中 2条差异条带与结核分支杆菌H3 7Rv株DNA序列具有同源性 ,而与H3 7Ra无同源性。结论　mRNA差异显示方法具有高效、灵敏等优点 ,可在基因水平掌握同一种属或不同种属不同株间的差异 ,用于结核分支杆菌相关毒力基因的研究。研究获得的H3 7Rv株与H3 7Ra株的差异片段可能含有与结核分支杆菌毒力相关的基因     

肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7表面抗原的特异性单克隆抗体,以期用于该病原菌的检测。方法以敲除毒力基因的O157突变株F25全菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,分别以全菌抗原和热酚水法纯化的O157 LPS抗原用间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果建立了稳定分泌抗O157 LPS抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6,分泌抗体属IgG3亚类,轻链为κ型。腹水抗体ELISA效价达1∶3.2×106。以辛酸/饱和硫酸铵法纯化后抗体效价为1∶1.6×106,亲和常数Ka大于6.14×10-11mol/L。用于协同凝集和间接荧光抗体试验具有良好的特异性。结论该单克隆抗体针对O157的LPS抗原,特异性强,亲和力高,可用于O157的检测或分离鉴定。     

结核分枝杆菌Rv0577基因在毕赤酵母的表达及重组抗原活性鉴定

目的在毕赤酵母表达结核分枝杆菌Rv0577基因并鉴定重组蛋白抗原活性。方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv扩增Rv0577基因,TA克隆进入pGEM-TEasy载体,再亚克隆进入pPICZαA。重组质粒pPICZαA-Rv0577经双酶切鉴定并测序证实,线性化后电转化导入毕赤酵母X-33表达;采用Western blot和Dot blot鉴定抗原活性。结果双酶切及测序鉴定均证实获得Rv0577基因的正确克隆。pPICZαA-Rv0577在X-33分泌表达的目的蛋白,通过硫酸铵沉淀、HPLC顺序纯化,获得的纯化蛋白与结核病患者血清进行Dot blot,7份中有3份反应阳性。结论Rv0577基因在毕赤酵母获得高效表达,重组抗原可被结核病患者血清识别,具有抗原活性。     

平菇双相培养基用于结核杆菌培养的研究

目的 以平菇浸出液为基础成分,研制培养结核分支杆菌的一种新型双相培养基。方法 经用H37Rv基础试验及对351份临床标本用酸性罗氏培养基对照。结果 两种培养基总阳性数为172份（49％）,其中平菇双相培养基166份（＋）,阳性检出率为47．3％。酸性罗氏培养基144份（＋）,阳性检出率为41．03％。分别占总阳性数的96．51％和83．72％,并且大多数结核杆菌在平菇双相培养基上的初生长时间明显快于酸性罗氏培养基时间。结论 结果表明平菇双相培养基成分来源丰富,价格低廉,制作方便,操作简单,适合于我国广大基层医院和结核院所使用。     

母牛分支杆菌菌苗预防糖尿病并发肺结核的实验研究

目的　探讨母牛分支杆菌 (Mycobacteriumvaccae)菌苗对实验性糖尿病大鼠发生肺结核的预防作用。方法　大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型 1周后 ,随机分为 4组 :糖尿病结核组、母牛分支杆菌菌苗免疫组、卡介苗 (BCG)免疫组、联合免疫组 ,分别给予不同的处理 ,观察母牛分支杆菌菌苗的免疫预防作用。 1个月后自大鼠尾静脉注入标准结核分支杆菌H3 7Rv,H3 7Rv 感染 6周后剖杀大鼠。观察肺脏结核分支杆菌定量培养、结核病变指数、肺泡巨噬细胞吞噬的结核分支杆菌数 ,并作肺组织病理学分析。结果　母牛分支杆菌菌苗免疫组的病变指数、肺脏结核分支杆菌定量培养、肺泡巨噬细胞吞噬的结核分支杆菌计数分别为 2 5± 0 7、(4 1± 0 6 )× 10 4 cfu、2 6± 0 9;未免疫组分别为 3 3± 0 5、(9 9± 1 0 )× 10 4 cfu、7 2± 0 7。P值分别为 <0 0 5、<0 0 1、<0 0 1。组织病理学分析显示母牛分支杆菌菌苗和 (或 )BCG免疫组肺脏结核病变以增殖结节为主 ,无坏死结节 ;未免疫组肺脏则以淋巴细胞结节、坏死结节为主。提示母牛分支杆菌菌苗能减轻糖尿病大鼠的肺结核病变。结论　母牛分支杆菌菌苗对糖尿病大鼠发生肺结核有较好的预防作用     

四种前处理对分支杆菌生长活力观察

本文报道对抗酸分支杆菌标准菌株17株,临床分离菌株10株,分别作酸、碱、中和及胰酶-新洁尔灭等四种前处理后,接种于改良罗氏或酸性罗氏培养基,经37℃、8周观察细菌生长活力受影响的程度。结果显示,对大部分致病性分支杆菌的生长活力无明显影响,而对大部分非致病性分支杆菌的生长活力有明显影响。     

分支杆菌快速变色培养基应用初探

结核分支杆菌 (ＭＴＢ)的快速培养历来是国内外学者关注的热门课题[1 3]。本文报道了快速变色液体培养基临床应用结果 ,并与涂片和罗氏培养结果进行比较。材料与方法　 ( 1 )分支杆菌快速变色液体培养基由深圳怡百世公司提供。 ( 2 ) 50份待检患者痰标本取自我市肺科医院住院患者。其中肺结核 3 9例 ,非结核性呼吸系疾病患者1 1例。 ( 3 )痰涂片和罗氏培养按常规方法进行。 ( 4)变色液体培养基接种标本量为 0 4ｍｌ,3 7℃培养 ,每天观察结果 1次 ,4周仍无生长为阴性。若培养基变紫色 ,底层有紫色颗粒状沉淀 ,且无混浊现象为分支杆菌培养阳…     

出血性大肠杆菌O157主要毒力因子单克隆抗体的制备

目的利用两种抗原制备针对出血性大肠杆菌EHECO157主要毒力因子的特异性单克隆抗体。方法分别用纯化融合蛋白Eae-Stx1/2B和EHECO157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)全菌免疫BALB/C小鼠,通过细胞融合和EHECO157标准株EDL933间接ELISA筛选稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果纯化融合蛋白免疫获得了2株单抗2H9和3B4,EHECO157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)免疫获得了1株单抗4H7。2H9、3B4和4H7亚类鉴定分别为lgG2b、lgM和lgM;纯化腹水ELISA效价分别为1∶1.28×105、1∶3.2×104、1∶6.4×104,亲和力常数分别为2.9×106、1.4×106、2.6×105。结论3株单克隆抗体均具有较高特异性,2H9效价和亲和力最高,可作为产志贺毒素EHECO157的检测抗体。     

聚合酶链反应—单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

应用PCR-SSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株rpoB、KatG、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32侏耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25侏结核分支杆菌敏感分离株用PCR-SSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株（87.5%)rpoB基因,19株（59.3%)KatG基因和23株（71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H37Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

2株胞内分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的联合应用多种分子生物学技术进行分枝杆菌菌种鉴定。方法从经PNB、TCH鉴别培养基鉴定为结核分枝杆菌的临床分离菌株285株中选取6株,其中包括oxyR-ahpC基因间隔区检测时PCR产物分子量异常的2株和另外随机选择的PCR产物分子量正常者4株,采用H37Rv、鸟分枝杆菌95001和胞内分支杆菌95002做对照,PCR扩增oxyR-ahpC基因间隔区,对其产物进行测序和网上同源性(H37Rv、U18263、U71061)比对。同时,采用多位点PCR扩增和hsp65 PCR-限制性酶切片段长度多态性分析,从而判定分枝杆菌菌种类型。结果经PNB、TCH鉴别培养基鉴定初步判定为结核分枝杆菌的285株临床分离株中2株临床菌株oxyR-ahpC基因间隔区PCR产物大小约为1 000bp,DNA序列与胞内分枝杆菌同源性极高,达99%,而与同片段序列结核分枝杆菌H37Rv的差异大,同源性为84%。多位点PCR指纹显示为非分枝结核杆菌,hsp65 PCR-RLFP/RFLP指纹与95002一致。结论2株oxyR-ahpC基因间隔区PCR产物分子量异常的经PNB、TCH鉴别培养基鉴定为结核分枝杆菌的临床分离株确定为胞内分枝杆菌。多种分子生物学技术联合应用能够快速、简便、更准确地鉴定分枝杆菌菌种。     

鸟-胞内分枝杆菌复合菌组肺病与脓肿分枝杆菌肺病临床表现的对比观察

目的 比较鸟-胞内分枝杆菌复合菌组(MAC)肺病和脓肿分枝杆菌肺病临床表现的差异.方法 回顾性分析北京胸科医院2010-2011年新发并有完整资料的MAC肺病18例和脓肿分枝杆菌肺病9例的临床资料,旨在提高对NTM肺病的诊断水平.结果 MAC肺病和脓肿分枝杆菌肺病患者在性别、年龄、体重指数、基础疾病、症状和痰抗酸染色阳性等方面无显著差别.MAC肺病以上叶空洞型较常见(13/18),脓肿分枝杆菌肺病以结节支气管扩张型较常见(8/9);脓肿分枝杆菌肺病患者双肺微结节(8/9)、树芽征(7/9)和多发支气管扩张(8/9)较MAC肺病(7/18、6/18和5/18)常见,MAC肺病患者上叶空洞(13/18)较脓肿分枝杆菌肺病(2/9)常见.结论 MAC肺病和脓肿分枝杆菌肺病的许多特点相类似,但双肺微结节、树芽征和多发支气管扩张多见于脓肿分枝杆菌肺病,上叶空洞多见于MAC肺病.     

马赛分枝杆菌肺病一例并文献复习

目的 分析马赛分枝杆菌肺病的临床特征,探讨其鉴别诊断方法.方法 分析患者的临床表现及实验室检测结果,对其临床分离菌株进行细菌学检查和分子生物学鉴定,采用PCR扩增rpoB和hsp65基因片段和双向DNA测序,并与美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库比对进行菌种鉴定.结果 患者女,72岁,体质瘦弱,因反复出现呼吸道症状而入院,既往多次治疗无效.该病例的临床分离菌株经细菌学检查和分子生物学鉴定确定为马赛分枝杆菌,rpoB和hsp65基因片段测序结果与NCBI数据库马赛分枝杆菌相应片段的同源性分别为100%和99%,结合临床表现确诊为马赛分枝杆菌肺病.药敏试验结果显示该菌株对多种药物耐药,根据药敏试验结果和患者的身体条件确定治疗方案,采用静脉滴注头孢西丁和口服阿米卡星治疗有效.结论 马赛分枝杆菌肺病多发于免疫功能低下人群,其临床和影像学表现与结核病相似,通过实验室细菌学检测和菌种鉴定,可以对二者进行鉴别.

Abstract：

Objective To analyze the clinical features and differential diagnosis of pulmonary infection with Mycobacterium massiliease (M.ruassiliense ).Methods The clinical manifestations and laboratory test results of our patient were analyzed and the strain isolated from the patient was tested by bacteriological and molecular methods.The partial gene fragments of rpoB and hsp65 were amplified by PCR, sequenced and compared with GeneBank database in NCBI for identification of Mycobacterium species.Results The patient was a 72 year old female, who had been admitted to hospital several times because of recurrent respiratory symptoms which had failed to improve upon treatment.This time, pulmonary infection with M.massiliense was confirmed by clinical manifestation and laboratory results.M.massilence isolated from the sputum of our patient was confirmed by bacteriological and molecular methods.The results of specific segments of rpoB and hsp65 tested by PCR and sequence analysis, and compared with that of mycobacterium in NCBI, showed that the DNA homology was 100% and 99% respectively.The results of drug sensitivity test showed that this strain was resistant to multiple drugs.According to the results of drug susceptibility tests and the condition of the patient, therapy with cefoxitin sodium and amikacin was used and the drugs were effective.Conclusions The clinical manifestations and the chest imaging of pulmonary infection with M.massiliens were similar to those of Mycobacterium tuberculosis, which can be differentiated by laboratory tests.     

矽肺结核患者结核分枝杆菌L型感染情况调查

目的　研究矽肺结核患者结核分枝杆菌 L型的感染状况及其临床意义。方法　对矽肺结核组与矽肺组患者进行痰结核分枝杆菌和结核分枝杆菌 L 型培养 ,并采用 IK染色法对培养物作进一步鉴定。结果　矽肺结核组 12 6例患者中 ,结核分枝杆菌培养阳性 18例 ,检出率为 14 % ;结核分枝杆菌 L型培养阳性 6 4例 ,阳性率为5 1% ,两者相比差异极其显著 (P <0 .0 0 1)。且矽肺期别越高 ,痰结核分枝杆菌 L型的阳性检出率也越高 ( 期为38%、 期为 6 7%、 期为 91% ) ,各期患者间差异极其显著 (P <0 .0 0 1)。矽肺组 10 2例患者中 ,结核分枝杆菌培养均为阴性 ,而结核分枝杆菌 L型培养阳性 8例 ,阳性率为 8%。结论　矽肺结核患者结核分枝杆菌 L型的感染率较高 ,开展结核分枝杆菌 L 型检测 ,对减少矽肺结核复发的漏诊或误诊、提高矽肺结核的早期诊断率有着重要的意义。     

四种重要致病性分枝杆菌DHPLC检测鉴别方法的建立

目的运用多重核酸扩增(PCR)联合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速检测方法,实现同时检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌。方法根据四种分枝杆菌特异基因序列分别设计菌种特异核酸扩增引物,通过筛选优化试验建立四重核酸扩增体系,对核酸扩增产物采用DHPLC设备进行检测分析,每一菌种的核酸扩增产物分别形成DHPLC特征峰图。对结核分枝杆菌等51株分枝杆菌标准株和分离株样品以及沙门氏菌等22株常见微生物样品进行特异性检测试验;对四种分枝杆菌特异的核酸扩增产物分别制备克隆质粒,通过对梯度稀释的阳性质粒的检测试验,进行多重PCR-DHPLC灵敏度测试;对疑似病人痰液样品和疑似发病牛的组织样品进行检测,并与细菌分离培养法进行比较以验证临床检测效果。结果该方法能快速检测鉴别上述四种分枝杆菌,检测灵敏度达到102~103基因拷贝,从131份疑似病人临床样品中检出91份结核分枝杆菌阳性,从40份来自疑似发病牛群的临床样品中检出31份牛分枝杆菌阳性,检出率均高于细菌分离培养法。结论研究表明所建立的多重PCR-DHPLC方法能快速检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌,为人畜结核、副结核病诊断提供一种新型分子生物学技术手段。     

脓肿分枝杆菌群肺病16例临床表现及文献复习

目的 分析脓肿分枝杆菌群肺病的临床表现和对含头孢西丁治疗方案的疗效.方法 回顾性分析北京胸科医院新诊断的脓肿分枝杆菌群肺病16例的临床表现,以及全疗程克拉霉素和莫西沙星口服治疗,前12周增加头孢西丁和阿米卡星静脉滴注的强化治疗方案的疗效.结果 16例脓肿分枝杆菌群肺病患者中有14例为结节支气管扩张型,1例为上叶空洞型,1例为未分类型;影像学特点表现为多发微结节(14/16)、支气管扩张(14/16)、树芽征(13/16)、空洞(5/16)、肺实变(5/16)、结节(5/16)和肺体积缩小(3/16).5例采用含头孢西丁的强化治疗方案3个月,其中2例症状和影像学表现改善,痰分枝杆菌培养转阴;2例症状和影像学表现改善,但痰分枝杆菌未转阴;1例的症状、影像学表现和痰分枝杆菌培养均未改善,经后续的巩固治疗也未见改善.结论 脓肿分枝杆菌群肺病主要表现为结节支气管扩张型,以多发微结节、树芽征和支气管扩张为主要影像学表现,含头孢西丁的抗生素联合治疗方案对患者有一定疗效.     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌DNA

OBJECTIVE: To improve the specificity and sensitivity of polymerase chain reaction (PCR) technique for detecting and identification of DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis. METHOD: Three pairs of oligonucleotide primer were used in triplex-PCR. A 383 bp DNA fragment encoding part of the 65,000 mycobacterial surface antigen, a 123 bp fragment corresponding to a specific M. tuberculosis complex sequence which was the insertion sequence 6110 (IS 6110) and a 268 bp fragment for human beta-globin were amplified by triplex-PCR respectively. RESULT: The sensitivity of the triplex-PCR-electrophoresis for the DNA of mycobacterium was 0.6 pg. The specific bands of 383 bp and 123 bp among the amplified DNA from M. hominis, M. bovis, BCG and M. simiae were present in the agarose gel. By contrast, only a band of 383 bp was found among the M. nontuberculosis which contained M. avium, M. chelonae, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. kansasii, M. intracellulare and M. smegmatis. Compared with the standard strains, there was an additional 268 bp band in simulated clinical samples infected by Mycobacterium. The above 3 specific bands were found neither in other 15 bacterial species tested nor in Mycoplasma pneumoniae. 182 clinical samples were examined by culture, smear and triplex-PCR. 72 nontuberculous clinical samples were all negative. In 110 tuberculosis clinical samples, the positive rates were 2.7%, 13.6% and 32.7%, respectively. CONCLUSION: The triplex-PCR possesses a high specificity and sensitivity. This method could detect and identify the DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis except M. simiae. It is a valuable tool for early diagnosis and differentiation for infection of M. tuberculosis and M. nontuberculosis.     

对硝基苯甲酸(PNB)替代BACTEC460NAP进行分支杆菌分群的初步研究

用PNB替代BACTEC系统中NAP药物,将PNB加入7H_(12)B培基内,鉴定结核菌与非结核分支杆菌两大菌群。实验10株标准菌株和115株临床菌株;结果:人、牛型标准菌株在PNB12B10μg/ml生长抑制。8株非结核标准菌株抑菌浓度PNB>500μg/ml。以PNB100μg/ml12B为界限,115株临床菌株PNB与NAP方法平行对照实验,鉴定结果:结核菌群符合率97.8％,非结核菌群符合率95.8％,总符合率97.4％(P>O.05)。其中18株用PNB法间隔一个月重复实验,两次结果一致。结果显示,PNB12B菌群鉴定方法可以做为一种准确、经济的菌型初筛实用方法。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测

目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究

目的 建立并评估快速鉴定结核分枝杆菌复合群（MTBC）与非结核分枝杆菌（NTM）的多重PCR方法。 方法 应用分别针对MTBC的oxyR-ahpC基因间隔区、MTBC和NTM的rpoB基因可变区的3对分枝杆菌特异性引物进行多重PCR扩增,扩增产物分别为473 bp、235 bp和136 bp。应用该多重PCR方法对6株MTBC标准株、50株NTM标准株、312株MTBC临床分离株和300株NTM临床分离株进行了初步菌种鉴定。 结果 经多重PCR 扩增后进行凝胶电泳,MTBC标准株473 bp和235 bp片段均可见,NTM标准株仅见136 bp片段。312株MTBC临床分离株中,310株扩增出473 bp和235 bp片段,敏感度为99.36%（310/312）,特异度为99.32%（294/296）;300株NTM临床分离株中,294株扩增出136 bp片段,敏感度为98.00%（294/300）,特异度为100.00%（310/310）。 结论 该多重PCR方法可检测并鉴别MTBC及NTM,具有高度的特异度和敏感度,有可能作为鉴别MTBC与NTM的有价值的检测手段。