内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因治疗胃癌的作用及其机制

目的探讨新型内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因(hENDOVEGI151)治疗胃癌的作用机制.方法应用重复感染系数(MOI=100)的重组腺病毒Ad hENDOVEGI151转染胃癌SGC-7901、MKN-28细胞和血管内皮ECV-304细胞4 h后,继续培养6 d,噻唑蓝(MTT)比色法检测第1至6天3种细胞的存活率;流式细胞仪(FCM)丙化碘锭(PI)单染色法检测转染后48 h胃癌和内皮细胞凋亡的情况;应用DNA片断化试验分析转染后12、24、36、48 h时ECV-304凋亡情况;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测融合基因转染对SGC-7901表达促血管生成因子VEGF165的影响.结果AdhENDO-VEGI151治疗强烈抑制ECV-304增殖,72 h抑制率为55.18%,144 h抑制率89.86%;FCM检测出现明显凋亡峰,凋亡细胞约占(20.70±5.83)%,并且出现G1期阻滞(65.41±2.38)%和S期明显减少(21.81±1.52)%,与Ad LacZ组和对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);转染组细胞DNA出现典型的梯形条带,尤以转染后24～36 h最为明显,Ad LacZ组及对照组DNA无裂解.Ad hENDO-VEGI151转染对胃癌细胞无直接毒性作用,但明显下调胃癌细胞VEGF165的表达水平.结论Ad hENDO-VEGI151治疗一方面强烈抑制内皮细胞增殖,诱导凋亡;另一方面抑制胃癌细胞表达VEGF165,多角度联合抑制肿瘤新生血管形成,使肿瘤细胞因缺血而发生大量凋亡.     

新型血管生成抑制人内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151治疗胃癌的实验研究

目的研究重组腺病毒表达的人内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151(hENDO-VEGI151)融合蛋白对胃癌的抑制作用.方法构建携带hENDO-VEGI151融合基因的重组腺病毒载体,脂质体介导法包装重组腺病毒Ad IL-3/hENDO-VEGI151.体外检测融合基因的表达及融合蛋白的生物学活性.应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型及荷人胃癌裸鼠模型,进一步观察融合蛋白对活体血管生成的影响和融合基因治疗活体胃癌的疗效.结果用TCID50法测定携带融合基因的重组腺病毒滴度为4.2×1011TCID50/ml;用聚合酶链反应(PCR)、逆转录(RT)-PCR和免疫组织化学方法证实融合基因可被转导入SGC-7901细胞内并稳定高效地转录和表达;Western blot显示融合蛋白可被分泌到胞外发挥作用;融合蛋白可强烈抑制ECV-304细胞生长及鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成.Ad IL-3/hENDO-VEGI151治疗可强烈抑制裸鼠体内种植瘤生长,明显下调肿瘤微血管密度,促进胃癌细胞凋亡.结论 hENDO-VEGI151是一条新型强效的肿瘤血管生成抑制基因,其表达产物可能通过作用于肿瘤新生血管形成的不同环节强烈抑制新血管生成和肿瘤生长,值得进一步研究.     

血管生成抑制素基因对裸鼠人肝癌移植瘤的治疗作用

肿瘤血管的快速生成是原发性肝癌生长和转移的前提,肿瘤血管一直作为抗肿瘤的研究对象而倍受关注[1]。本研究旨在观察血管生成抑制素(As)基因对人原发性肝癌裸小鼠皮下移植瘤的治疗作用。一、材料和方法1.质粒和实验动物:真核表达质粒pCDNA3/angio由中国医学科学院昆明医学生物学研究所构建并惠赠。人原发性肝细胞癌SMMC7721细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。BALB/C雄性裸小鼠(购自上海市肿瘤研究所),共20只,5～6周龄,体重(18.1±0.5)g。2.主要试剂和仪器:原位细胞凋亡检测试剂盒:华美公司。放射免疫γ计数器:SN682型,上海…     

重组血管生成抑制因子-1对增生性瘢痕组织血管及其相关因子的影响

目的 研究基因转染血管生成抑制对兔耳增生性瘢痕组织血管及其相关因子表达的影响.方法 将基因重组血管抑制剂Ad-METH-1作用于兔耳增生性瘢痕,用微循环显微镜检、组织学染色、免疫组织化学染色等方法,研究Ad-METH-1对兔耳瘢痕组织增生、血管生成及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)表达的影响,探讨基因转染血管生成抑制对增生性瘢痕的影响.结果 Ad-METH-1注射后30 d,实验组瘢痕组织微血管计数为12.38±2.56,VEGF阳性细胞百分比为17.64%,bFGF阳性细胞为18.24%;对照组微血管计数为48.12±6.46,VEGF阳性细胞百分比为31.34%,bFGF阳性细胞为28.26%.结果 显示,实验组瘢痕组织微血管计数低于对照组,两组间差异有统计学意义(P＜0.01);实验组瘢痕组织VEGF及bFGF的阳性细胞百分比均低于对照组,两组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Ad-METH-1对兔耳瘢痕组织增生、血管生成及VEGF、bFGF表达产生了明确的抑制作用,早期行血管抑制治疗可抑制增生性瘢痕的形成.基因转染血管抑制治疗有望成为一种有效的增生性瘢痕防治方法.     

血管生成抑制剂Rg3对胃癌生长和转移抑制作用的实验研究

目的：研究血管生成抑制剂Rg3对胃癌生长和转移的抑制作用。方法：完整组织块SCID鼠胃壁原位种植,建立类似于临床的胃癌转移模型。移植后第7天开始灌胃给药,Rg3剂量为0、2．5,5．0,10．0mg/kg,每日1次,共6周,移植后第8周末处死动物,测定原位肿瘤重量,观察转移情况,并采用抗CD31抗体的标记链霉亲和素－生物素免疫组化方法检测肿瘤内微血管密度。结果：Rg3对原位肿瘤的生长和转移均有抑制作用,2．5,5．0,10．0mg/kg剂量组的抑瘤率分别为52．3％,63．3％和71．6％,肝转移抑制率分别为37．8％,68．9％和84．4％,腹膜转移抑制率分别为36．4％,74．6％和74．6％,Rg3治疗后,肿瘤内微血管密度明显降低,结论：Rg3对胃癌的生长和转移有明显抑制作用。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增，克隆构建真核表达质粒pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As。方法：从单纯疱疹 病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞上清液中提取HSV－2基因组DNA，以此为模板，用PCR方法扩增胸苷激酶（TK）基因，将扩增的片段克隆入载体pcDNA3中，挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切pcDNA3／HSV－Ⅱ TK，得到目的基因TK，将其克隆于已构建的真核表达载体pcDNA3/As上。结果：HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，基因序列与gendbank中报道相符。新质粒pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As经限制性核酸内切酶（BamH I,Hind Ⅲ）酶切后得到700bp(As）及1000bp（HSV－ⅡTK）相应基因片段。结论：本研究成功构建pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As真核表达质粒。     

血管生成抑制因子Arresten基因对裸鼠移植瘤的研究

Arresten是新发现的一种强有效血管生成抑制因子，是Ⅳ型胶原α1链的羧基末端NC1结构域多肽片段；它能有效抑制新生血管形成及肿瘤的生长和转移。最近，我们采用RT-PCR方法和基因重组技术，已成功地完成了人arresten基因的分子克隆与序列测定。并已构建arresten基因的原核表达载体。且在大肠杆菌中进行了表达。在此基础上，     

逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因对人肝癌细胞体内生长的抑制作用

目的：探讨宿主细胞表达的人血管内皮抑制素（endostatin)对人肝癌细胞在体内生长的影响。方法：利用逆转录病毒载体pLncx,将endostatin基因导入人肝癌细胞SMMC7721内建立转基因肝癌细胞株。应用PCR、免疫组化及Western blot检测人endostatin的转染、表达和分泌。血管内皮细胞增殖试验检测表达的endostatin生物学活性。同时对转染细胞株在体外及在裸鼠体内的生长情况进行观察。结果：PCR证实,转endostatin基因的肝癌细胞 基因组中存在有550bp人特异性endostatin片段,免疫组化及Western blot印迹分析示人endostatin在转染肝癌细胞株中获得稳定表达和分泌。转染细胞表达的endostatin能显著抑制人血管内皮生长,抑制率达48％（P＜0．01）。与对照组相比,转染人endostatin基因的肝癌细胞在体外的生长速度无明显改变,但在接种裸鼠皮下后,肿瘤生长明显受到抑制,在22d时,肿瘤缩小率达94．5％（P＜0．01）。结论：逆转录病毒介导的人endostatin基因疗法对人肝癌SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著抑制作用。     

重组人血管内皮抑制素对血管内皮细胞的作用

目的：探讨重组人血管内皮抑制素（YH-16）对血管内皮细胞（EC）的作用。方法：传代培养ECV304，将不同浓度的YH-16作用于生长旺盛的EC，以MTT法筛选有效浓度。以有效浓度的YH-16作用于EC，在不同时相点光镜下观察EC形态，MTT检测细胞活性，流式细胞术检测细胞周期，实时荧光定量PCR检测VEGF的表达量。结果：YH-16作用后，光镜下可见EC发生弥散性坏死。MTT检测显示吸光度降低，流式细胞术示G2期细胞比例增多，实时荧光定量PCR检测示VEGF表达量明显降低。结论：YH-16可明显抑制EC的生长增殖，可能通过抑制EC分泌VEGF，从而抑制EC增殖、迁移及血管的形成。     

生存素反义寡核苷酸联合 P53基因抑制胃癌细胞的生长作用

目的 研究生存素（survivin）反义寡核苷酸联合抑癌基因P53对人胃癌细胞系HS-746T的抑制作用及机制。方法 用P53基因和设计合成的survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞系HS-746T进行处理，分空白对照组、反义survivin转染组，P53基因组，反义survivin加P53共转染组。采用细胞计数和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力及细胞生长速度，用RT-PCR技术和Western印迹法分析survivin mRNA及蛋白质的表达情况，末端原位标记染色法（TUNEL）分析细胞凋亡指数。结果 不同时间反义survivin转染组、P53基因组和共转染组均对胃癌细胞的生长有抑制作用，且能够下凋胃癌细胞survivin mRNA和蛋白质的表达，共转染组较单独用药组效应明显增强，共转染组胃癌细胞凋亡指数高于另外两组。结论 Survivin反义寡核苷酸联合P53基因抑制人胃癌细胞的生长及诱导凋亡的作用大于单独应用一种药物。     

兔耳增生性瘢痕血管生成及腺病毒转染基因重组血管生成抑制因子1

目的 研究不同时期兔耳增生性瘢痕组织血管生成,探索新的增生性瘢痕防治方法. 方法 19 只日本大耳白兔,体重2.0～2.5 kg,制备兔耳增生性瘢痕模型.其中8只于创面上皮化后10、30、60及90 d行微血管计数、微循环监测及HE染色观察.另11只选择每只兔的左、右侧耳为实验组及对照组,于上皮化后10 d,实验组兔耳瘢痕局部多点注射基因重组血管生成抑制因子1 (adenovirus extracellular protein with metalloprotease and thrombospondin 1domains,Ad-METH1) 重组腺病毒40 μL,对照组注射等量空载腺病毒.取 1 只兔于注射后3 d,采用 RT-PCR 和 Westernblot 方法检测基因转染后瘢痕组织中 METH1 mRNA 和蛋白的表达.余 10 只兔注射后30 d,行两组大体观察、微血管计数及 HE 染色. 结果 上皮化后10、30、60 及 90 d 瘢痕组织微血管计数分别为(42.37±3.89)、(49.46±4.13)、(33.12±4.34) 及 (13.24±2.31) 支;瘢痕组织微循环灌注分别为(37.75±2.11)、(59.87±6.46)、(44.53±6.14) 及 (29.21±1.84) PU;上皮化后10～60 d微血管计数及血流灌注值明显高于上皮化后90 d,差异均有统计学意义(P<0.05).兔耳创面上皮化后10～30 d组织学为瘢痕增生早期和增生期表现;60 d时仍为增生期表现,但已出现成熟迹象;90 d时大部分瘢痕软化,为成熟期表现.Ad-METH1 注射后 3 d,实验组 METH1 mRNA 及蛋白有较高水平的表达,对照组未检测到靶基因表达;注射 Ad-METH1 后 30 d,大体观察:实验组瘢痕颜色接近正常兔耳肤色,质地接近正常;对照组瘢痕明显高出兔耳腹侧皮面,质地坚硬;瘢痕组织微血管计数实验组为(12.38±2.56)支,对照组为(48.12±6.46)支,组间比较差异有统计学意义(P<0.01).组织学染色显示实验组瘢痕微血管分布较少,成纤维细胞散在,胶原排列有序;对照组见大量成纤维细胞,血管分布丰富,胶原纤维粗大、排列紊乱. 结论 血管生成与增生性瘢痕的形成有密切关系,血管抑制基因治疗有望成为一种有效的增生性瘢痕防治方法.     

核转录因子-圈套抑制血管内皮细胞炎性反应的实验研究

炎症介质过度释放贯穿全身炎症反应综合征(SIRS)、多脏器功能障碍综合征(MODS)始终，是病情恶化的首要原因。核转录因子KB(NF—KB)在炎症介质的调节中起主要作用。临床上多种手段可以抑制NF-kB的活性。但特异性差，副作用多。NF—kB能特异性识别并结合目的基因上的kB序列，利用这个特性，合成一包含kB序列的双链寡聚脱氧核苷酸(dsODNs)并转人靶细胞核，竞争性结合核内激活的NF—kB，     

类固醇生成因子-1基因沉默在介导血管紧张素Ⅱ对醛固酮分泌调控的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)刺激人肾上腺皮质癌H295R细胞后醛固酮合成酶(CYP11B2)mRNA及醛固酮激素的改变,探讨类固醇生成因子-1(SF-1)基因沉默在介导该反应中的作用.方法 用携带U6启动子和SF-1特异性短发夹RNA(shRNA)序列的质粒载体pGenesil1-SF-1-shRNA及含非特异性shRNA编码序列的阴性对照质粒pGenesill-negative-shRNA转染人肾上腺皮质癌H295R细胞,应用Westem blot和荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测SF-1表达的改变,以100 nmol/L浓度ATⅡ刺激实验组和对照组细胞,检测ATⅡ刺激后3、6、9、12、15、18 h时间点CYP11B2 mRNA表达水平,与未刺激时对比,检测两组细胞CYP11B2 mRNA的最大增幅.用放射免疫法测定醛固酮激素在ATⅡ刺激24 h后的分泌水平,对比两组细胞醛固酮增幅.结果 实验组细胞SF-1在蛋白水平和mRNA水平分别下降了69.07%和71.20%(P＜0.01).ATⅡ刺激后12 h时CYP11B2 mRNA表达水平最高,与未刺激前比较,实验组和对照组的CYP11B2 mRNA增幅分别是50.21倍和800.09倍(P＜0.01),后者是前者的15.93倍(P＜0.01).同样,ATⅡ刺激后醛固酮激素分泌水平均升高,对照组细胞刺激前后分别为(0.061±0.007)μg/L和(0.256±0.014)μg/L(P＜0.01);而实验组醛固酮激素在ATⅡ刺激前后则分别为(0.101±0.010)μg/L和(0.252±0.016)μg/L(P＜0.01),两组比较,前者增幅高于后者1.7倍(P＜0.01).结论 SF-1表达下调可以降低CYP11B2 mRNA及醛固酮对ATⅡ的敏感性和反应性.     

人arresten基因的克隆表达及其对内皮细胞增殖的影响

目的克隆表达血管生成抑制因子arresten基因，并探讨其生物学活性。方法利用基因重组技术，从含有人arresten基因的克隆载体pGEMArr上切下目的基因片段，亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pRSET中，构建表达载体pRSETAN。将重组质粒pRSETAN转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导表达。菌体经超声波破碎，镍柱亲和层析纯化并复性。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定表达蛋白抑制血管内皮细胞的活性。结果酶切鉴定和测序验证，表达载体构建正确。在表达宿主菌中，arresten基因获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白质的27％；表达产物经亲和层析纯化后，蛋白质纯度达96％。经复性，重组蛋白可显著抑制血管内皮细胞生长因子促脐静脉内皮细胞的增殖作用。结论人arresten基因能在pRSET表达系统中得到高效表达；复性后表达蛋白能有效抑制血管内皮细胞的增殖。     

血管内皮因子、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子纳米缓释剂对血管内皮细胞影响的比较

目的制备血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)可降解缓释微球,考察其生物活性的保存情况,以及它们对血管内皮细胞的作用.方法采用改良的乳化冷凝法交联制备VEGF、bFGF、EGF的明胶缓释微球,将它们加入血管内皮细胞的培养液中,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)测定细胞增殖情况.结果VEGF、bFGF、EGF的缓释微球平均粒径(11.32±3.64)μm;培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性;5天后,VEGF20ng缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于其它组;7天后,VEGF20ng缓释微球组值仍高于其它组,但差异无显著性.结论VEGF、bFGF、EGF的缓释微球制备工艺简便,成球性好;能较长时间地持续释放活性VEGF,bFGF、EGF,可促进血管内皮细胞的增殖,其中VEGF效果最显著.     

VEGF-ASODN转染对胃癌细胞VEGF表达及生长的抑制作用

目的研究血管内皮细胞生长因子（VEGF）-反义寡核苷酸（ASODN）转染胃癌细胞SGC-7901对其VEGF表达和生长的抑制作用。方法人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染胃癌细胞SGC-7901,24h后实时荧光定量RT-PCR检测细胞VEGF mRNA起始拷贝数,ELISA法检测细胞及培养液上清中VEGF蛋白含量,Western blot法检测细胞生存素（survivin）蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用MTT实验检测转染对细胞活性的影响,用细胞生长曲线表示转染对细胞生长的影响。结果VEGF-ASODN能显著降低VEGF mRNA水平、降低胃癌细胞及其培养液中VEGF蛋白含量、降低survivin蛋白含量、增加细胞凋亡、抑制细胞活性及生长（P〈0.05）。结论VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901能显著抑制VEGF和survivin蛋白表达、增加细胞凋亡、抑制细胞生长。