新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究

[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性。[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况。[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部。细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5)ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6)ng/ml,P<0.05,3周组的II型胶原含量(24.3±1.8)ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5)ng/ml,P<0.05。[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核。     

PKH26标记结合活体荧光成像技术在椎间盘组织工程研究中的应用

目的体外评估PKH26标记对山羊髓核细胞生物学功能的影响,并结合活体荧光成像系统评价种子细胞在裸鼠体内的生物学行为。方法取1岁龄山羊椎间盘分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置相差显微镜下观察,传代获取第1代髓核细胞,行PKH26荧光标记,荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度,并行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色观察,锥虫蓝染色比较标记前后细胞活性,MTT法检测标记前后细胞增殖特性,实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达。将标记后的髓核细胞接种至一体化纤维化-髓核支架的髓核部分,纤维环部分作为阴性对照,体外培养3 d后植入5只6周龄雄性裸鼠体内,培养6周后活体成像技术检测髓核细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围。结果倒置相差显微镜观察示原代髓核细胞簇状生长,呈卵圆形,第1代髓核细胞呈类软骨样细胞形态;标记后的第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性;标记后荧光强度均匀,标记前后细胞活性均在95%以上;标记前后细胞生长曲线比较差异无统计学意义(P>0.05);实时荧光定量PCR检测示标记前后细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。活体成像技术显示体内髓核支架有强烈荧光,纤维环支架未见荧光。结论 PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖及细胞表型的表达无明显影响,结合体内活体荧光成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为。     

基于细胞外基质来源的组织工程椎间盘双相支架裸鼠皮下异位构建椎间盘

[目的]探讨椎间盘细胞和细胞外基质来源的一体化纤维环-髓核双相支架在裸鼠体内异位构建组织工程一体化椎间盘的可行性,并采用PKH26荧光标记和小动物活体荧光成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况。[方法]纤维环细胞和髓核细胞分别标记PKH26荧光,分别接种入细胞外基质来源的一体化支架不同相中,扫描电镜、Dead/Live荧光染色观察细胞粘附及活性,植入裸鼠背部皮下,6周后利用分子小动物活体荧光成像系统评价组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行荧光显微镜下观察、组织学染色。[结果]扫描电镜观察细胞粘附在双相支架上且周围有基质分泌,Dead/Live染色示细胞在双相支架上活性良好;6周后,活体荧光成像显示椎间盘细胞在支架内生长良好,从髓核往纤维环荧光强度减弱,细胞支架复合体在裸鼠体内形成椎间盘样组织,HE、番红O染色、甲苯胺蓝染色阳性。[结论]天然骨基质明胶和软骨基质来源的一体化纤维环-髓核支架复合椎间盘细胞能够在裸鼠皮下异位构建椎间盘样组织。     

来源于长管状骨的组织工程纤维环支架的理化特性及细胞生物学相容性研究

[目的]以来源于长管状骨的骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)为材料制备纤维环支架,并检测其理化特性及细胞生物相容性.[方法]以猪股骨近端松质骨为材料,制备外径为1 cm、内径为0.5 cm的中空环,经脱钙脱细胞处理后制成纤维环支架.支架行Hoechst 33258、HE、Ⅰ型胶原免疫荧光、天狼星红染色,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察并计算孔径,同时进行生物力学测定.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)检测支架不同浓度浸提液的细胞毒性,取P1代山羊纤维环细胞,用注射器将细胞接种至支架上,体外培养48 h,通过活/死细胞染色(LIVE/DEAD cells staining)、扫描电镜(SEM)、HE染色评价支架与细胞的生物相容性.[结果]大体观察支架表面光滑,呈乳白色,扫描电镜支架孔隙分布较均匀且相连通,支架孔径为(401.4±13.1) μm,Hoechst 33258、HE染色均未见细胞残留,Ⅰ型胶原免疫荧光阳性,天狼星红染色支架红染,支架压缩弹性模量为(47.75±6.32) kPa.四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组间细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05),活/死细胞染色示细胞在支架上呈绿色荧光,扫描电镜和HE染色示细胞粘附在支架孔隙表面及周围,有基质分泌.[结论]以来源于长管状骨的骨基质明胶为材料制备的中空环形支架脱细胞彻底,具有合适的孔径结构,在机械性能、组成方面与正常纤维环相接近,具有良好的生物相容性,符合组织工程纤维环支架载体的条件.     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究

目的 对兔椎间盘髓核细胞进行体外培养,观察细胞的形态、表型及超微结构改变,研究其体外生物学特性.方法 取2周龄健康新西兰白兔椎间盘髓核组织,在含有15%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养,倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态.分别在取材后、原代、第1代、第2代细胞培养期间,进行髓核细胞活力测定;爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察;MTT法绘制髓核细胞生长曲线,并行原代及第2代细胞透射电镜观察,对体外细胞的生物学特性进行研究.结果 倒置相差显微镜见原代髓核细胞呈类圆形,折光性较强;5 d开始有细胞贴壁,细胞呈多角形或短梭形;6～8 d细胞生长进入指数生长期;约17 d时,细胞长满瓶壁,可进行传代;随传代次数增加,细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变.髓核细胞活力测定在刚分离完成后细胞活力为95%～97%,原代培养期间为98%～100%,第1代培养期间仍能维持为100%,第2代细胞活力下降较为明显,为75%～80%.髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性:HE染色见细胞核、细胞质着色明显.第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性;第2代细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性,聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅.MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符.透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少,胞质内有大量糖原颗粒,随传代次数增加,糖原颗粒减少,线粒体数量增多,细胞器开始肿胀.结论 明确了兔髓核细胞体外生物学特性变迁,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据.     

骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察

[目的]观察平面培养体系内人退变椎间盘髓核细胞的形态及活性变化.[方法]收集20例人退变椎间盘髓核,分离髓核细胞行平面培养,倒置相差显微镜和HE染色观察髓核细胞的生长过程与形态变化,流式细胞仪量化细胞周期分布和凋亡率,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,观察平面培养传代对髓核细胞活性和基质合成能力的影响.[结果]原代髓核细胞呈类圆形或多角形,平均7d贴壁,31 d融合至95％,P1代髓核细胞呈长梭形或多角形,平均12h贴壁,6.6d融合至95％,两代细胞增殖能力的差异有统计学意义(P＜0.01).原代与P1代髓核细胞的细胞浆阳性染色聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,生长融合至95％后约90％的细胞分布于G1期,约16％的细胞凋亡,两代细胞的细胞活性和基质合成能力无统计学差异(P＞0.05).[结论]人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养将经历显著的形态学变化.传一代后髓核细胞增殖能力提高,但能维持细胞活性以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成能力.     

以骨基质明胶及软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架的实验研究

 目的 以骨基质明胶和软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架,并检测其理化性能及细胞相容性。方法 制备中空骨基质明胶环,并注入脱细胞软骨匀浆,经冷冻干燥、交联后制备成一体化纤维环-髓核双相支架。行Hoechst 33258、天狼星红、HE染色,扫描电镜观察支架内部结构,检测支架孔隙率和吸水率,检测双相支架复水后的力学性能。分离山羊纤维环和髓核细胞,接种至双相支架的相应部位,体外培养48 h,扫描电镜、活/死细胞染色评价支架与细胞的生物相容性。结果 镜下Hoechst 33258染色未见细胞残留,天狼星红染色阳性,HE染色示两部分结合紧密。扫描电镜可见支架呈多孔结构,孔隙相连通,纤维环相孔径为(401.4±13.1) μm,髓核相孔径为(112.4±21.8)μm。支架孔隙率为73.37%±2.56%,支架吸水率为655.7%±78.6%。支架压缩弹性模量为(49.06±15.57)kPa,小于正常椎间盘的(135.9±28.9)kPa,但在同一数量级。扫描电镜观察细胞黏附于支架表面,细胞周围有基质分泌,live/dead细胞染色示细胞在支架上活性良好。结论 以天然骨基质明胶和软骨基质构建的一体化纤维环-髓核双相支架,无免疫原性,具有良好的孔径和孔隙率,支架两部分连接处结合紧密,在结构、生化成分及生物力学性能上与椎间盘组织相似,且具有良好的生物相容性。     

兔髓核间充质干细胞与髓核细胞非接触式共培养的生物学效应

[目的]通过非接触式共培养探索兔髓核间充质干细胞(NPMSCs)与兔髓核细胞(NPCs)的间接生物学效应。[方法]将第3代兔来源NPMSCs与NPCs进行非接触共培养,分设三组:NPCs/NPCs自身共培养对照组,NPMSCs/NPMSCs自身共培养对照组,NPMSCs/NPCs共培养组。分别在共培养3、5、7 d后,比较两种细胞增殖情况,ELISA检测上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子(IGF)的含量;采用RT-PCR检测共培养7 d后NPMSCs与NPCs的Col IIα1、AGG基因表达变化;免疫荧光染色检测NPMSCs中Col II的蛋白表达情况。[结果]在共培养第5 d和第7 d,共培养组NPCs的细胞数量均高于自身对照组(P0.05),在第7d,共培养组NPMSCs的细胞数量均高于自身对照组;在共培养3、5、7 d后,共培养组上清液TGF-β1、IGF的含量均高于自身对照组(P0.05);在培养7 d后,共培养组NPMSCs中Col II免疫荧光强度高于自身对照组,NPCs与NPMSCs的Col IIα1、AGG基因的表达较自身对照组显著升高(P0.05)。[结论] NPMSCs与NPCs非接触共培养可以促进细胞因子分泌、细胞增殖、基质合成与分泌。     

Cell sources for nucleus pulposus regeneration

Purpose

There is increasing interest in the development of cell therapy as a possible approach for the treatment of degenerative disc disease. To regenerate nucleus pulposus tissue, the cells must produce an appropriate proteoglycan-rich matrix, as this is essential for the functioning of the intervertebral disc. The natural environment within the disc is very challenging to implanted cells, particularly if they have been subcultured in normal laboratory conditions. The purpose of this work is to discuss parameters relevant to translating different proposed cell therapies of IVD into clinical use.

Results

Several sources of cells have been proposed, including nucleus pulposus cells, chondrocytes and mesenchymal stem cells derived from bone marrow or adipose tissue. There are some clinical trials and reports of attempts to regenerate nucleus pulposus utilising either autologous or allogenic cells. While the published results of clinical applications of these cell therapies do not indicate any safety issues, additional evidence will be needed to prove their long-term efficacy.

Conclusion

This article discusses parameters relevant for successful translation of research on different cell sources into clinically applicable cell therapies: the influence of the intervertebral disc microenvironment on the cell phenotype, issues associated with cell culture and technical preparation of cell products, as well as discussing current regulatory requirements. There are advantages and disadvantages of each proposed cell type, but no strong evidence to favour any one particular cell source at the moment.

     

人退变髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究

[目的]探讨人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)向类髓核细胞(nucleus pulposuslike cells,NPCs)诱导分化的可能性,为椎间盘退变的防治研究提供种子细胞。[方法]收集腰椎间盘退变患者手术中切除的脂肪组织及髓核组织,采用胶原酶消化法提取原代ADSCs和NPCs,倒置显微镜下观察共培养后ADSCs形态学变化。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,采用孔径为0.4μm的Transwell小室建立细胞共培养体系,NPCs置于上层,ADSCs接种于下层,建立2个细胞培养组:ADSCs单独培养组和ADSCs/NPCs共培养组,甲苯胺蓝染色以检测蛋白聚糖表达情况,RT-PCR法检测细胞COL2A1、ACAN和SOX9基因表达水平。[结果]采用胶原酶消化法可较好的分离培养出人脂肪间充质干细胞和髓核细胞。与NPCs共培养后的ADSCs可被甲苯胺蓝染为天蓝色,且Ⅱ型胶原及SOX9基因表达水平上调(P0.05)。[结论]采用胶原酶消化法分离培养的ADSCs活力较好、增殖旺盛,与退变NPCs共培养后,软骨特异性标记物的表达明显增加,细胞表现出向NPCs分化的趋势,可作为椎间盘组织工程研究的种子细胞。     

Antibiotic penetration into rabbit nucleus pulposus

A rabbit model was used to determine the penetration of four commonly used antibiotics (clindamycin, tobramycin, cephalothin, and oxacillin) into the nucleus pulposus after receiving an 8-hour course of intramuscular antibiotic injections. Clindamycin and tobramycin achieved therapeutic levels in the nucleus pulposus and both were present in greater than 50% of serum levels. Cephalothin was not detected in the nucleus pulposus and penetrated at less than 4% of serum levels at 1 hour after injection. The data were inconclusive regarding oxacillin penetration.     

髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)外泌体对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:取腰椎间盘突出症患者手术切除的髓核组织,体外分离培养人NPCs,采用差速离心法提取NPCs的外泌体,利用透射电镜及Western blot对外泌体进行大小形态及标志蛋白的检测,同时用PKH67荧光染料标记外泌体后与BMSCs共孵育0.5h、2h、4h,在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs对NPCs外泌体的摄取情况;取人BMSCs经NPCs外泌体诱导3d、7d、10d、14d后应用RT-PCR检测BMSCs中蛋白聚糖(ACAN)、SOX-9、Ⅱ型胶原(COL2A1)、角蛋白19(KRT19)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA表达情况。结果:提取的人NPCs外泌体为直径为30~100nm的圆形或椭圆形结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白。经PKH67标记的NPCs外泌体可以被BMSCs摄取;经NPCs外泌体诱导后7d开始BMSCs中的ACAN、SOX-9、COL2A1、KRT19及HIF-1α基因m RNA表达均显著性高于未经诱导的BMSCs(P0.05)。结论:在体外实验中,人NPCs可以分泌外泌体并被BMSCs所摄取,诱导BMSCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘退变的组织工程修复提供更为简单有效的NPCs来源。     

人髓核细胞诱导人尿源性干细胞向髓核样细胞分化作用的研究

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)诱导对人尿源性干细胞(USCs)向髓核样细胞分化的作用。方法 :手术时获取腰椎间盘突出症患者L4/5的髓核组织,并采用贴壁法体外分离培养NPCs;从健康成年人尿液中获取USCs并进行体外培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并采用成骨、成脂、成软骨三系诱导分化及蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)对所获取的USCs进行形态、分化潜能及细胞表面标志蛋白鉴定。使用Transwell小室将P3代NPCs与USCs培养以建立共培养体系,设实验组、对照组及NPCs组,实验组为NPCs与USCs共培养组,对照组为单独USCs培养,NPCs组为单独NPCs培养;培养14d后应用倒置显微镜观察细胞形态;应用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)及WB分别检测实验组USCs、对照组USCs与NPCs组NPCs中蛋白多糖(ACAN)、SOX-9(SRY-related high mobility groupbox gene 9)、Ⅱ型胶原(COL2)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA及蛋白的表达情况;免疫荧光染色观察3组COL2A1及ACAN荧光表达。...     

Chemonucleolysis for herniated nucleus pulposus in adolescents

Fifty-five adolescents between the ages of thirteen and nineteen years underwent chemonucleolysis for one or more herniated lumbar discs at St. Michael's Hospital, Toronto, Ontario. The surgery was done by the senior one of us (J.M.) between 1972 and 1982. The duration of symptoms ranged from two months to three years. Pain in the lower limb was the predominant symptom in forty-eight patients. Reduction of the amount of straight leg-raising by 50 per cent or more, with or without pain in the ipsilateral hip when the asymptomatic limb was lifted (cross-over pain) and with or without pain radiating up or down the lower limb when the tibial nerve was pressed in the popliteal fossa (bowstring discomfort), was considered evidence of tension on or irritation of the nerve root and was present in all patients. Chemonucleolysis was considered as an alternative to discectomy and was performed only after the patient failed to respond to conservative management. An anaphylactic reaction occurred in one patient and was treated successfully. The most common symptom after injection was increased back pain, and it was controlled with medication. One patient had transient weakness of the extensor hallucis longus after injection. The length of follow-up ranged from two to twelve years (average, four years and six months), excluding one patient who was killed in an accident six months after injection. Chemonucleolysis did not relieve the symptoms in eleven of the fifty-five patients. These eleven patients all subsequently had surgical excision of the disc, and in them the chemonucleolysis was considered to have failed.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)