SALL4基因沉默对MCF-7/A细胞增殖和化疗敏感性的影响

[目的]探讨沉默SALL4基因对乳腺癌耐药细胞MCF-7/A的增殖及化疗敏感性的影响.[方法] qRT-PCR和Western Blot实验检测MCF-7、MCF-7/A细胞内SALL4表达水平,运用慢病毒包装shRNA方法沉默MCF-7/A细胞的SALL4基因;实验组(Lv-shSALL4)、阴性对照组(Lv-shNC)和空白对照组(CON).CCK8法、克隆形成实验检测SALL4沉默对细胞增殖能力的影响;CCK8法检测表柔比星处理细胞24h和48h的半数抑制浓度(IC50);流式细胞仪检测细胞凋亡.[结果] SALL4在MCF-7/A细胞中的表达水平显著高于MCF-7 (P＜0.05).MCF-7/A细胞中SALL4基因被成功沉默,病毒感染MCF-7/A细胞72h后,细胞感染效率约95％,沉默SALI4基因后MCF-7/A细胞内SALL4 mRNA及蛋白表达均明显降低(P＜0.05).沉默MCF-7/A细胞的SALL4基因,显著抑制了细胞的增殖能力(P＜0.05),增强了细胞对表柔比星的敏感性;表柔比星24h和48h的IC50均明显降低(P＜0.05),并且表柔比星诱导的细胞凋亡增加(P＜0.05).[结论]沉默SALL4基因能够抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/A的增殖,增强耐药细胞对表柔比星的敏感性.SALL4基因沉默可能是乳腺癌治疗的新靶点.     

survivin—siRNA联合化疗药物对乳腺癌MCF-7细胞凋亡及逆转耐药的研究

目的观察靶向survivin的siRNA联合紫杉醇和表柔比星对乳腺癌MCF-7细胞凋亡及逆转耐药的影响。方法构建靶向survivin的siRNA表达质粒,转染乳腺癌MCF。7细胞,荧光定量聚合酶链反应（PCR）,Westernblot技术检测转染前后survivin基因表达的变化,CCK．8法检测靶向survivin的siRNA联合紫杉醇、表柔比星对MCF-7细胞药物敏感性的影响,利用流式细胞术检测细胞凋亡作用。结果survivin—siRNA-2能有效抑制survivinmRNA（0．30±0．03）和蛋白的表达（0．37±0．09）（P〈0．05）;紫杉醇[24、48h抑制率分别为（38．5±4．0）％、（41．7±6．3）％]、表柔比星[24、48h抑制率分别为（37．0±8．6）％、（40．6±12．1）％1均可抑制MCF-7细胞增殖并诱导部分细胞凋亡;当与survivin—siRNA联合时上述作用显著加强f紫杉醇24、48h抑制率分别为（76．0±2．9）％、（85．1±4．0）％;表柔比星24、48h抑制率分别为（74．6±5．6）％、（82．5±4．8）％1（P〈0．05）,并且细胞抑制率呈现时间、剂量依赖性。结论利用RNA干扰阻断survivin基因表达同时联合相应化疗药物可以显著增强MCF-7细胞对药物敏感性并促进其凋亡,该方法在乳腺癌治疗中具有潜在的临床应用价值。     

PUMA基因转染乳腺癌MCF-7细胞增强表柔比星致凋亡敏感性的研究

  目的  探讨PUMA基因转染是否增强乳腺癌MCF-7细胞对表柔比星致凋亡的敏感性。   方法  应用脂质体介导重组真核表达载体PUMA-pCDNA3和空载体pCDNA3质粒瞬时转染至乳腺癌MCF-7细胞中, G418筛选阳性细胞。将系列浓度(0.01~100μmol/L)的表柔比星分别作用于MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3细胞72 h, MTT法测定各组细胞的存活率并计算IC50, FCM、TUNEL法检测细胞凋亡情况, Western blotting检测各组细胞PUMA蛋白表达的变化。   结果  MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3细胞的表柔比星IC50分别为(13±1.4)、(1.8±0.2)和(10.7±1.3)μmol/L, MCF-7/PUMA细胞对表柔比星作用的敏感性增加了7.2倍。表柔比星以剂量依赖方式诱导MCF-7细胞凋亡, 但对MCF-7/PUMA细胞所诱导的凋亡比MCF-7和MCF-7pCDNA3更明显。低浓度表柔比星(0.1μmol/L)轻微引起MCF-7/pCDNA3[(1.15±0.26)%]和MCF-7细胞凋亡[(0.9±0.24)%], 但能诱导MCF-7/PUMA细胞明显凋亡[(6.44±1.46)%]; 高浓度表柔比星(1μmol/L)诱导各组细胞凋亡, 但表柔比星MCF-7/PU MA细胞凋亡率[(35.47±9.36)%]明显高于MCF-7[(12.6±3.73)%]和MCF-7/pCDNA3细胞[(15.2±5.17)%], 差异均有统计学意义(P < 0.01);FCM和TUNEL方法检测显示相同的结果。PUMA蛋白在MCF-7/PUMA细胞中的表达明显高于MCF-7和MCF-7/pCD NA3细胞。   结论  PUMA基因稳定转染明显地增强了乳腺癌MCF-7细胞增强表柔比星致凋亡作用的敏感性。      

ING4基因表达对乳腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的：研究人ING4基因对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用。方法：通过实时荧光定量-PCR（real-time fluorogentic quantitative-PCR，RFQ-PCR）检测3种乳腺癌细胞株中ING4 mRNA的表达水平；ING4基因的表达质粒转染MCF-7细胞；MTT法和FCM法检测ING4基因对MCFM细胞增殖的影响；Annexin-V／PI双染法观察细胞凋亡情况；RT-PCR法分析转染／NG4后p53、p21及bax基因的转录表达情况。结果：在3种乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-435和MDA-MB-231中ING4的表达均明显低于正常乳腺组织。转染ING4表达载体的MCF-7细胞较对照组细胞生长速度减慢（P〈0．05）；细胞周期中G1期比例增加，S期比例减少；细胞凋亡率升高。p53的表达未见明显变化，而p21和bax表达显著上调。结论：ING4与乳腺癌的发生发展具有一定相关性；高表达ING4基因能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长。     

p21对肝癌细胞中survivin转录的影响及调控机制的探讨

目的 研究细胞周期依赖性激酶抑制蛋白p21对人肝癌细胞survivin转录抑制的调控作用,并探讨其相应机制.方法 使用多柔比星处理人肝癌细胞株HepG2,采用脂质体法将质粒pEGFP-C2-p21导入HepG2细胞,用G418筛选转染后的HepG2-p21和HepG2-pEGFP细胞;采用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测p21、p53和survivin的mRNA表达;采用流式细胞仪分析转染后细胞周期的变化;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后E2F-1和p300的mRNA表达.结果 经多柔比星处理后,HepG2细胞中p21和p53 mRNA的表达先增高,然后逐渐降低;survivin mRNA的表达则相反.转染后,HepG2-p21细胞中p21 mRNA的表达明显增高,分别为HepG2和HepG2-pEGFP细胞的2100.1倍和980.9倍;survivin mRNA的表达却明显降低,分别为HepG2和HepG2-pEGFP细胞的0.5%和0.6%;p53 mRNA的表达差异无统计学意义.流式细胞仪检测显示,HepG2-p21细胞的细胞周期明显阻滞在G0/G1期.HepG2-p21细胞中E2F-1和p300 mRNA的表达水平分别为0.75±0.04和0.18 ±0.06,与HepG2和HepG2-pEGFP细胞比较,含量均明显减低(P＜0.05).结论 p21可能通过抑制survivin的转录调控因子E2F-1和p300 mRNA的表达,从而抑制细胞中survivin的表达,并导致细胞出现G0/G1期阻滞.     

p21~(waf1)基因转染对乳腺癌细胞增殖活性的影响

目的 探讨p21waf1基因转染对人乳腺癌细胞增殖活性影响及意义.方法 应用脂质体介导法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染入人乳腺癌MCF-7细胞系,并得到稳定的表达.通过荧光定量PCR、Western blot法分别检测p21waf1基因表达及蛋白表达情况, MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 p21waf1基因转染后乳腺癌细胞生长显著受抑制,细胞周期停滞于G1期,转染组G1期、S期和G2/M期细胞比例分别为(70.52±3.21)%、(16.38±1.17)%、(9.42±0.98)%,未转染组则为(49.84±1.58)%、(36.83±1.36)%、(15.64±1.09)%,二者相比差异有统计学意义.结论 p21waf1基因转染能够抑制人乳腺癌细胞周期演进和增殖活性,进而阻止乳腺癌的发生、发展,为乳腺癌治疗的一种新手段.     

表柔比星对乳腺癌微球体细胞和单层细胞作用的比较

目的:探讨表柔比星(epirubicin)对乳腺癌微球体细胞和单层细胞的不同作用.方法:MCF-7细胞在干细胞培养条件下进行微球体培养,MTT法检测表柔比星对MCF-7微球体细胞和单层细胞的抑制率,FCM 法检测表柔比星作用下,MCF-7微球体细胞和单层细胞中CD44+CD24-的表达及细胞周期变化.结果:相同质量浓度下,当表柔比星的质量浓度>100 ng/mL时,对MCF-7微球体细胞的抑制率明显低于对单层细胞的抑制率(P<0.01);表柔比星(400 ng/μL)作用72 h后,MCF-7微球体细胞的CD44+CD24-/low 比例为 (22.8±4.8)%,高于单层细胞的(3.3±0.8)%(P<0.01);MCF-7微球体细胞含有较高比例的G0/G1期细胞(74.33 ± 3.20)%,高于MCF-7单层细胞的(53.40±3.45)%(P<0.01),表柔比星对微球体细胞与单层细胞的G0/G1期影响较小,但显著影响S期及G2期的比例.结论:表柔比星对MCF-7微球体细胞的细胞毒作用较低,并可用于富集乳腺癌干细胞,其对微球体细胞G0/G1比例影响较小.     

沉默HuR的表达增加人乳腺癌耐药MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性

目的：研究RNA干扰人抗原R（human antigen R,HuR）基因的表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对多柔比星（doxorubicin）敏感性的影响。 方法： 构建靶向 HuR基因 的shRNA表达质粒（pGenesil-siHuR）,稳定转染至MCF-7/Adr细胞,real-time PCR检测细胞中 MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测MCF-7/Adr细胞中由 MDR1 基因编码的P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达,MTT法检测pGenesil-siHuR 转染后MCF-7/Adr细胞在多柔比星作用后的存活率和IC50,流式细胞术检测MCF-7/Adr细胞的凋亡率。 结果： 与未转染的MCF-7/Adr细胞比较,pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞中 MDR1 mRNA的表达水平明显减低\[（0184±0.029） vs （1.203±0.026）,P<0.01\],P-gp表达水平明显降低。pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞后,MCF-7/Adr细胞对多柔比星的IC50从未转染的(148.2±2.3）nmol/L降至(42.9±0.4）nmol/L;经多柔比星处理后,pGenesil-siHuR质粒转染组MCF-7/Adr细胞的凋亡率明显上升\[（34.6±1.1）% vs （1.1±0.2）%,P<001\]。 结论： RNA干扰HuR的表达能抑制 MDR1基因 的表达,增加耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性。     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53cDNA真核细胞表达载体pEGFP-p53(RS)和pEGFP-p53(AS)。用Lipofectin介导转染801D细胞。PCR检测外源p53和neo基因，荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白，免疫组化染色检测突变蛋白表达。比较pEGFP-p53(AS)-801D和pEGFP-p53(RS)-801D的集落形成试验和裸鼠移植试验，用流式细胞术分析细胞周期。结果 PCR检测出外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，免疫组化检测示pEGFP-p53(AS)-801D突变蛋白呈阴性，母系为阳性，表明反义p53能封闭突变p53蛋白表达，pEGFP-p53（RS）-801D和pEGFP-p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤性均降低，pEGFP-p53(RS)-801D更为明显。pEGFP-p53(AS)-801D细胞周期阻滞于G1期。结论 在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要的作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可恢复重建其功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

siRNA沉默DNMT1对人乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

目的 靶向人DNMT1（DNA methyltransferase 1, DNMT1）构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法 靶向DNMT1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA) 的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-DNMT1,转染至乳腺癌细胞株MCF-7,定量PCR 法检测DNMT1 mRNA表达水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT 法检测细胞生长情况;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;定量PCR 法分析沉默DNMT1基因后对RASSF1A、p16、p21、p27及ERβ基因表达的影响。结果 在构建的靶向DNMT1的shRNA重组质粒pGCsi-DNMT1中,成功筛选到pGCsi-T3能显著下调DNMT1的表达。实时定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-DNMT1对乳腺癌MCF-7细胞中DNMT1基因的转录有明显的抑制作用。MCF-7细胞转染后,pGCsi-DNMT1可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G₁/G₀期细胞显著增加;定量PCR检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、p16、p21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而p27基因表达水平未见明显变化。结论 重组质粒pGCsi DNMT1能特异有效地抑制MCF-7细胞内DNMT1的表达、 抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并可通过抑制DNMT1的活性来解除相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而促进肿瘤相关基因的表达,提示DNMT1可作为乳腺癌基因治疗的新靶标。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。