登革2型病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用登革2型病毒参考株免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1000作用下进行融合,获得了10株分泌抗登革2型病毒单克隆抗体的杂交瘤。经间接免疫荧光鉴定,有4株杂交瘤产生的单克隆抗体对登革2型病毒是型特异的;2株对登革1型有交叉反应;1株对登革3型有交叉反应;1株对登革4型有交叉反应;另2株为黄病毒属特异的。经补体结合和血凝抑制试验鉴定,有2个单克隆抗体是黄病毒属血凝抑制特异的。这10个单克隆抗体对登革热的诊断是很有用的。     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用登革4型H241株病毒免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了5个产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞的上清液及小鼠腹水抗体均用间接免疫荧光法检测。其中两个杂交瘤细胞系产生的抗体对登革4型病毒具有型特异性,它们的荧光抗体滴度分别为1:10,240～1:20,480和1:2,560。另两个细胞系产生的抗体对登革2型病毒有交叉;另1个对登革1型病毒有交叉。     

用单克隆抗体快速鉴定登革病毒

用登革病毒参考株免疫的BALB/C鼠的脾细胞与SP2/O鼠骨髓瘤细胞融合,成功地建立了分泌抗登革1～4型病毒单克隆抗体的杂交瘤31株。经免疫荧光交叉鉴定,其中17株杂交瘤的抗体是属登革型特异的。用4个型特异的单克隆抗体对国内分离的12令登革地方毒株进行了免疫荧光的快速鉴定,获得了高度敏感高度特异的结果。证明获得的单克隆抗体可以作为免疫荧光诊断制剂,提供登革热病原的快速鉴定应用。     

登革1型病毒的单克隆抗体

我们用SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用登革1型病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞在融合剂PEG-1000的诱导下进行融合,获得了15株产生抗登革1型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中14株属登革病毒型特异,1株属登革病毒亚群特异,它们的荧光效价均在10,240以上。15株杂交瘤均无血凝活性,3株有补体结合活性。1D_4,1B_9的IgG亚类为IgG_1,1F_(11)为IgG_2a,轻链均为K型。1株杂交瘤(1D_4)的染色体数为87～115。用SDS-PAGE测定1D_4分子量,重链为54,000,轻链为24,000。15株杂交瘤连续传代3～6个月,冻存复苏后抗体水平未见下降。     

森林脑炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用森林脑炎病毒森张株免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂PEG-1000的作用下进行融合,用间接免疫荧光法筛选,获得了6株分泌抗森林脑炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过免疫荧光交叉鉴定,6份单克隆抗体均与黄病毒属的登革4型病毒、流行性乙型脑炎病毒无属间交叉.与森林脑炎病毒COφ株、国内的森候株、森董株有交叉反应,属森林脑炎病毒种特异.6份单克隆抗体均无血凝抑制活性和补体结合活性.3株杂交瘤细胞培养上清浓缩物经抗鼠Ig免疫血清双扩鉴定为IgM.染色体数的检查为89～110条.6株杂交瘤细胞连续传代3～6个月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的单克隆抗体.     

登革病毒单克隆抗体鉴定及其血清学性质观察

利用补体结合试验(CF)和血凝抑制试验(HI)对83份免疫荧光阳性的登革病毒单克隆抗体进行了鉴定,11份CF阳性,8份HI阳性。登革1型和4型病毒的单克隆抗体仅有CF活性,其中4F_7和4F_9滴度达到1:20480～1:40960,并且为CF型特异。而登革2型和3型病毒的单克隆抗体,则仅有HI活性,除3D_4为HI型特异外,其余均为HI属特异,与其他黄病毒属抗原有明显交叉。     

基孔肯亚病毒中和单克隆抗体的筛选与鉴定

目的 :建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体细胞株 ,筛选具有中和活性的特异性单克隆抗体。方法 :利用细胞融合技术建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,用细胞培养中和试验初筛具有中和活性的单克隆抗体 ,用固定单克隆抗体稀释病毒方法进行乳鼠中和试验 ,进一步验证单克隆抗体的保护作用 ;用中和交叉试验鉴定中和单克隆抗体反应的特异性。结果 :用免疫荧光法检测建立了 9株能稳定分泌抗基孔肯亚病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,初筛出 4株具有中和活性的单克隆抗体 ,其中 1F1单克隆抗体稀释 2 0 0倍时可保护 50 %细胞不产生细胞病变 ;乳鼠中和试验1F1单克隆抗体中和指数为 10 3.3,对试验小鼠有较强的保护作用。中和交叉试验表明 ,1F1单克隆抗体只中和基孔肯亚病毒 ,与其他病毒无交叉反应 ,特异性较高。结论 :制备了 9株抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,筛选得到了 1F1具有较强中和活性的特异性单克隆抗体 ,可望为基孔肯亚病毒病的诊断、紧急预防与治疗提供良好试剂     

利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系

目的:利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系,为研究E蛋白的结构和功能及其抗原表位提供新手段.方法:以构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,免疫BALB/c小鼠后将其脾细胞和SP2/0瘤细胞融合,通过IFA、间接ELISA和空斑减少中和试验对杂交瘤细胞系进行筛选和鉴定.结果:获得了4株分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系(2B4,6B4,4C10和2D5),它们结合的抗原表位均位于E蛋白Ⅲ区,其中4C10对登革2型病毒具有中和活性.这些单抗与登革1、3和4型病毒有强的交叉反应,但与黄病毒其他成员反应较弱.结论:DNA免疫法可用于分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系的建立,该结果有利于登革病毒E蛋白特异抗原表位的研究及新的登革病毒诊断试剂的研制.     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

登革热是东南亚地区由虫媒病毒引起的重要传染病之一。在登革病毒1—4型中,以4型病毒引起的病情最严重,出血型病例多,病死率高。我国在1978—1980年间,曾连续发生了登革热的暴发流行。在病原诊断中,用白纹伊蚊C6/36细胞大大提高了病毒分离率,但在鉴定分型中,因交叉反应明显造成困难。由于登革病毒具有型间和组间的共同抗原,故用一般的动物免疫血清或免疫腹水进行鉴定分型时,交叉反应难以克服。采用淋巴细胞杂交瘤技术,能够制备出对病毒单一抗原决定簇的单克隆抗体,可以很好地解决上述交叉问题。国外已有登革3型和2型病毒单克隆抗体的报导。为了平时和战时提供登革病毒型特异的诊断制剂,解决     

肾综合征出血热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与鉴定

用陕西省分离的肾综合征出血热(HFRS)病毒82-010H株免疫BALB/c纯系鼠和CxS/2小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/O小鼠骨髓瘤细胞融合,获得10株分泌HFRS病毒特异性抗体的杂交瘤细胞系,对其中3H_4和4B_9两株单克隆抗体进行了鉴定。用各地分离的16株HFRS病毒抗原片与该两株单克隆抗体作了间接免疫荧光试验,结果表明:4B_9单克隆抗体只能与重型(黑线姬鼠型)HFRS疫区的病毒呈现阳性免疫荧光反应,而对轻型(褐家鼠及大林姬鼠型)HFRS疫区分离的病毒株不呈现免疫荧光反应;而3H_4单克隆抗体又能将重型和轻型HFRS毒株再行区分,这可能对HFRS病毒血清学分型和抗原分析以及流行病学调查研究等均有意义。     

脾内注射法免疫小鼠制备抗—HBc单克隆抗体的研究

用基因工程菌产乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对 Balb/c 小鼠脾内多点注射法免疫,将该鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞在 PEG 作用下融合,用固相放射免疫分析法(SPRIA)筛选,成功地获得了2株抗-HBc 阳性的杂交瘤细胞株。通过中和试验和交叉鉴定,2株抗-HBc 单克隆抗体只能与 HBcAg 起反应,而不能与 HBsAg 和 HBeAg 反应。经多次亚克隆后,所得腹水中的抗-HBc 滴度达1:64000～1:28000。这2株单克隆抗体做包被抗体检测 HBcAg 和(125)~Ⅰ标记查患者血清标本时,所测得的结果与人抗-HBc 多克隆抗体做包被或(125)~Ⅰ标记所测得的结果相一致。2株杂交瘤细胞连续传代3个多月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的抗-HBc 单克隆抗体。     

登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的高效表达

目的：在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白B区进行表达，为观察其抗原性和免疫原性奠定基础。方法：将通过PCR扩增的登革2型病毒包膜蛋白B区插入高效原核表达栽体pBAD／Topo ThioFusion，然后在大肠杆菌中利用阿拉伯糖进行诱导表达。时表达产物以免疲印迹和ELISA法进行检测。结果和结论：登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在，表达量约占细菌可溶性总蛋白的62％。表达产物可与登革2型病毒的特异多抗反应，但与登革1、3和4型病毒的特异多抗无交叉反应。登革2型病毒包膜蛋白B区可在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。     

登革2型病毒株抗原分析

本文试用标记分析法研究我国海南地区3年来(1985～1987)流行的登革2(DEN-2)型病毒株抗原的变化.用3种单克隆抗体(黄病毒属特异、亚属特异及DEN-2型型特异)分析了8个DEN-2型流行株并与标准新几内亚B株进行了比较.发现5株与标准株类似,3株显示出明显差异.标记分析法为病毒抗原分析提供了一个简便快速的方法,并且可用来监测一个地区病毒株群的变化及新株的引入.     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

重组CPTα的亲和纯化及其单克隆抗体的制备

目的 :制备抗A型产气荚膜梭菌毒素α(CPTα)单克隆抗体 (mAb)并鉴定其生物学特性。方法 :利用工程菌株E .coliM15 /pQE30 CPTα表达的重组A型CPTα带有 6个组氨酸 (6×his)标签的特性 ,经Ni NTA螯合亲和层析方法纯化后 ,用纯化的重组CPTα免疫BALB/c鼠 ,以常规杂交瘤细胞融合技术、HAT选择性培养和间接ELISA进行筛选 ,并分析其亚类及中和保护作用。结果 :获得一株能稳定分泌抗CPTα的mAb杂交瘤细胞株 4E2 ,其分泌抗体亚类为IgG1。该mAb与重组CPTα和天然CPTα均可发生特异性反应 ,并可保护小鼠抵抗 2倍最小致死剂量CPTα的攻击 ,属中和性抗体。结论 :应用纯化的重组CPTα成功地获得了特异性的中和抗体mAb 4E2 ,为A型CPTα诊断抗体和治疗性抗体的研制奠定了基础。     

用单克隆抗体分析鉴定登革3型病毒的不同抗原决定簇

登革病毒(DEN)抗原成分复杂,与许多虫媒披膜病毒都有严重的血清学交叉反应。杂交瘤单克隆抗体(Mcab)技术建立之后,Dittmar等人首先制备出了抗DEN-3病毒的McAb,可进行DEN-3病毒的鉴定分型。随后,Henchal等人制备出了抗DEN1-4型病毒的McAb,用这些McAb进行DEN病毒抗原决定簇研究,依据间接免疫荧光染色(IFA)证实了DEN病毒的四种不同抗原决定簇,即:黄病毒属特异的、DEN-1-4型病毒特异的、DEN-1、3型病毒特异的和DEN病毒各型型特异的。阎国珍等人在研究抗DEN-4病毒McAb时,获得了抗DEN-2、4型病毒特异的McAb,证明DEN-2和DEN-4病毒间有共同特异抗原决定簇。本文介绍通过用抗DEN-3病毒McAb对不同披膜病毒抗原交叉反应测定来分析鉴定     

抗人IgM（μ链）单克隆抗体的制备

本实验用可溶性抗原人 IgM 免疫 BALB/C 小鼠,按常规方法取免疫鼠脾细胞,分别与 NS-1、SP2/0细胞进行融合,ELISA 法筛选只与 IgM 反应阳性的抗体分泌杂交细胞,建立了6株杂交瘤株。经鉴定,此6株细胞分泌的抗体与 IgM 产生特异性反应,而不与其它免疫球蛋白重、轻链及 J 链交叉反应。经免疫电转印的硝酸纤维膜染色只显示分子量为72kD 的电泳带。放射免疫方法检测6个单克隆抗体,可分别识别4个不同的抗原决定簇。此组抗体识别 B 细胞胞浆内及膜表面μ链并可检测乙型病毒性肝炎患者血清中 HB_C-IgM 复合物。本组抗体间彼此加合可提高检测的灵敏性。抗 IgM(μ链)单克隆抗体对研究人 B 细胞的分化、成熟及功能提供了重要途径。     

分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体的产生与特性鉴定

以B型肉毒类毒素免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合。用ELISA方法筛选有杂交细胞生长孔的上清液,其中有66.7％的孔可分泌肉毒毒素特异性抗体。用有限稀释法进行克隆化培养后,获得4株稳定的杂交瘤细胞系(3B10、3B11、3G12和4A5),在体外培养中均持续分泌抗体,培养液抗体效价达10~(-3)～10~(-5);注入BALB/C小鼠腹腔制备出富含抗体的腹水,抗体效价达10~(-6)～10~(-8)。经用A型和B型类毒素作特异性鉴定,表明抗体3G12及4A5与A型无交叉反应,为B型特异性的。抗体3B10及3B11与A型有弱交叉反应。Ig种类鉴定表明抗体3B10及3G12为IgG_1;抗体3B11及4A5为IgG_2。染色体检查证明4株细胞均为杂交瘤细胞。小白鼠体内进行中和保护力测定表明4种单克隆抗体对肉毒毒素均无保护作用。     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～ 4型病毒复制的特异抑制作用