大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO体外标记的实验研究

目的探索体外超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)标记大鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)及其条件优化,为下一步EPCs活体示踪实验奠定基础。方法采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓EPCs,不同浓度的SPIO体外标记EPCs,普鲁士蓝染色测定细胞标记率,MTT法检测细胞增殖力,台盼蓝染色检测细胞活力。结果 EPCs培养约7 d逐渐生长呈单层排列,SPIO浓度为50μg/m L时普鲁士蓝染色显示标记率达到90%,标记后的EPCs生长状态良好,能正常贴壁生长并传代,台盼蓝染色及MTT法显示此时细胞活力及增殖能力最强。结论 SPIO浓度为50μg/mL时标记EPCs其标记率高,不影响细胞的活力及增殖能力,可为下一步EPCs活体示踪实验奠定基础。     

PEI/SPIO对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的探讨应用新型聚乙烯酰胺（PEI）包覆的超顺磁性氧化铁（SPIO）标记骨髓间充质干细胞（bMSCs）对其生物学特性的影响。方法分离、培养贵州小香猪bMSCs,选取第3代bMSCs,用含铁浓度为4、6、8、10、12μg/ml的DMEM/F12培养液孵育24h,未标记组为对照。通过普鲁士蓝染色、透射电镜检查、胎盼蓝染色、MTT检测及成骨、成软骨、成脂诱导分化实验,探讨不同PEI/SPIO浓度对bMSCs标记效率、细胞活性、增殖及分化的影响。结果铁浓度为8μg/ml以上的SPIO标记bMSCs后,普鲁士蓝染色标记效率均接近100%。与对照组相比,Fe浓度为4、6、8μg/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs活细胞比率均在95%以上,差异无统计学意义（P〉0.05）;而Fe浓度为10μg/ml时,活细胞比率约为（80.24±1.34）%,Fe浓度为12μg/ml时,活细胞比率约为（75.44±2.33）%,两者对细胞的活性有明显的抑制作用（P〈0.05）。4、6、8g/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs成骨、成软骨及成脂分化与正常对照组相比无明显差异,而10、12ug/ml组在诱导培养过程中大部分细胞死亡。结论含铁浓度8μg/ml是PEI/SPIO标记干细胞的适宜浓度,既能高效地标记bMSCs,又不影响bMSCs的细胞活性及增殖分化能力等生物学特性。     

超顺磁性纳米铁颗粒标记许旺细胞及体外磁共振示踪的实验研究

目的 研究超顺磁性纳米铁颗粒(SPIO)体外标记小鼠许旺细胞(SCs)及MRI成像示踪的可行性.方法 分离、纯化新生C57BL/6小鼠(5～7 d)的许旺细胞,取已分别用25.0 μg/ml、50.0 μg/ml浓度SPIO标记的0.5×106、1.0×106、5.0×106个许旺细胞,普鲁士蓝染色和透射电镜观察标记细胞内铁颗粒的分布情况,并用不同MRI扫描序列,测定标记的细胞群信号.结果 0.5×106、1.0×106、5.0×106小鼠许旺细胞与不同浓度的SPIO共同培养24 h后,普鲁士蓝染色见细胞内有许多蓝染的铁颗粒;透射电镜检查显示致密的铁颗粒位于细胞的吞噬泡或溶酶体中.体外MRI呈明显的低信号改变,以T2WI和GRE/30°序列改变最为明显.结论 SPIO可以标记小鼠许旺细胞,应用MRI可以对其进行体外示踪和监测.     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记滑膜间充质干细胞的实验研究

目的探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)标记滑膜间充质干细胞(SMSC)的可行性及标记前后细胞生物学特性的变化。方法将体外分离培养、纯化及鉴定后的兔膝关节SMSC加入不同浓度的SPIO标记液在37℃二氧化碳培养箱孵育,24 h后普鲁士蓝染色和透射电镜下观察标记情况,并比较标记前后SMSC的细胞活性及细胞增殖能力情况。结果 SPIO标记后SMSC经普鲁士蓝染色细胞质内可见蓝染颗粒,细胞标记率均达95%以上,且随着标记浓度的增高,细胞质蓝染铁颗粒增多,颜色加深。透射电镜下观察,细胞质及吞饮小泡内可见大量高电子致密度颗粒,呈阳性。在标记液浓度为(12.5~50)μg/ml时,标记后的细胞增殖能力与细胞活力与标记前比较无明显差别;当标记液浓度为100μg/ml以上时,细胞增殖能力与细胞活力受到抑制。结论根据初步研究,一定浓度范围的SPIO标记兔SMSC是安全可行的,为解决SMSC在关节内的示踪问题具有重要意义。     

成年犬骨髓间充质干细胞的体外SPIO标记研究

目的 探讨超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)对于骨髓间充质干细胞(BMSCs)的标记能力以及合适的标记条件.方法 采集成年犬的BMSCs,进行体外培养扩增后,行SPIO标记,观察不同条件下BMSCs的SPIO标记情况及SPIO对BMSCs活性的影响.结果 4.5μg/ml及9.0μg/ml标记组细胞内含有大量的SPIO颗粒,细胞活性未受影响.细胞内铁颗粒的数量随着标记物浓度的增加而增加.18.0μg/ml标记组细胞内SPIO聚集成团,部分细胞崩解.标记了SPIO的BMSCs达到一定细胞数量(5.0×104)时,可以在体外磁共振显像(MRI).随着标记细胞的培养时间延长,细胞内SPIO颗粒逐渐减少(标记1、2、4、8周BMCSs台盼蓝拒染率分别为92.04±1.02、91.08±1.09、90.03±2.03和89.93±1.02),细胞死亡率变化没有统计学意义(P＞0.05).结论 SPIO可以作为一种很好的细胞示踪剂应用于体外细胞示踪.     

磁共振技术行移植细胞在体示踪

目的寻找一种能够对移植细胞进行在体示踪方法,为细胞的迁移、分布及心功能改善机制的研究提供更多的信息。方法将超顺磁性氧化铁(SPIO)和骨髓间充质干细胞(MSCs)共同孵育培养36h。普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检验标记后细胞的活性;应用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其分化能力。将标记的细胞移植到中华小型猪心肌内。通过心脏MRI进行连续的在体示踪观察。细胞移植后不同时期取动物心脏切片进行普鲁士蓝染色观察移植细胞。结果MSCs经铁离子标记后,普鲁士蓝染色标记效率>95%,此试剂不影响细胞增殖,标记后98%的细胞保持活性,可继续培养、传代,迁移能力和分化能力未受影响。动态观察显示SPIO标记细胞在MRI影像上表现为低密度灶影或信号缺失,并且在移植后4周仍可显影。病理学检查可以看到移植细胞呈普鲁士蓝染色阳性,与影像学有很好的一致性。结论磁共振对比剂SPIO可以安全、有效的标记骨髓间充质细胞,并可通过心脏MRI进行持续的在体示踪。     

声诺维超声辐照改善超顺磁性氧化铁纳米粒子对肝癌细胞Hep-G2体外标记效果

【摘要】 目的 探讨声诺维超声辐照改善体外超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)对肝癌细胞Hep-G2标记效果的可行性。方法 7组不同浓度的SPIO在体外与Hep-G2细胞混合,在加入声诺维后采用超声处理1 min,然后监测细胞标记效率、细胞活性和增殖能力。挑选标记效果好,且增殖能力影像小的375 μg[Fe]/mL SPIO浓度组,分别以细胞密度为1×102,1×103,1×104,1×105, 1×106,及 1×107(个细胞/mL),用临床1.5T磁共振进行扫描。结果 实验组中所有7个亚组的标记率都超过90%,两组对照组标记率约为2%。Hep-G2细胞活率随SPIO浓度增加而减低,其在500 μg[Fe]/mL、625 μg[Fe]/mL、750 μg[Fe]/mL和875 μg[Fe]/mL的活率分别为59.7%±7%、47.76%±9%、46.27%±10%和43.28%±7%,提示当SPIO浓度达到或大于500 μg[Fe]/mL时对Hep-G2细胞具有明显毒性,但其增殖活性并无明显差异。体外磁共振扫描结果显示T2W1序列信号减低,能敏感显示SPIO浓度的变化;其信号强度与细胞浓度呈负相关(P<0.05)。 结论 声诺维超声辐照确实能改善体外SPIO对肝癌细胞Hep-G2的标记效率,MRI可切实、敏感地对其进行检测。     

超顺磁性氧化铁标记内皮祖细胞治疗静脉血栓的示踪研究

目的研究血管内皮祖细胞（EPCs）磁标记后从尾静脉移植人静脉血栓模型中进行干细胞活体示踪,为EPCs促进深静脉血栓机化再通提供一种有效的监测方法。方法首先分离、培养并鉴定大鼠EPCs,配制新型超顺磁性氧化铁（SPIO）并体外标记EPCs。制作大鼠下腔静脉血栓模型并将其分为4组：移植SPIO标记的EPCs（SPIO组）、移植Dil标记的EPCs（Dil组）、移植单纯EPCs（对照组）、移植1mL培养基（空白对照组）。术后各组分别行磁共振成像（MRI）检查、血管性血友病因子（vWF）免疫组织化学染色、HE染色,并计数新生毛细血管数目。结果MRI观察到SPIO组的EPCs定向迁移至下腔静脉血栓内,呈团块状信号影,信号密度随时间延长而增强,第14～21d磁信号达到最强并由此开始转弱。移植术后取血栓标本行常规病理HE染色及免疫组织化学染色的结果显示,SPIO组、Dil组及对照组均可观察到血栓中出现大量新生毛细血管管腔,3组间新生毛细血管数目比较差异无统计学意义（P〉0．05）,但这3组新生毛细血管数目明显多于空白对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论相比较Dil标记的示踪方法,SPIO标记的EPCs移植入深静脉血栓中进行活体MRI示踪安全、无创、有效、可行。     

磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植后MR活体示踪研究

目的探讨利用磁共振成像对移植肝脏的磁标记猪骨髓间充质干细胞进行活体示踪的可行性。方法获取猪自体骨髓间充质干细胞,分离、培养、扩增。应用菲立磁（Feridex）标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,标记细胞组（n=6）和未标记细胞组（n=4）行经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6h、3d、7d行磁共振T1WI,T2WI,GRE序列成像,7d后行组织切片普鲁士蓝染色。结果：普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100％,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2＊WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后7d,组织切片普鲁士蓝染色显示7d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝窦中。结论利用SPIO可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,磁共振成像可以对经门静脉移植到肝内的磁标记MSCs进行活体示踪。     

新型MRI磁标记技术对兔骨髓基质干细胞自体皮下移植进行活体示踪的研究

目的 利用超顺磁性氧化铁(SPIO)粒子标记骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨用0.2T MRI活体示踪自体皮下移植磁化标记BMSCs的分布和迁移的可行性. 方法 从兔骨髓中分离培养BMSCs,实验组经体外采用SPIO和BrdU双重标记后,与壳聚糖复合植入兔自体大腿皮下.设立自体皮下移植未标记BMSCs组和皮下单纯注射SPIO组为对照组,每组6只.于术后1、5 d及2、4、8周连续行MRI梯度回波T2加权(GRE T2* WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪,并行组织学检查. 结果 磁标记细胞普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞胞浆内含致密铁颗粒.磁标记后自体皮下移植的兔BMSCs在GRE T2* WI序列成像时产生特征性的低信号改变至少维持8周,并观察到从移植部位发出低信号线进入宿主组织.组织学检查显示宿主组织中发现普鲁士蓝阳性细胞和BrdU阳性细胞.结论 体外SPIO能有效地标记BMSCs,利用0.2T MRI活体示踪体自体皮下移植的磁标记兔BMSCs分布和迁移是可行的.     

急性肝损伤后猪自体骨髓间充质干细胞肝内移植的MR活体示踪实验研究

目的 探讨应用临床型1.5T磁共振活体示踪磁标记猪骨髓间充质干细胞(MSCs)自体移植肝脏的可行性.方法 获取、分离、培养、扩增猪骨髓MSCs.应用菲立磁标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,建立急性肝损伤模型,分为标记细胞组(n=6)和未标记细胞组(n=4)经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6 h、3 d、7 d、14 d行磁共振FFE(T_2WI)序列成像,14 d后行组织切片普鲁士蓝染色.结果 普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达100%,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T_2WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后14 d,组织切片普鲁士蓝染色显示14 d后仍有磁标记细胞存在于肝实质及肝窦中.结论 利用菲立磁可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,磁共振成像可以对经门静脉移植到肝内的磁标记MSCs进行活体示踪.     

Amine‐surface‐modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles interfere with differentiation of human mesenchymal stem cells

Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles have been widely used for stem cell labeling and tracking. Surface modification has been known to improve biocompatibility, biodistribution, and labeling efficiency of SPIO nanoparticles. However, the effects of amine (NH)‐surface‐modified SPIO nanoparticles on proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs) remain unclear. The purpose of this study is to investigate how amine‐surface‐modified SPIO nanoparticles affected hMSCs. In this study, intracellular uptake and the contiguous presence of amine‐surface‐modified SPIO nanoparticles in hMSCs were demonstrated by Prussian blue staining, transmission electron microscopy and magnetic resonance imaging. Moreover, accelerated cell proliferation was found to be associated with cellular internalization of amine‐surface‐modified SPIO nanoparticles. The osteogenic and chondrogenic differentiation potentials of hMSCs were impaired after treating with SPIO, while adipogenic potential was relatively unaffected. Altered cytokine production profile in hMSCs caused by amine‐surface‐modified SPIO nanoparticles may account for the increased proliferation and impaired differentiation potentials; concentrations of the growth factors in the SPIO‐labeled condition medium including amphiregulin, glial cell‐derived neurotrophic factor, heparin‐binding EGF‐like growth factor and vascular endothelial growth factor, as well as soluble form of macrophage colony‐stimulating factor receptor and SCF receptor, were higher than in the unlabeled‐condition medium. In summary, although amine‐surface‐modified SPIO labeling is effective for cell tracking, properties of hMSCs may alter as a consequence and this needs to be taken into account when evaluating therapeutic efficacies of SPIO‐labeled stem cells in vivo. © 2012 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 30:1499–1506, 2012     

大鼠蛛网膜下腔移植超顺磁性氧化铁纳米离子标记永生化神经前体细胞后的磁共振成像追踪

目的观察大鼠蛛网膜下腔移植超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）标记永生化神经前体细胞后的磁共振成像追踪。方法用SPIO-多聚赖氨酸复合物（SPIO-PLL）标记永生化神经前体细胞。采用普鲁士蓝染色鉴定SPIO-PLL标记永生化神经前体细胞的效率，采用MTT法检测标记前后细胞活力，用免疫细胞化学法对标记后1周的细胞进行抗巢蛋白、微管相关蛋白和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色，检测标记细胞的分化能力。蛛网膜下腔置管成功的SD大鼠10只，随机分为2组（n=5），标记细胞组和未标记细胞组，蛛网膜下腔分别移植标记后2d的永生化神经前体细胞和未标记细胞，移植后30min及移植后1周用MRI对蛛网膜下腔的细胞进行活体追踪，用组织切片进行普鲁士蓝染色和抗猿肾病毒40大T抗原染色。结果SPIO可以高效率地标记永生化神经前体细胞，普鲁士蓝染色显示SPIO—PLL标记永生化神经前体细胞质内出现细小的天蓝色铁颗粒，SPIO-PLL标记对永生化神经前体细胞的活力没有明显的影响，标记后1周，抗巢蛋白、微管相关蛋白染色阳性，GFAP染色阴性。标记细胞组移植后30min及移植后1周MRI活体检查发现标记细胞在磁共振成像上呈明显的低信号改变，脊髓组织学切片结果普鲁士蓝、抗猿肾病毒40大T抗原染色阳性；未标记细胞组磁共振成像上无明显低信号改变。结论利用MRI技术可以对蛛网膜下腔移植后的标记细胞进行活体追踪。     

菲立磁标记大鼠骨髓基质干细胞对其生物活性的影响

目的 观察菲立磁(Feridex)标记对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的增殖及向肝细胞分化能力的影响,探讨Feridex标记大鼠BMSCs的最佳标记方案.方法 SD大鼠BMSCs按Fefi-dex浓度11.2、14.0、16.8、19.6mg/L分组并进行标记,设空白对照组(无Feridex标记的BMSCs).采用普鲁士兰染色和透射电镜鉴定Feridex标记后各组BMSCs的标记效率.噻唑蓝(MTY)比色法检测Feridex标记后各组BMSCs的增殖水平.逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测Feridex标记后各组BMSCs经肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF)共同诱导后ALB和AFP基因的表达水平.结果 11.2、14.0、16.8、19.6 mg/L组的标记率分别为71%、83%、91%、96%.16.8 ms/L和19.6 mg/L组的标记率显著高于11.2 ms/L和14 mg/L组(P<0.05).11.2、14.0、16.8 mg/L组的细胞增殖水平及诱导后ALB、AFP基因表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而19.6 mg/L组的细胞增殖水平及诱导后ALB、AFP基因表达水平显著低于空白对照组(P<0.05).结论 Fefidex浓度16.8mg/L可能是Feridex标记BMSCs最适标记浓度,该浓度既能使Fefidex对BMSCs的标记达到较理想效果,同时不影响BMSCs的增殖及向肝细胞分化的能力.