了本血吸虫CuZn-SOD基因全长cDNA的识别及真核表达载体的构建

目的 识别日本血吸虫大陆株铜锌超氧化物歧化酶(Sj CuZn-SOD)基因，构建Sj CuZn-SOD的真核表达载体。方法 将曼氏血吸虫(Sm)的CuZn-SOD全长cDNA序列上网比对，寻找Sj相关EST。设计特异性引物从尾蚴cDNA文库扩增相应序列，经双酶切、连接、转化，克隆入pcDNA3.0真核表达质粒，并鉴定阳性克隆。结果 找到Sj相关EST(登录号BU794891)，核酸阅读框(ORF)分析和BLAST比对分析等方法判断为Sj CuZn-SOD完整的cDNA编码序列，含462 bp完整阅读框，编码154aa。经单双酶切、PCR扩增、核酸测序鉴定，验证成功构建了pcDNA 3．0-SOD真核重组表达载体。结论 成功构建真核重组表达载体pcDNA3．0-SOD，为在真核表达系统研究Sj CuZn-SOD基因功能奠定了基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的为了进一步研究日本血吸虫(中国大陆株)Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识.方法根据曼氏血吸虫Sm1 6基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DH5a菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆.以重组pcDNA3-Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较.结果从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3-Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码¨7氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异.结论成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础.     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 为了进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DHA5α菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。以重组pcDNA3－Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3－Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码117氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异。结论 成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶基因片段在真核表达载体中的克隆

目的：为了寻找新的预防日本血吸虫病的侯选疫苗分子。方法：设计合成引物,以日本血吸虫成虫基因组DNA为模板,用PCR法扩增出丝氨酸蛋白酶（Sp）基因编码序列,其大小约450bp,将其克隆入pGEM－T载体,进行序列测定,并将Sp基因克隆入真核表达载体pBKCMV中。结果：PCR法扩增出SjSp基因编码序列,其大小约450bp,重组质粒pGEM－T－Sp和pBK-Sp经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为427bp的不完整开放阅读框,其与曼氏血吸虫丝氨酸蛋白酶（SmSp1）具有高度同源性。结论：本文首次报道了日本积压吸虫丝氨酸蛋白酶（SjSp）的部分基因编码序列,并克隆入了真核表达载体pBKCMV中,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫一种新腺苷酸激酶全长cDNA的克隆与功能分析

目的：对用表达序列标签（Expression Sequence Tag,EST）策略从日本血吸虫尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行功能预测。方法：用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用NCBI BLAST站点的blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较；利用Motif Scan in a Protein Sequence对cDNA序列所编码的蛋白质进行结构域搜索；利用CD－Search程序对目标蛋白进行保守区域搜索。结果：发现一个与曼氏血吸虫22kDa单核苷酸激酶mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，基因与氨基酸水平的同一性均分别为86．0％和87．0％；蛋白结构域搜索及保守区域搜索结果显示，该cDNA序列所编码的蛋白质是一种腺苷酸激酶。结论：用EST策略筛选新基因是一个可行的方法，所筛到的日本血吸虫新基因编码一种腺苷酸激酶，全长编码序列与曼氏血吸虫腺苷酸激酶mRNA高度同源。     

日本血吸虫TEGT基因的cDNA克隆和生物信息学分析

目的克隆日本血吸虫新基因TEGT(Sj.TEGT)的全长序列。方法根据编码日本血吸虫大陆株的EST基因片段的序列,设计5’RACE的系列引物,扩增Sj.TEGT的5’端,测序后预测该基因的全长ORF;再以此设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到Sj.TEGT的全长cDNA。结果从日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA中克隆到1个TEGT相关基因,命名为Sj.TEGT基因。其编码的蛋白的分子质量大约为30ku;对其编码的氨基酸序列的分析显示其编码蛋白有6个跨膜螺旋区。结论Sj.TEGT是一个新基因,有必要对其功能进行深入研究。     

日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列基因的全长cDNA序列分析

目的 对带有信号序列的日本血吸虫虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列进行分析。方法 根据日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列的cDNA片段序列设计合成基因特异性引物。以虫卵的第一链全长cDNA为模板，采用套式PCR，快速扩增带信号序列的虫卵毛蚴cDNA的5’、3’末端片段，将特异性扩增片段进行TA克隆与序列分析。将每个带信号序列的虫卵毛蚴cDNA片段序列与其5’、3’末端片段序列进行比对和拼接，构建每个带信号序列的虫卵毛蚴基因的完整全长cDNA序列，对部分带信号序列虫卵毛蚴基因的信号序列所对应的基因组序列结构进行分析。结果 本研究分析了30个带有信号序列的cDNA片段，其中16个片段的5’、3’末端cDNA序列被成功扩增，并测定了它们的DNA序列，通过序列比对和拼接，获得了该16个虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列。对开放阅读框演绎的氨基酸序列进行分析，发现基因SjP4001与SjP1531的信号肽序列完全相同，而基因SjP3742和SjP1183的信号肽氨基酸序列甚为相似，从而进一步证明不同的基因可拥有相同或相似的信号肽。基因组序列分析表明，基因SjP1183的信号肽基因序列与成熟肽基因序列通过交替拼接（alternative splicing）方式进行拼接；而基因SjP4001、SjP1531、SjP3742的信号肽基因序列与成熟肽基因序列之间可能是通过转移拼接的方式进行拼接。结论 确定了16个带有信号序列的虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列，虫卵毛蚴基因可通过交替拼接方式或转移拼接方式获得信号肽序列。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆与表达

目的：在体外高效表达具有生物学和免疫学活性的日本血吸虫卵壳蛋白，探讨其作为抗卵免疫靶抗原的可能性。方法：采用PCR技术扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因，将其克隆到pcDNA3质粒，在HeLa细胞中高效表达，对表达产物进行鉴定和免疫原性研究。结果：特异扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因编码序列（618bp），构建了真核表达质粒pcDNA3／ESG，在HeLa细胞中高效表达卵壳蛋白，其表达量高达24．4％，分子量约为22kDa，dot－ELISA和Westernblot分析显示，表达蛋白能与感染兔血清及虫卵免疫血清产生较强的免疫反应；此外，表达蛋白还能特异刺激经虫卵免疫后的BALB／c小鼠脾细胞增殖，其转化率达44．57％。结论：成功地构建重组质粒pcDNA3/ESG, 并在HeLa 细胞中高效表达卵壳蛋白基因, 表达的重组蛋白具有较强的免疫活性。     

日本血吸虫未知基因的原核表达载体的构建和表达分析

目的 构建日本血吸虫未知基因的原核表达载体，研究基因性质，方法 首先将从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选得到的未知基因cDNAJAYL0230亚克隆入原核表达载体pET28a( )中，IPTG诱导重组蛋白的表达，免疫印记实验检测其免疫性质。结果 成功构建重组原核表达载体pET28a( )-JAYL0230，并获得稳定表达的融合蛋白，免疫印记实验证明该融合蛋白具有免疫反应性。结论 本实验为进一步深入研究该基因的性质及功能提供了基础。     

日本血吸虫SjPGK基因克隆和序列分析

目的　克隆日本血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sj PGK)编码基因片段 ,分析其核苷酸序列。方法　根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sm PGK) c DNA序列设计并合成一对引物 ,以日本血吸虫成虫总 RNA为模板 ,采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)特异性扩增 Sj PGK基因片段 ,将其克隆入p MD18- T载体中 ,经双酶切分析和 PCR鉴定 ,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定 ;运用BL AST程序 ,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与 NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果　 RT- PCR特异性扩增出一条长约 830 bp的条带 ;重组质粒的双酶切和以其脱氧核糖核酸为模板的 PCR均可见一条与 RT- PCR产物相同的条带 ;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明 :Sj PGK基因片段长为 830 bp,与 Sm PGK的核苷酸同源性为 85 % ,分值为 6 72 ;氨基酸同源性为 94 % ,分值为 4 73。结论　成功地克隆了 Sj PGK编码基因片段 ,为寻找日本血吸虫新的抗感染疫苗候选分子奠定基础     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

日本血吸虫精氨酸酶的cDNA序列分析

目的 对获得的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj)精氨酸酶基因cDNA序列进行二级结构预测。方法 采用生物信息学等技术对获得的Sj精氨酸酶编码基因序列进行开放读框（ORF）的寻找,编码氨基酸的推导,蛋白质同源性比较以及二级结构的预测。结果 获得的cDNA序列为1061bp,含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44％,50％,51％,53％和54％。Sj精氨酸酶氨基酸序列的β转角、亲水性、平均可塑性和无规则卷曲的分布主要出现在N－末端AA残基30－50,70－90和180－200等3个区域,是潜在抗原表位。结论 推测Sj精氨酸氨基酸酶具有较好的抗原性。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因的克隆及序列分析

[目的]分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区 (VL)基因并测定其序列。 [方法 ]根据鼠免疫球蛋白轻链可变区基因FR1和FR4序列的保守性 ,化学合成用于体外扩增Ig轻链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板 ,扩增VL 基因 ,将其克隆入 pUC19载体 ,重组子用Sanger的双脱氧链终止法测定序列 ,将序列与GenBank中已发表的抗体序列比较。 [结果 ]VL 基因全长 318bp ,属鼠免疫球蛋白κ轻链第IV亚类 ,由种系基因V与Jκ4 重排而来。该VL 基因序列已被GenBank收录 (accessionNo AF2 0 6 72 0 )。 [结论 ]该VL 基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

日本血吸虫副肌球蛋白全基因克隆、测序及体内表达

目的： 将日本血吸虫大陆株副肌球蛋白（ Ｓｊｃ９７） 编码区全基因克隆及测序, 并研究 Ｓｊｃ９７ 全基因核酸疫苗在小鼠体内的表达。方法： 抽提日本血吸虫成虫总 Ｒ Ｎ Ａ, 逆转录 聚合酶链反应 （ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ） 扩增编码 Ｓｊｃ９７的全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 双脱氧链末端终止法测 Ｄ Ｎ Ａ 序列。构建含 Ｓｊｃ９７ 全基因的质粒表达载体 （ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７） , 并用免疫荧光染色法研究ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 在小鼠体内的表达特性。结果与结论： 用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增获得了 Ｓｊｃ９７ 的编码区全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 并测定了该基因编码区的全序列。与日本血吸虫菲律宾株、日本株及曼氏血吸虫副肌球蛋白编码区全基因比较, 核苷酸序列同源性分别为： ９９４ ％ 、９９２ ％ 和９１０ ％ ; 推导的氨基酸序列同源性分别为：９９７ ％ 、９９８ ％ 和９６０ ％ 。ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 核酸疫苗能在注射的小鼠局部肌肉组织表达 Ｓｊｃ９７ 。     

日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆和表达日本血吸虫BBC1(SjBBC1)基因,为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5.0引物设计软件自行设计引物,PCR扩增SjBBC1基因,将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后,亚克隆入pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp,与预期大小相符。将该基因克隆入原核表达载体pQE30,表达蛋白分子质量单位约为23.6ku,并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30/SjBBC1原核表达重组体载体,表达了具有抗原性的BBC1抗原。