水杨酸钠对大鼠耳蜗NKCC1 mRNA表达的影响

目的研究水杨酸钠作用后大鼠耳蜗Na^＋-K^＋-2Cl^-联合转运体（Na^＋-K^＋-2Cl^-co-trans-porter,NKCC1）mRNA的表达变化情况,探讨NKCC1在水杨酸钠肌注后引起大鼠耳蜗主动性改变中的作用和意义。方法选用24只正常成年SD大鼠,随机分成四组,每组6只：正常对照组（无特殊处理）、急性组（一次肌注水杨酸钠400mg／kg后处死）、慢性组（肌注水杨酸钠175mg／kg,2次／天,连续用药14天后处死）,恢复组（给药方法及时间同慢性组,停药14天后处死）,运用荧光定量PCR技术比较四组大鼠耳蜗NKCC1mRNA的表达变化。结果NKCC1mRNA在正常对照组、急性组、慢性组、恢复组均有表达,慢性组、恢复组的表达量均高于正常组,差异均有统计学意义（P〈0．05）;急性组NKCC1mRNA的表达低于正常组,差异有统计学意义（P〈0．05）;恢复组NKCC,mRNA的表达低于慢性组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NKCC1mRNA在正常大鼠中有表达,提示其对维持内淋巴液中Cl^-的平衡有一定作用;水杨酸钠肌注可以引起大鼠耳蜗NKCC1mRNA表达变化,可能通过改变耳蜗内淋巴液Cl^-浓渡平衡,而影响外毛细胞的电能动性。     

氯化物协同转运蛋白KCC2在正常大鼠内耳中的表达及意义

目的 研究氯化物协同转运蛋白KCC2(potassium-chloride cotransporter-2)在内耳中的表达及分布.方法 用免疫荧光素FITC(异硫氰酸荧光素)标记的方法检测KCC2在正常大鼠内耳的分布,荧光素标记阳性部位揭示大鼠耳蜗内KCC2的分布情况.结果 KCC2的阳性表达部位主要分布在耳蜗的盖膜、柯蒂器、螺旋神经节细胞以及前庭壶腹嵴顶部的毛细胞,耳蜗螺旋韧带及血管纹上KCC2为弱阳性表达.结论 在正常大鼠的内耳中,KCC2在耳蜗和前庭中有表达,提示KCC2可能通过对K 、Cl-转运的控制,配合其它的离子通道共同维持淋巴液中K 、Cl-的离子平衡.     

长期注射水杨酸钠大鼠下丘EphA4的表达

目的：通过观察长期水杨酸钠作用后大鼠ABR及下丘EphA4mRNA表达变化,探讨下丘EphA4表达在水杨酸钠耳毒性中的作用。方法将30只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组,每组6只：正常对照组（不予任何处理）,肌注7天组（肌肉注射水杨酸钠175 mg／kg,每天2次,间隔8小时,连续7天）,肌注14天组（水杨酸钠用法同前,持续14天）,恢复14天组（肌注水杨酸钠14天后,停药恢复14天）,恢复28天组（肌注水杨酸钠14天后,停药恢复28天）。对各组大鼠分别于相应时间点进行 ABR 检测后处死并迅速分离下丘,采用实时荧光定量PCR（real－time PCR）的方法检测各组大鼠下丘中EphA4mRNA表达。结果①肌注7、14天组大鼠的ABR反应阈分别为38．33±3．73、44．16±1．86 dB SPL,较对照组（30．83±1．86 dB SPL）明显升高（P＜0．05）;恢复28天组大鼠的ABR反应阈（32．50±2．50 dB SPL）与对照组（30．83±1．86 dB SPL）相比,差异无明显统计学意义（P＞0．05）;②肌注7天组和恢复14天组大鼠下丘 EphA4mRNA 表达（分别为：0．69±0．11、0．67±0．09）均低于对照组大鼠（0．99±0．01）（均为P＜0．05）;恢复28天组大鼠下丘EphA4mRNA表达（0．88±0．04）与对照组大鼠比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论长期注射水杨酸钠后大鼠下丘的 EphA4表达呈可逆性下降,且与水杨酸钠注射后大鼠听功能损伤的变化一致,推测下丘神经元轴突中EphA4参与了水杨酸钠耳毒性的机制。     

荧光定量PCR测定水杨酸钠作用后大鼠耳蜗基因的表达

目的了解HSP27基因在大剂量水杨酸钠作用后大鼠耳蜗中表达水平,并探讨其在水杨酸钠耳毒性中的意义。方法将Wistar大鼠各15只分成水杨酸钠作用组和正常对照组,应用SYBR GREEN I实时监测的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测大鼠耳蜗中HSP27基因在长期大剂量水杨酸钠作用后和正常对照组中的表达,并用管家基因β actin作为内参。结果水杨酸钠作用后大鼠耳蜗中HSP27基因的表达水平高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论SYBR GREEN I定量PCR法可以作为一种良好的方法对来源珍贵的微量组织的基因表达进行检测, 水杨酸钠能够明显诱导HSP27基因在大鼠耳蜗中的表达。     

长期注射水杨酸钠对大鼠听皮层酪氨酸受体激酶B及c－fos基因表达的影响

目的通过观察长期注射水杨酸钠后大鼠听皮层中酪氨酸受体激酶B(TrkB)及c-fos基因的表达,探讨其在水杨酸钠耳毒性机制中的作用。方法健康成年Wistar大鼠36只,分为正常组(不做任何处理)、慢性组(肌肉注射水杨酸钠175mg/kg,2次/天,时间间隔8小时,连续注射14天)、慢性恢复组(前期处理同慢性组,停药后恢复28天),每组12只。造模结束后各组大鼠均行听性脑干反应(ABR)检测,然后断头处死并迅速取出听皮层,运用实时荧光定量PCR技术及Western-blot技术分别检测三组大鼠听皮层中TrkB及c-fos的表达。结果正常组ABR反应阈为36±2.23dB SPL,慢性组反应阈升高为41.3±3.31dB SPL,与正常组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);慢性恢复组ABR反应阈为38.6±5.51dB SPL,与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。慢性组听皮层c-fos mRNA表达为1.24±0.09,蛋白的表达为0.70±0.12,慢性恢复组听皮层c-fos mRNA的表达为1.23±0.04,蛋白的表达为0.68±0.08,两组均高于正常组(分别为1.12±0.05、0.50±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)。慢性组听皮层TrkB mRNA表达为1.26±0.10,蛋白的表达为1.85±0.17,慢性恢复组听皮层TrkB mRNA表达为1.23±0.07,蛋白的表达为1.80±0.08,均高于正常组(分别为1.11±0.03,1.53±0.16),差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期注射水杨酸钠后大鼠听皮层c-fos基因表达升高,可能与听觉中枢神经活动增强有关;长期注射水杨酸钠可能通过上调大鼠听皮层TrkB的表达,增强听皮层神经营养因子的功能促进听皮层功能重塑。     

正常及慢性水杨酸钠作用后大鼠耳蜗总RNA的提取和产量

目的 探讨提取正常及慢性水杨酸钠作用的大鼠耳蜗总RNA的方法并测算其产量，为进一步研究提供实验数据。方法 22只健康Wistar大鼠随机分为两组，实验组12只进行2周的水杨酸钠肌肉注射，对照组10只不作处理。联用TRIzol和RNeary法分别抽取两组大鼠耳蜗的总RNA，用分光光度法和电泳测总RNA的产量和质量。结果 l0只正常组大鼠耳蜗得到总RNA7．82μg，12只长期水杨酸钠作用后的大鼠耳蜗得到总RNA4．82μg，两组平均产量不同，A260／A280值分别为2．05和2．08，提示RNA纯度高，电泳结果提示总RNA无降解。结论 两种方法合用提取总RNA的质量高，可满足后续实验要求。长期水杨酸钠作用后大鼠的耳蜗总RNA较正常大鼠耳蜗总RNA产量上有改变，进一步的研究可利用基因表达谱技术研究具体基因变化。     

水杨酸钠作用后大鼠耳蜗热休克蛋白27表达的研究

目的　研究水杨酸钠作用后大鼠耳蜗热休克蛋白 2 7(heatshockprotein2 7,HSP2 7)的表达特点 ,探讨HSP2 7在水杨酸钠耳毒性中的作用及意义。方法　用免疫组化SP法结合图像分析技术检测水杨酸钠注射后大鼠耳蜗HSP2 7的表达。结果　HSP2 7在正常及水杨酸钠作用后大鼠耳蜗各回均有不同程度的染色 ,主要阳性部位是Corti器、螺旋神经节、螺旋韧带和血管纹。但水杨酸钠作用后HSP2 7在耳蜗各阳性部位的表达均明显增强 ,其中以Corti器的表达更明显 ,P值均小于 0 .0 1。结论　HSP2 7在大鼠耳蜗组织表达有选择性 ,水杨酸钠能够明显诱导HSP2 7在大鼠耳蜗中的表达 ,HSP2 7可能对耳蜗形态结构损害后的修复起作用 ,且与耳鸣的产生发展可能有关。     

新霉素对大鼠前庭毛细胞损伤作用的实验研究

目的 研究新霉素对大鼠前庭毛细胞的毒性作用,为药物性前庭功能障碍动物模型的制备和相关研究提供参考.方法 将15只成年Wistar大鼠分为正常对照组(n=5)、新霉素组(n=5)和人工外淋巴液组(n=5),新霉素组大鼠在右耳通过耳蜗底转鼓阶打孔的方法在耳蜗内注入0.1%(g/100ml)新霉素5μl,人工外淋巴液组按同样方法注入人工外淋巴液5μl.正常对照组大鼠不做任何处理.处理3天后对动物进行颈髓硬膜外短声诱发电位(click-evoked potential on the surface of the cervical dura mater,CDM-CEP)检查和游泳试验以评价前庭功能;然后将动物处死,进行形态学观察.结果 3天后新霉素组大鼠的前庭毛细胞即出现严重破坏,并出现严重的前庭功能损伤.正常对照组大鼠的游泳时间为(4.0±0.71)8(3～5s,n=5),新霉素组大鼠的游泳时间为(10.2±1.64)8(8～12s,n=5),人工外淋巴液组大鼠的游泳时间为(4.4±1.14)s(3～6s,n=5);在短音(click)刺激下,正常大鼠引出CDM-CEP的阈值为(85±3.54)dB SPL(80-90 dB SPL,n=5),阈值时的潜伏期为(6.59±0.41)8(6.05～7.05s,12=5);新霉素组大鼠120dB SPL仍无法引出CDM-CEP;人工外淋巴液组大鼠引出CDM-CEP的阈值为(90±5.0)dB SPL(85-95 dB SPL,n=5),阈值时的潜伏期为(6.68±0.31)s(6.35～7.02s,n=5).结论 新霉素对大鼠前庭毛细胞具有极强的破坏作用,新霉素耳蜗内注射的方法可以制备理想的前庭功能障碍动物模型.     

长期注射水杨酸钠对大鼠下丘GAD67和GABAAα1、c-fos表达的影响

目的 通过观察长期注射水杨酸钠对大鼠听性脑干反应(ABR)及下丘GAD67和GABAAα1、c-fos表达的影响,探讨大鼠下丘GAD67、GABAAα1、c-fos表达的改变在水杨酸钠耳毒性中的可能机制。 方法 将24只成年健康Wistar大鼠随机分为2组:水杨酸钠组(肌肉注射10%水杨酸钠175 mg/kg,2次/d,连续28 d)、对照组(每天相同时间注射等量生理盐水,连续28 d)。两组大鼠在处死前进行ABR检测并观察ABR反应阈及波Ⅲ潜伏期的变化,然后将大鼠断头处死并迅速剥离下丘,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹(Western blot)方法检测下丘GAD67、GABAAα1、c-fos mRNA及蛋白表达的变化。 结果 ①药物注射28 d后,水杨酸钠组较注射前以及对照组ABR反应阈明显升高,波Ⅲ潜伏期明显延长,差异有统计学意义(P<0.01);②水杨酸钠组GAD67、GABAAα1、c-fos mRNA及其蛋白表达水平较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。 结论 GAD67、GABAAα1、c-fos均不同程度参与了水杨酸钠耳毒性的发生发展过程, c-fos表达的上调则可能与水杨酸钠作用于机体后引起听觉中枢神经活动增强有关。