杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化的实验研究

目的 研究补肾中药杜仲含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及定向分化的影响.方法 将第4代MSCs以5×106接种于9块96孔板,3组,每组8孔;2块6孔板,每板3孔,2 d后换液,加入诱导液.分为空白组、地塞米松组、杜仲组.空白组加入含10%胎牛血清(FBS)的 L-DMEM培养基继续培养,地塞米松组在基础培养基加入诱导剂(含β甘油磷酸钠10mmol/L,地塞米松0.1 μmol/L,维生素C 50 mg/L),杜仲组为含10%杜仲含药血清的L-DMEM培养基.分别自加诱导液第1天起,采用MTT法测量96孔板细胞数,每天1块板;在第10天取出1块6孔板做ALP染色;第20天做6孔板茜素红染色.结果 杜仲含药血清组OD值呈现出明显的上升趋势,而空白组和地塞米松组无明显上升趋势;第10天杜仲组及地塞米松组ALP染色阳性,第13天起可见白色钙结节,第20天茜素红染色阳性.结论 杜仲含药血清能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并刺激细胞增殖.     

松果菊苷含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨分化及BMP2表达的研究

目的:探讨松果菊苷含药血清促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用及可能的机制。方法:大鼠用松果菊苷(16mg/kg)灌胃4天后,取血清备用。采用全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为8组:空白对照组、松果菊苷含药血清组(2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%)、经典成骨诱导组(10%FBS+10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松+50μmol/L维生素C)。ELISA测定碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的表达;免疫荧光细胞化学染色和Western blot检测BMP2蛋白的表达,RT-PCR检测BMP2mRNA的表达。结果:与经典成骨组相比,10%松果菊苷含药血清使BMSCs表达ALP(80.16U/L)和BGP(150.79 U/L)增强,BMP2免疫荧光、BMP2蛋白表达及BMP2mRNA的表达也明显增强。结论:松果菊苷含药血清可以诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,10%松果菊苷含药血清组的效果最佳,其作用机制与BMP2表达增加有关。     

槲皮素对骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响

目的:通过观察槲皮素对骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响,探讨其调控骨髓间充质干细胞及其防治骨质疏松症的作用机制。方法:运用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,并通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物及分化能力鉴定所取得的细胞;运用MTT法检测不同浓度槲皮素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响,以确定其最佳促增殖剂量。实验分为空白组、槲皮素组、经典诱导组(地塞米松+β-甘油磷酸钠+维生素C),检测诱导分化过程中ALP活性和钙化结节数目,RT-PCR的方法检测BMP-2 mRNA的变化。结果:经MTT法检测,浓度为5μmol/L和10μmol/L的槲皮素组OD值较空白组明显升高;与空白组相比,槲皮素组与经典诱导组ALP活性及矿化结节均显著增加,并均可上调MSCs骨向分化过程中BMP-2 mRNA的表达。结论:槲皮素能促进骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化,可能是其促进骨折愈合、防治骨质疏松症的细胞学机制之一。     

仙花活骨丹颗粒对小鼠MSCs激素诱导分化的影响

目的:通过仙花活骨丹颗粒对BALB/C小鼠骨髓间充质干细胞(简称MSCs)激素诱导分化影响的观察,揭示该药物治疗大量激素导致的股骨头缺血性坏死的药理学机制。方法:采用骨髓间充质干细胞体外培养技术,以不同剂量地塞米松作为诱导剂诱导MSCs脂肪分化。用以效应剂量的药物灌胃,采用药后1h、3h、5h血清,与激素诱导的MSCs共培养21日,光镜下脂肪细胞苏丹Ⅲ染色后计数。结果:其中不含药血清各组中脂肪细胞数量最多,不同地塞米松剂量中,1×10-6mol/L组脂肪细胞数量最多。含药血清各组中1h组脂肪细胞数量最少,其次为3h和5h组。检测各组中共培养MSCs细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,含药血清组均有不同程度提高。结论:仙花活骨丹颗粒可有效抑制地塞米松诱导的MSCs脂肪分化进程,提高其成骨细胞分化能力,从而建立了该药治疗股骨头缺血性坏死的药理学机制。     

染料木素对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的:探讨染料木素体外对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。方法:用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,染料木素以不同浓度加入细胞培养体系,作用不同时间后,用MTT法检测成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法测定细胞内碱性磷酸酶的活性,用改良的Lowry法测蛋白含量。结果:染料木素在1×10~(-5)～1×10~(-9)mol/L浓度范围内作用24h、48h均能促进成骨细胞增殖,在1×10~(-7)～1×10~(-5)mol/L范围内作用72 h可提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。结论:染料木素体外能促进成骨细胞的增殖与分化。     

复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的影响

目的研究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化的影响。方法采用全骨髓差速贴壁法体外分离、纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞;取P3代细胞,分实验组和对照组,用流式细胞仪测定细胞表面标志物鉴定细胞,采用MTT法检测细胞生长曲线。显微镜下观察两组的细胞形态和组织化学染色的钙化结节;速率法测定碱性磷酸酶(ALP)活性和RT-PCR检测骨髓间充质干细胞诱导分化过程中骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达来鉴定成骨作用。结果体外培养的细胞表达表面标志;复叶耳蕨总黄酮对骨髓间充质干细胞内ALP活性增高并形成明显钙结节;PCR结果显示复叶耳蕨总黄酮上调骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达。结论 20μg/mL复叶耳蕨总黄酮可促进大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为成骨样细胞。     

地黄梓醇对原代培养SD乳大鼠成骨细胞成骨活性的影响研究

目的观察不同浓度地黄梓醇对体外培养新生SD大鼠成骨细胞增殖及成骨活性的影响,为地黄防治骨质疏松症提供实验依据。方法体外培养原代新生24 h SD大鼠成骨细胞,细胞传至第5代,分别加入1×10-3,1×10-5,1×10-7,1×10-9mol/L梓醇溶液及生理盐水10μL/孔,继续培养24,48,72 h后,分别检测成骨细胞增殖情况、骨钙素(BGP)及碱性磷酸酶(ALP)活性。结果培养24 h时,1×10-3mol/L梓醇溶液能显著促进成骨细胞增殖(P<0.05);培养48 h时,1×10-3mol/L梓醇溶液促增殖作用最强(P<0.05)。培养48h时,1×10-7mol/L组和1×10-3mol/L组ALP活性显著高于对照组(P均<0.05);培养72 h时,1×10-3mol/L组ALP活性显著增加(P<0.05)。培养48,72 h后,各浓度梓醇溶液组BGP活性均高于对照组(P均<0.05),且1×10-3mol/L组明显高于其他浓度组(P均<0.05)。结论梓醇在1×10-5mol/L和1×10-3mol/L范围对体外培养SD大鼠成骨细胞的增殖、分化及成骨作用相对显著,尤其在1×10-3mol/L浓度下作用最显著,且具有时效及量效关系。     

异补骨脂素对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化成熟的影响

目的:研究异补骨脂素(Isopsoralen,IP)对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖与分化成熟的影响。方法:取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,3 d后首次换液,铺满90%皿底后传代培养;增殖分析采用96孔板,加入在培养液中终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L的异补骨脂素,MTT法分析;分化分析采用24孔板,于成骨性诱导培养第3、6、9、12、15天分别测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性、钙含量、骨钙素,第12天进行ALP组织化学染色,第14天进行茜素红染色和钙化结节计数。结果:终浓度为1×10-4mol/L的异补骨脂素对细胞增殖有抑制作用,而1×10-5mol/L浓度虽对ROB增殖无明显影响,但能显著提高细胞ALP活性、增加钙含量、促进骨钙素分泌,并增加钙化结节数量。结论1×10-5mol/L异补骨脂素能促进ROB分化成熟,应为中药补骨脂抗骨质疏松的有效成分。     

松果菊苷诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究

目的:探讨松果菊苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用及可能的机制。方法:MTT实验观察不同浓度(7.867×10~3mg/L,78.67mg/L,0.7867mg/L,7.867×10~(-3)mg/L)松果菊苷对细胞增殖的影响,采用ELISA测定不同浓度松果菊苷组的碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的表达,评价成骨分化的能力。免疫荧光和Western blot检测BMP2、Smad1、Runx2蛋白的表达,RT-PCR检测BMP2、Smad1、Runx2 m RNA的表达,分析成骨分化的可能作用机制。结果:MTT实验结果显示78.67mg/L和0.7867mg/L的松果菊苷促进细胞增殖的能力较好。经典成骨诱导组(10%FBS+3.061×103mg/Lβ-甘油磷酸钠+3.925×10-3mg/L地塞米松+8.806mg/L维生素C)和78.67mg/L的松果菊苷组的ALP(48.07)和BGP(141.67)表达均明显增强。经典成骨诱导组和松果菊苷组的BMP2、Smad1、Runx2蛋白表达及BMP2、Smad1、Runx2 m RNA表达明显增强。结论:松果菊苷可以促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,其作用机制与BMP2、Smad1、Runx2表达增加有关。     

大豆甙元对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的 :探讨大豆甙元体外对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。方法 :用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞 ,大豆甙元以不同浓度加入细胞培养体系 ,作用不同时间后 ,用动力学法测定细胞内碱性磷酸酶 (ALP)的活性。结果 :大豆甙元在 1× 10 3 mol/L范围内 48h和 72h ,1× 10 5mol/L 96h及 1× 10 7mol/L 72h提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。结论 :大豆甙元体外能提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。     

激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓成骨活性下降的研究

目的：观察激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓体外分化为成骨细胞的改变。方法：取激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓，建立人骨髓间充质细胞诱导分化成骨细胞的培养体系，采用观察细胞学形态、MTT法、细胞内ALP含量检测及矿化结节形成，并与正常组进行比较。结果：与正常组相比，MTT测定细胞增殖、矿化结节染色及细胞内ALP含量测定表明激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓体外分化成骨细胞的能力及活性下降（P〈0．01）。结论：激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞的增殖能力和活性下降。     

姜黄素诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞

目的研究姜黄素诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的作用。方法贴壁筛选法体外培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测其表面抗原。分组诱导培养14 d:1组(空白对照组),2组(10 ng/mL成纤维细胞生长因子-4,FGF-4),3组(10 ng/mL FGF-4+20 ng/mL肝细胞生长因子,HGF),4组(10 ng/mL FGF-4+5μmol/L姜黄素),5组(20μmol/L姜黄素)。观察细胞形态学改变;利用western-blotting分析肝特异性蛋白HNF-3β的表达。结果大鼠骨髓间充质干细胞细胞表面抗原CD34、CD14、CD45阴性表达,CD44、CD73、CD90表达阳性;药物诱导后光镜下观察到骨髓间充质干细胞细胞由梭形渐变成圆形肝细胞;诱导分化后的细胞表达肝特异性蛋白HNF-3β。结论姜黄素具有促进骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的作用。     

人参皂苷Rb1对大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的:研究人参皂苷Rb1对大鼠成骨细胞增殖、分化及护骨素/核因子κB受体活化因子配体(OPG/RANKL)mRNA表达的影响。方法:不同浓度的人参皂苷Rb1作用于体外培养的大鼠成骨细胞不同时间,采用MTT法检测药物对成骨细胞增殖功能的影响,PNPP法检测成骨细胞中ALP活性分析药物对成骨细胞分化的影响,半定量RT-PCR法检测成骨细胞中OPG/RANKL mRNA,分析药物对破骨细胞分化的影响。结果:人参皂苷Rb1(1.12×10-9-1.12×10-5mol/L)作用于体外培养的大鼠成骨细胞3d时,1.12×10-8-1.12×10-6mol/L人参皂苷Rb1可显著促进成骨细胞的增殖(P0.05或P0.01);1.12×10-7-1.12×10-6mol/L人参皂苷Rb1可显著促进成骨细胞的分化(P0.01);1.12×10-9-1.12×10-8mol/L人参皂苷Rb1可显著上调成骨细胞中OPG/RANKLmRNA的比值,抑制破骨细胞的分化(P0.01);1.12×10-7-1.12×10-5mol/L人参皂苷Rb1可显著下调成骨细胞中OPG/RANKLmRNA的比值,促进破骨细胞的分化(P0.01)。结论:人参皂苷Rb1对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖、分化及破骨细胞的分化有显著影响。     

淫羊藿苷对骨髓间充质成骨性活性强于金雀异黄酮

目的:比较研究金雀异黄酮与淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞(rats bone marrow stromal cell,rBMSC)成骨性分化的影响.方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质细胞,筛选最佳的药物浓度;采用终浓度为1×10-5mol·L-1的金雀异黄酮和淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞进行干预;在药物干预后的第3,6,9,12,15天后测定碱性磷酸酶活性(alkaline pbosphatase,ALP)和3,6,9,12,15 d测定钙含量;第12天进行钙化结节茜素红染色;在药物干预后第12,24,48,72,96 h Real-time RT-PCR检测OXS,Runx-2,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP-2)和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平.结果:浓度为1 ×10-5 mol·L-1金雀异黄酮和淫羊藿苷可提高ALP活性最高,增加Ca含量,调节骨代谢活性Runx-2,OXS,BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平,淫羊藿苷比金雀异黄酮的成骨性作用更强一些.结论:在促进体外培养骨髓间充质细胞成骨性分化作用方面淫羊藿苷较强于金雀异黄酮.     

失重下骨碎补总黄酮经MAPK通路促间充质干细胞向成骨细胞分化研究

目的:观察模拟失重状态下,骨碎补总黄酮促间充质干细胞向成骨细胞分化,MAPK/ERK通路变化。方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,建立失重模型,加入骨碎补血清培养液,观察间充质干细胞向成骨细胞分化过程中形态学变化,MTT法测定细胞活性,PNPP法测定ALP活性,RT-PCR测定MAPK/ERK通路。结果:与空白对照组和低剂量组相比,中、高剂量组细胞增殖能力及ALP活性值均明显升高,且具有统计学意义(P0.05),与阳性对照组接近。加入TFDF后,ERK1/2通路表达明显升高(P0.05)。结论:失重下骨碎补能激活MAPK/ERK通路促间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化成熟。     

17β-雌二醇对骨髓基质细胞成骨、成脂分化和成骨细胞成脂横向分化的影响

 目的研究17β-雌二醇对小鼠原代骨髓基质细胞成骨、成脂分化以及小鼠原代成骨细胞成脂横向分化的影响。方法四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测17β-雌二醇对骨髓基质细胞和成骨细胞增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)活性测定法检测17β-雌二醇对骨髓基质细胞成骨分化的影响,油红O染色形态学及定量测定法检测17β-雌二醇对骨髓基质细胞成脂分化和成骨细胞成脂横向分化的影响。结果1×10^-8,1×10^-7,5×10^-7,1×10^-6,5×10^-6和1×10^-5mol·L^-1的17β-雌二醇可以促进小鼠原代骨髓基质细胞和成骨细胞增殖(P<0.05);5×10^-7,1×10^-6,5×10^-6和1×10^-5mol·L^-1的17β-雌二醇促进骨髓基质细胞的成骨分化、抑制成脂分化,但是浓度为1×10^-7mol·L^-1的17β-雌二醇抑制骨髓基质细胞的成骨分化、促进成脂分化(P<0.05);浓度为1×10^-8,5×10^-7,1×10^-6,和1×10^-5mol·L^-1的17β-雌二醇抑制成骨细胞的成脂分化(P<0.05)。结论17β-雌二醇可以调节骨髓基质细胞向成骨细胞分化而减少其向脂肪细胞分化,并且可以抑制成骨细胞向脂肪细胞的横向分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性及多潜能分化研究

目的:研究兔骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性,建立一种稳定的细胞分化体系。方法:取3月龄大耳白兔骨髓3ml~4ml,采用贴壁法获取骨髓间质干细胞,取2代细胞按1×104个/孔接种于24孔培养板内,绘制生长曲线。将传代2代细胞按3×103个.cm-2,接种于6孔板内,并加入条件培养液(地塞米松10-7mol.L-1,β-甘油磷酸钠10 ml.L-1,50 mg.L-1抗环血酸),ALP-钙化染色鉴定,将传代2代细胞按3×105个.cm-2接种于6孔板内,并加入条件培养液(TGF-β15 ng.ml-1,地塞米松10-7mol.L-1或多聚赖氨酸10μg.ml-1),阿新兰染色鉴定。结果:原代生长的细胞呈梭形,7d后形成多个集落,并逐渐溶合或片铺满瓶底,随着传代次数的增加,细胞增殖能力增强。骨髓间质干细胞在不同条件培养液下可向成骨细胞或软骨细胞分化,ALP-钙染色及阿新兰染色阳性。结论:在本培养体系下,骨髓间质干细胞生长良好,可分化为成骨细胞及软骨细胞,具有多向分化潜能。     

骨碎补总黄酮对经诱导的兔骨髓间充质干细胞增殖和钙沉积的影响

目的:观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和骨向分化的影响。方法:用密度梯度离心法分离兔MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨碎补总黄酮诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:骨碎补总黄酮能够诱导兔MSCs向成骨细胞分化。     

葛根素对SD大鼠MSCs增殖及骨向分化的影响

目的:观察葛根素(Puerarin,Pue)对骨髓间充质干细胞(Marrow pluripotent stromal stem cells,MSCs)增殖和向成骨细胞(Osteoblasts,OB)分化的影响,从干细胞的角度探讨中药防治骨质疏松的可能机制和影响途径。方法:成功建立MSCs培养体系,取第三代SD大鼠MSCs,随机分为三组:空白组、不同浓度的Pue组、经典诱导组,通过MTT比色法及流式细胞仪技术,ALP染色技术观察Pue对MSCs增殖及向OB分化的影响。结果:通过对生长曲线的绘制,对多向诱导分化能力检测,及对表面抗原中CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性的检测,说明成功建立MSCs体外培养体系。经MTT比色法检测显示,10~(-7)mol/L、10~(-8)mol/L Pue与空白组对比具有促进MSCs增殖的作用,具有统计学意义。ALP染色阳性细胞表达率显示,10~(-6)mol/L Pue与空白组相比具有确定的诱导MSCs向OB分化的作用,说明Pue可以促进MSCs向OB分化。结论:葛根素具有促进体外培养MSCs增殖及向OB分化的能力。     

姜黄素对人癌细胞BCH、MGC-803、BEL-7402细胞增殖的影响

目的观察姜黄素对人癌细胞系BCH、MGC-83、BEL-7402细胞增殖的影响.方法采用Mosman MTT细胞增殖检测法.结果姜黄素在4×10-5mol/L与BCH细胞接触,在不同时相的药物细胞毒效应不同,其与BCH细胞接触16h是药物细胞毒作用最佳时期.姜黄素在(1×10-5～1×10-4)mol/L范围对上述三种体外培养癌细胞有明显的抑制活性.其IC50分别为3.58×10-5mol/L(BCH)、3.83×-5mol/L(MGC-803)、7.3×10-5mol/L(BEL-7402),并且药效与药物浓度呈相关性.结论姜黄素对三种癌细胞的增殖有明显抑制作用.其药效浓度达到国内抗肿瘤药体外药效评价标准.