结核分枝杆菌CFP10诊断抗原基因的克隆及序列特性分析

目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因（CFP10）,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析,为研究结核病候选诊断抗原基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由303bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%。结论成功克隆CFP10基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,为其原核表达及相关研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因的克隆及生物信息学分析

目的获得结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因,进行DNA测序、序列特性生物学特性分析,为研究结核病诊断抗原侯选基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,测序表明该片段由699bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为98%,推导编码氨基酸序列同源性为98%。结论经DNA测序证实,扩增出的片段确为MPT64,该片段阅读框完整。     

结核分枝杆菌ESAT-6诊断抗原基因的克隆及同源性分析

目的 获得结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,进行DNA测序、同源性分析,为筛选结核病候选诊断抗原基因奠定基础.方法 以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析.结果 成功扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由288bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为90%.结论 成功克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,测序结果表明该片段阅读框完整.     

结核分枝杆菌rps12基因的克隆及核酸序列的分析

目的扩增结核分枝杆菌rps12基因,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌rps12抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌rps12抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由375bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为99%。结论成功克隆rps12基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,该基因的获得为其原核表达及相关研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37 Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

结核分枝杆菌ClpC2基因序列分析及功能预测

目的对结核分枝杆菌的基因clpC2（Rv2667）的同源基因进行序列分析和相似性比较,并对其编码蛋白进行理化性质及功能的预测,为CIpC2蛋白的结构与功能研究提供基础技术资料。方法根据Gene Bank中分枝杆菌clpC2同源基因的核苷酸序列,进行多重序列比对和进化树构建;应用ExPASy在线序列分析工具,对结核分枝杆菌CIpC2蛋白质理化性质及保守结构域进行预测;应用Geneontology（GO）在线软件对ClpC2蛋白酶的功能进行分析。结果clpC2系统进化树分析,与16SrRNA基因相比,进化距离明显变大,而在结核分枝杆菌复合群中高度保守。ClpC2蛋白为亲水性非跨膜蛋白,在细胞质表达,具有水解和催化功能,是一个依赖于ATP的Clp亚单位。结论clpC2基因在结核分枝杆菌复合群中高度保守,其编码的蛋白ClpC2是一个依赖于ATP的水解蛋白酶。     

结核分枝杆菌复苏因子D的克隆及测序分析

目的 克隆结核分枝杆菌Rv2389c基因.方法 常规方法提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA,PCR扩增结核分枝杆菌Rv2389c基因,经内切酶酶切、胶回收,将片段亚克隆到T载体中,转化至DH5α.以PCR鉴定的阳性菌落转至LB中培养,菌液进行质粒提取、酶切、胶回收,回收片段再克隆至表达载体pET30a中,转化至DH5α中.PCR阳性菌落转至LB中培养,测序确定插入片段的正确性.结果 构建了Rv2389c重组表达质粒PET30a-Rv2389c.结论 成功克隆了结核分枝杆菌复苏因子Rv2389c基因.     

结核分枝杆菌Rv2450基因的克隆、表达及纯化

目的:克隆结核分枝杆菌(Mtb)Rv2450基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)从Mtb H37Rv基因组中扩增出Rv2450编码基因,序列测定正确后,亚克隆到融合表达载体pPro-EX HT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达带6个组氨酸残基的Rv2450蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化.结果:得到融合6个组氨酸残基的Rv2450蛋白纯度大于90%.结论:构建了Mtb Rv2450基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白.     

结核分枝杆菌RipB基因的克隆、表达及对藤黄微球菌生长的影响

提取肺结核分枝杆菌基因组DNA,PCR扩增RipB基因并将其连接到表达载体pET 21a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白。SDS PAGE表明：重组RipB表达蛋白量约占菌体总蛋白量的40%,而其在37 ℃表达时主要为包涵体,在15 ℃表达时主要在可溶上清内;Ni柱一步亲和层析获得重组RipB;100 pmol/L重组RipB可显著促进藤黄微球菌生长。     

Echinococcus granulosus钙结合蛋白基因的克隆和序列分析

目的：获得细粒棘球蚴Calcium-binding protein(CaBPs)基因序列资料，进行序列分析，为包虫病免疫预防研究奠定基础。方法：从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴（protoscolices)，提取RNA，逆转录成cDNA，用特异引物扩增CaBPs基因；并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析。然后登录Cene/Bank数据库。结果：以cDNA为模板获得3个核苷酸长度不同的基因，分别是CaBP1为914bp,CaBP2为1095bp,CaBP3为1039bp。同源性比较结果表明：来自新疆羊源CaBPs基因序列和巴西（Brazil)羊源基因CaBPs同源性为90％以上；从cDNA获得的3个CaBPs基因序列的比较分析说明钙结合蛋白可能存在一个家族，有不同的成员组成。结论：CaBPs在E.granulosus虫体发育过程中具有十分重要的功能，到目前为止其机理尚不完全明了，CaBPs基因的获得为进一步研究其结构和功能，以及对包虫病的防治具有重要作用。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

家蝇幼虫抗菌肽Defensins基因的克隆与序列分析

目的：克隆家蝇幼虫的抗菌肽defensins基因并对其进行序列分析。方法：提取家蝇幼虫总RNA，根据家蝇成虫defensins基因cDNA序列设计一对引物，RT-PCR扩增目的基因片段，T-A克隆后测序，应用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果：RT—PCR扩增出一条约310bp的目的片段，序列分析表明，其与家蝇成虫防御素基因同源性高达97％，核酸序列变异主要发生在信号肽区域。结论：成功克隆及分析了家蝇幼虫防御素基因全长编码区cDNA序列，为其下一步的重组表达和生物活性研究奠定了基础。     

中国长白山乌苏里蝮蛇降纤酶基因克隆和结构分析

目的 :克隆乌苏里蝮蛇 ( Gloydius ussuriensis)降纤酶 ( Difibrase)基因 ,为用基因工程方法生产降纤酶打下基础。方法 :从乌苏里蝮蛇毒腺制备总 RNA,经 RT- PCR扩增、克隆和顺序测定。结果 :降纤酶 c DNA开框读码序列全长 70 2个核苷酸 ,编码 2 34个氨基酸 ,推测其活性中心为His41、Asp86和 Ser180 ,含有 6对二硫键。结论 :确定乌苏里蝮蛇降纤酶 c DNA顺序 ,推导出其氨基酸顺序和活性中心结构。     

人hole基因的克隆和序列分析

目的 克隆人的hole基因,并进行生物信息学分析.方法 以胚胎心脏cDNA文库为模板,进行PCR扩增得到hole基因的ORF.并进行亚克隆入PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,用Xho1进行酶切和测序鉴定阳性克隆.利用Internet和GeneBank数据库对测序结果正确的hole基因进行生物信息学分析. 结果克隆了hole基因,测序结果正确;生物信息学分析表明, hole基因开放读码为960 bp,编码319个氨基酸;同源性分析表明,人的hole与鼠、鸡hole蛋白具有高度同源性.多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在心脏、肝脏、肺、脑、肾脏、脾脏、胰脏均有表达,其心脏表达最高. 结论成功克隆hole基因,对其功能进行了初步预测,为进一步的功能研究打下基础.     

人T-bet基因的克隆及序列分析

目的：克隆人T-bet基因全长编码区的cDNA，并进行豁定和测序分析，为从转录水平研究Th1／Th2平衡及其与免疫相关性疾病发生发展的关系奠定基础。方法：采用RT-PCR方法，从人外周血淋巴细胞获得T-bet基因的cDNA；连接至pGEM-Teasy载体，导入大肠杆菌DH5α并选择阳性克隆；应用M13F／R通用引物进行双向反应测序，以作序列鉴定。结果：扩增得到的T-bet基因cDNA全长1670 bp，包括编码区1607 bp，编码530个氨摹酸残基，与Genbank中发表的序列完全一致。结论：获得了人T-bet基网的克隆，为进一步研究其生物学功能构建了基础平台，为寻找多种免疫性疾病的有效治疗提供新思路。     

犬黑素皮质素受体-2基因的分子克隆及序列分析

目的分离犬MC2R基因cDNA5′末端，分析其启动区域特点。方法采用了RNA连接酶介导的RACE（RLM-RACE）技术分离了犬MC2R基因和局部序列比对工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）对CDS区进行了初步验证。结果新分离了犬MC2RcDNA的5′末端，并对其启动区序列作了初步分析。序列分析显示，该基因至少由两个外显子（exon1和exon2）组成，exon1和exon2的一部分编码5′非翻译区（5′-UTR），exon2其余的部分编码整个编码区。结论克隆了犬MC2R基因的5′末端，在其启动区发现了inr、SF-1、SP1、CRE、PPRE、AP-1等多个顺式作用元件，为犬MC2R表达调控研究奠定基础。     

间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定我国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的部分基因序列并进行生物信息学分析。方法根据PvLDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从间日疟原虫基因组DNA中扩增LDH基因,定向克隆入pMD18质粒。阳性质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用生物信息学网站www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.ch对获得的基因及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的间日疟原虫LDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明,获得的间日疟原虫LDH基因全长897bp,编码299个氨基酸。DNAMAN预测PvLDH存在10个潜在抗原表位,均与PfLDH的相应预测表位间有同源序列。同源性分析显示,我国间日疟原虫与SalvadorⅠ株和Belem株间日疟原虫的氨基酸序列同源性为99%,与其它疟原虫LDH的同源性为88%～90%。结论成功克隆了我国间日疟原虫LDH基因,其基因序列与其它疟原虫LDH基因序列有高度同源性。