视细胞移植术后RCS鼠视网膜谷氨酸的分布

目的 通过纯视细胞移植,观察重建视网膜神经传导通路中兴奋性神经递质谷氨酸的分布和变化。方法取同龄Wistar鼠和皇家外科学院鼠(RCS)为供／受体,准分子激光切削法制备视细胞层,外路途径移入RCS鼠的视网膜下腔,术后两周取RCS鼠手术眼,手术对照眼,RCS对照眼,Wistar鼠眼。分别做冰冻切片,免疫组织化学染色法染色,普通光学显微镜下观察。结果在视细胞移植术后两周,移植视细胞存活,外丛状层重建,与手术对照眼、RCS对照眼相比,受体RCS鼠重建视网膜中在内丛状层和节细胞层Wistar鼠谷氨酸免疫反应阳性的神经纤维相对密度增多。结论视细胞移植不仅可以使RCS鼠视网膜重建正常的解剖结构,而且在移植后的视网膜中观察到兴奋性神经递质谷氨酸的分布接近正常。     

Wistar鼠和RCS鼠视网膜神经递质的分布和比较

目的：观察正常Wistar大鼠和皇家外科学院鼠（RCS）的视网膜兴奋性神经递质谷氨酸（Glutamate)和抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的分布和两者间的差异。方法：74天Wistar鼠和RCS鼠各6眼分为2组，免疫组织化学染色法，光镜下观察上述组织视网膜内谷氨酸和GABG的分布。结果：Wistar鼠视网膜AGBA阳性免疫反应分布于视网膜内丛状层的部分神经纤维、GABA阳性免疫反应的无长突细胞和节细胞层的部分纤维。RCS鼠则分布于视网膜内丛状层的少量神经纤维、极少量GABA阳性免疫反应的无长突细胞和节细胞层的部分纤维。Wintar鼠视网膜Glutamate阳性免疫反应主要分布于外丛状层、内丛状层及节细胞层的神经纤维。RCS鼠则主要分布于内丛状层及节细胞层的神经纤维。RCS鼠视网膜中Glutamate阳性免疫反应的神经纤维的相对密度和GABA阳性免疫反应的无长突细胞的相对密度减少。结论：74天时RCS鼠视网膜中的视细胞完全萎缩，使Glutamate和GABA的分布受到影响。     

视细胞移植后RCS鼠视网膜超微结构观察

自八十年代以来视网膜移植在世界上蓬勃兴起 ,为临床上视网膜色素变性和黄斑病变等难治性眼病的治疗开辟了一条全新的道路。我们通过观察皇家外科学院 (royal college of sur-geon,RCS)大鼠 [1 ] 在接受正常 Wistar鼠的视细胞层后重建的视网膜超微结构 ,以了解视细胞移植术后 ,移植 Wistar鼠视细胞 ,RCS鼠视网膜超微结构的变化。1　材料和方法供体动物选用 Wistar雄性鼠 (体重约 2 0 0 g) ,受体鼠为雄性 RCS鼠 ,出生后 6 0 d,体重 180～ 2 0 0 g( 级实验动物 ,北京医科大学实验动物部提供 )。移植视细胞片的制备及视细胞移植见文献 [2 …     

视细胞移植后重建视网膜中一氧化氮合酶的分布

近年发现一氧化氮 (ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ ,ＮＯ)是一类新的神经递质 ,在神经系统中起到一种信使作用[1,2 ] 。Ｌ精氨酸在一氧化氮合酶 (ｎｉｔｙｉｃｏｘｄｉｅｓｙｎｔｈａｓｅ ,ＮＯＳ)的催化下分解为Ｌ 瓜氨酸和ＮＯ ,ＮＯ通过提高鸟苷酸环化酶 (ｃＧＭＰ)的水平而发挥生物效应[3] 。在大鼠视网膜内ＮＯＳ主要存在于无长突细胞中[4 ] 。我们通过观察 6 0ｄ的皇家外科学院鼠 (ＲｏｙａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｕｒｇｅｏｕＲａｔ,ＲＣＳ)在接受视细胞移植后重建视网膜中含ＮＯＳ的无长突细胞的变化 ,以及和Ｗｉｓｔａｒ鼠、ＲＣＳ手术对…     

分离视细胞层的新技术

目的为了进行视网膜视细胞移植研究，必须分离出可供移植的视细胞。能否得到纯视细胞，是对视网膜视细胞移植实验获得正确分析和良好结果的关键。方法采用一种从视网膜中分离切取纯视网膜视细胞层的可靠方法。用组织细胞震动切削机（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）切削视网膜，取得纯视网膜视细胞层。结果得到了可供移植的小鼠、大鼠、兔、猴及人的纯视网膜视细胞层。结论用此方法可获得视细胞纯度达１００％的纯视细胞层，方法可靠，操作较为简便。     

视网膜下间隙移植经基因修饰的视网膜色素上皮细胞对大鼠光感受器变性及视功能的保护作用

目的 以RCS大鼠作模型,研究经基因修饰的永生化视网膜色素上皮细胞(RPE)视网膜下移植对光感受器变性的保护作用。方法 在绿色荧光蛋白基因逆转录病毒感染的基础上,利用脂质体介导节状神经生长因子(CNTF)表达质粒转移,修饰成人RPE细胞系CRL-2302。将1×105个表达绿色荧光蛋白(GFP)或GFP及CNTF的RPE细胞移植到4～5周龄RCS大鼠右眼视网膜下间隙,左眼不移植或注射。PBS作为对照。术后2、4、6、8、10和12周作荧光显微镜、光镜、电镜及电生理检查。结果 荧光显微镜观察,术后1周移植的人RPE细胞在RCS大鼠视网膜下间隙已扩散到几乎整个眼底,但随时间延长移植的细胞逐渐减少,术后6周仅残留少量移植细胞。光镜及电镜观察显示移植眼保留的光感受器数量明显较对照眼多,凋亡细胞则较对照跟少。此外,移植眼宿主RPE细胞形态较正常,并可见吞噬小体。视网膜电图(ERG)检查结果表明部分移植眼视网膜功能明显较对照眼好。结论 经过基因修饰的RPE细胞移植可延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性,为治疗视网膜变性提供了新的途径。(中华眼科杂志,2004,40:552-556)     

表达睫状神经营养因子的人胚肺成纤维细胞视网膜下间隙移植延缓RCS大鼠光感受器变性

目的以遗传性视网膜变性RCS大鼠为模型,探讨视网膜下间隙移植表达睫状神经营养因子(CNTF)的人胚肺(HFL)成纤维细胞治疗视网膜变性的可行性。方法通过脂质体将编码CNTF的表达质粒转入HFL成纤维细胞、MTX及ELISA筛选高水平表达CNTF的细胞克隆。手术显微镜直视下经角膜缘后1mm注射5μl含1×105个高水平表达CNTF的HFL成纤维细胞至4～5周龄RCS大鼠右眼视网膜下间隙,左眼不手术或注射PBS作为对照。分别于移植术后2、4、6、8、10、12及15周随机取1只鼠摘除眼球作光镜观察,随机取2只鼠摘除眼球作电镜观察。结果稳定转染CNTF的HFL成纤维细胞能高水平表达CNTF(91046.15pg/ml),7只经光镜观察的移植眼中的4只,其视网膜外颗粒层明显较对照眼厚,保存的光感受器数量明显较对照眼多(P≤0.002)。14只经电镜观察的移植眼中的10只,视网膜外颗粒层光感受器凋亡明显较对照眼少。在光感受器与视网膜色素上皮间堆积的盘膜碎片亦较少。宿主视网膜色素上皮细胞的形态保存较好,并可见吞噬小体。结论经过CNTF基因修饰的HFL成纤维细胞视网膜下间隙移植能够延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性     

重组腺病毒介导的gfp-bcl-X_L对视网膜变性鼠光感受器细胞保护作用的研究

目的　观察重组腺病毒rAd gfp bcl XL治疗视网膜变性 (retinaldegeneration ,RD)鼠的疗效。方法　 40只RD鼠随机分成A、B组 ,每组 2 0只 ,右眼为治疗眼 ,左眼为对照眼。A、B组治疗眼分别于RD鼠生后 10d及 2 2d视网膜下腔注射含绿色荧光蛋白基因gfp和抗凋亡基因bcl XL 的重组腺病毒颗粒 ;术后 15、30d摘除治疗眼和对照眼行冰冻切片、透射电镜下观察、石蜡切片、HE染色并提取视网膜总RNA ;行逆转录聚合酶链反应分析bcl XL 基因的mRNA表达水平 ;免疫组化分析治疗眼和对照眼的Bcl XL 蛋白水平。结果　治疗眼视网膜有较广泛的绿色荧光蛋白表达 ,说明重组腺病毒成功的将bcl XL 转染至视网膜光感受器细胞 ,且有bcl XL 表达 ;术后 30d ,A组鼠治疗眼和对照眼bcl XL的mRNA表达水平及Bcl XL 蛋白含量有明显差异 ;透射电镜下可见治疗眼的内节段较对照眼完好 ;HE染色示治疗眼视网膜光感受器细胞层较对照眼厚。而B组鼠治疗眼和对照眼的视网膜光感受器细胞层的厚度无明显差异。结论　注射至早期RD鼠视网膜下腔中的rAd gfp bcl XL 能有效转染光感受器细胞并发挥抗凋亡作用 ,但对晚期RD鼠的疗效不明显。     

重组腺病毒介导的gfp-bcl-XL对视网膜变性鼠光感受器细胞保护作用的研究

目的 观察重组腺病毒rAd-gfp-bcl-XL治疗视网膜变性(retinal degeneration,RD)鼠的疗效。方法 40只RD鼠随机分成A、B组,每组20只,右眼为治疗眼,左眼为对照眼。A、B组治疗眼分别于RD鼠生后10d及22d视网膜下腔注射含绿色荧光蛋白基因gfp和抗凋亡基因bcl-XL的重组腺病毒颗粒;术后15、30d摘除治疗眼和对照眼行冰冻切片、透射电镜下观察、石蜡切片、HE染色并提取视网膜总RNA;行逆转录聚合酶链反应分析bcl-XL基因的mRNA表达水平;免疫组化分析治疗眼和对照眼的Bcl-XL蛋白水平。结果 治疗眼视网膜有较广泛的绿色荧光蛋白表达,说明重组腺病毒成功的将bcl-XL转染至视网膜光感受器细胞,且有bcl-XL表达;术后30d,A组鼠治疗眼和对照眼bcl-XL的mRNA表达水平及Bcl-XL蛋白含量有明显差异;透射电镜下可见治疗眼的内节段较对照眼完好;HE染色示治疗眼视网膜光感受器细胞层较对照眼厚。而B组鼠治疗眼和对照眼的视网膜光感受器细胞层的厚度无明显差异。结论 注射至早期RD鼠视网膜下腔中的rAd-gfp-bcl-XL能有效转染光感受器细胞并发挥抗凋亡作用,但对晚期RD鼠的疗效不明显。     

Müller细胞对大鼠光感受器变性及视功能的保护作用

目的以RCS视网膜色素变性大鼠为模型,研究经诱导产生神经干细胞特性的Müller细胞视网膜下腔移植对光感受器变性的保护作用。方法向6周龄VC大鼠玻璃体腔内注射神经毒素混合液（包含NMDA、kainate、FGF2和胰岛素）刺激视网膜Müller细胞。1周后取材分离Müller细胞体外原代培养。将细胞标记后,以每眼1×10^5个细胞密度移植到6周龄RCS大鼠右眼视网膜下腔,左眼分组注射正常Müller细胞和PBS作为同型对照及阴性对照。术后分别于第1、3、5、7周,行视网膜铺片、组织病理学及视觉电生理检查。结果培养的Müller细胞纯度可达96％以上,其中表达神经干细胞标志物的细胞占总细胞量的53％以上。组织病理学观察显示,在相同时间点移植眼保留的光感受器细胞数量明显较同型对照眼多,同型对照移植眼保留的光感受器细胞数量明显较阴性对照眼多。视网膜电图（ERG）检查结果与病理学结果相符。结论视网膜下腔移植经诱导产生神经干细胞特性的Müller细胞可以有效延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性,为治疗视网膜变性疾病提供了新的途径。     

经巩膜外路至视网膜下腔移植视网膜细胞的实验研究

探讨视网膜光感受器细胞的移植方法及临床意义。方法将16只昆明鼠随机分为A组和B组,每组均8只鼠。于手术显微镜下,用特殊显微注射器穿过巩膜、脉络膜,在A组昆明鼠的视网膜下腔注入视网膜混合细胞,在B组昆明鼠的视网膜下腔注入纯光感受器细胞。于移植术后30、90及180 d摘除实验眼,于光镜下观察移植细胞在视网膜下腔生长的情况。结果大多数标本(13／15)HE染色显示视网膜细胞准确移植在受体眼的视网膜下腔,未见炎性细胞浸润和受体视网膜破坏;且移植到受体视网膜下腔的细胞在术后180 d仍存活。仅少数(2／15)标本可见受体视网膜结构破坏。移植的视网膜混合细胞均形成“玫瑰花”样结构,而移植的纯视网膜光感受器细胞则在视网膜下腔形成整齐的细胞层。结论经巩膜外路至视网膜下腔的显微注射法是较为理想的视网膜下腔注射给药和视网膜细胞移植方式。纯视网膜光感受器细胞移植后的生长状况和功能接近正常生理状态的视网膜组织结构,为临床治疗视网膜变性疾病提供了新途径。     

Müller细胞对大鼠光感受器变性及视功能的保护作用

目的以RCS视网膜色素变性大鼠为模型,研究经诱导产生神经干细胞特性的Müller细胞视网膜下腔移植对光感受器变性的保护作用。方法向6周龄VC大鼠玻璃体腔内注射神经毒素混合液（包含NMDA、kainate、FGF2和胰岛素）刺激视网膜Müller细胞。1周后取材分离Müller细胞体外原代培养。将细胞标记后,以每眼1×10^5个细胞密度移植到6周龄RCS大鼠右眼视网膜下腔,左眼分组注射正常Müller细胞和PBS作为同型对照及阴性对照。术后分别于第1、3、5、7周,行视网膜铺片、组织病理学及视觉电生理检查。结果培养的Müller细胞纯度可达96％以上,其中表达神经干细胞标志物的细胞占总细胞量的53％以上。组织病理学观察显示,在相同时间点移植眼保留的光感受器细胞数量明显较同型对照眼多,同型对照移植眼保留的光感受器细胞数量明显较阴性对照眼多。视网膜电图（ERG）检查结果与病理学结果相符。结论视网膜下腔移植经诱导产生神经干细胞特性的Müller细胞可以有效延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性,为治疗视网膜变性疾病提供了新的途径。     

Wistar鼠和RCS鼠的视网膜超微结构观察

RCS鼠为遗传性视网膜色素变性的经典模型,最先由英国皇家外科学院(Royal College of Surgeon)种系鼠中发现,该鼠患有一种以视细胞进行性变性为特征的常染色体隐性遗传病,原发异常在视网膜色素上皮吞噬视细胞外节膜盘能力的缺陷,致使视细胞碎屑堆积,最终导致视细胞变性坏死。通过对比Wistar鼠和RCS鼠视网膜的超微结构,希望对人类视网膜色素变性研究的动物模型有更深入的了解。     

水通道蛋白在大鼠眼组织视网膜中的分布

目的：研究水通道蛋白1（AQP1）在正常大鼠眼组织视网膜中的分布。方法：对正常Wistar鼠眼组织切片进行免疫酶组织化学方法染色，光镜观察。正常Wistar鼠肾脏的冰冻切片为阳性对照。结果：AQP1在正常Wistar鼠视网膜的内核层有明显表达，首次发现在神经节细胞层也有明显表达，阴性对照未见。结论：AQP1在视网膜的内核层及神经节细胞层的分布，可能AQP1或AQP1和AQP4协同在高眼压和视网膜缺血状态下对维持视网膜神经细胞正常功能及细胞内外水电平衡起一定的调节作用。     

准分子激光切削视网膜板层移植术

目的 应用准分子激光切削视网膜获得纯视网膜光感受器层并制作视网膜板层移植的动物模型。 方法 准分子激光切削Wistar大鼠视网膜获得纯视网膜光感受器层,植于成年RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜下，术后1个月取材，切片，光镜下观察。 结果 准分子激光切削视网膜可获得均匀整齐的视网膜光感受器层，移植后1个月，光感受器层成活对位良好。 结论 准分子激光切削视网膜光感受器板层移植可获得具有较多移植细胞，并有良好解剖学对位的视网膜移植动物模型。 (中华眼底病杂志,1998,14:209-211)     

兔胚胎全层视网膜移植至大鼠视网膜下的观察

视网膜色素变性(RP)是一组能导致进行性感光细胞变性和视觉障碍的遗传病症候群，目前尚无有效治疗方法。近年来研究表明视网膜移植是最接近临床应用治疗RP的方法。当RP进展到晚期，感光细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞都出现变性死亡，单独移植这两种成分都没有作用，此时病变视网膜的修复需要全层视网膜的移植。我们将青紫蓝兔胚胎全层视网膜移植到正常Wistar大鼠和视网膜变性RCS大鼠的视网膜下腔，观察移植物在宿主视网膜下腔的发育状况，从而探讨异种胚胎全层视网膜移植方法的可行性。     

激光损伤对BN大鼠视网膜缝隙连接蛋白Cx43分布的影响

目的探讨细胞间隙连接蛋白(connexin 43，Cx43)在(Brown Norway，BN)大鼠视网膜中的分布特点以及氪激光损伤视网膜后Cx43分布的变化。方法应用雄性BN为研究对象，氪红激光眼底光凝(波长647nm，能量360mw，光斑直径50μm，曝光0．05s)?右眼视盘周围10个激光点。光凝后1周开始取材，应用免疫组化方法观察Cx43在BN大鼠视网膜中的分布特点。结果正常视网膜内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层明显表达，神经节细胞表达的主要位置是细胞浆和细胞膜，色素上皮细胞全层表达，内外颗粒层及内外丛状层无表达。激光损伤后的内界膜，视神经纤维层以及神经节细胞层Cx43表达明显减少，瘢痕区视网膜色素上皮细胞接近消失，而激光斑周边色素上皮细胞表达不受影响，激光斑部位增殖的成纤维样细胞部分表达。结论正常视网膜的Cx43主要分布在内界膜、神经纤维层、视网膜节细胞层和视网膜色素上皮层，激光损伤后内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层表达减弱，激光斑周围色素上皮细胞中表达无明显变化，激光损伤瘢痕中的成纤维细胞有少量表达。     

脑源性神经营养因子对糖尿病大鼠早期神经视网膜病变的影响

目的:观察玻璃体腔内注射脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)前后STZ糖尿病大鼠视网膜中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的水平及多巴胺能无长突细胞数目的变化.方法:9周龄Wistar大鼠,链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射,制成糖尿病模型,于模型建立2 wk后,大鼠眼玻璃体内注射BDNF溶液,于模型建立4 wk后,处死大鼠,取出眼球,取视网膜组织进行Western blotting及视网膜铺片免疫组织化学染色检测,观察视网膜中TH水平的变化,从而反映糖尿病大鼠视网膜中多巴胺能无长突细胞水平的变化.结果:实验组糖尿病大鼠未注射BDNF眼视网膜中TH蛋白水平降低,多巴胺能无长突细胞计数及灰度低于对照组,均有统计学差异.实验组注射BDNF眼视网膜中TH蛋白水平、多巴胺能无长突细胞计数及灰度与对照组无统计学差异.结论:在STZ糖尿病大鼠糖尿病早期,玻璃体腔内注射BDNF可提高视网膜中TH的水平,提高多巴胺能无长突细胞的数目.     

视网膜视细胞的成片移植

目的 探索用准分子激光切削技术制备视网膜单层细胞植片,经内入路视网膜下腔的单层视细胞成片移植。方法 用准分子激光对大鼠视网膜进行切削,制取单层视细胞植片,此后,按内入路手术方法进行了兔视网膜下腔的异种移植。结果 切削后所得视细胞植片由单层视细胞组成,结构完整,包括外丛状层、外核层和外节层;视细胞植片经明胶包埋后被准确植入宿主视网膜下腔中,移植术后第1,2天宿主观视网膜未能复位,呈脱离状态,移植物没能与视网膜色素上皮层相贴;移植后10天,宿主视网膜复位,视细胞移植片平铺于宿主视网膜下腔中,植片视细胞外节也宿主视网膜色素上皮层相贴;移植后10天,宿主视网膜复位,视细胞移植片平铺于宿主视网膜下腔中,植片视细胞外节与宿主视网膜色素上皮层相贴,未见明显免疫排异现象。结论 准分子激光制备单层视细胞植片方法简单、可行;初步观察到内入路单层视细胞成片移植后,视细胞植片能够在宿主视网膜下腔中以正常生理位置存活;视网膜下腔为理想的视网膜移植的受位。     

电子烟对小鼠视网膜组织及超微结构影响的研究

目的:研究电子烟对小鼠视网膜组织及超微结构的影响以及可能的相关机制。方法:将18只8周龄雄性c57BL小鼠随机分为对照组(6只),0mg尼古丁组(6只)和12mg尼古丁组(6只),分别用HE染色观察视网膜各层结构的改变,在透射电子显微镜下观察视网膜色素上皮(RPE)细胞超微结构的改变,通过免疫荧光染色观察视网膜中Tuj1、8-OHdG的表达情况。结果:与对照组相比,实验组(0mg和12mg尼古丁组)视网膜全层、视神经纤维层和内丛状层厚度均显著减少(P<0.01),但实验组间均无明显差异(P>0.05)。RPE细胞顶部仅见零星微绒毛,残存微绒毛长度变短。实验组中节细胞层、视神经纤维层和内丛状层可观察到Tuj1表达减少,但是神经节细胞数目无显著变化(P>0.05)。0mg和12mg尼古丁组中节细胞层、内核层内观察到8-OHdG表达增加。结论:电子烟可对小鼠视网膜造成损伤,其损伤可能是由氧化应激反应造成的。