多重定量PCR法同步检测HBV、HCV和HIV-1在血液筛查中的优化及应用

目的 初步探讨多重定量聚合酶链反应（PCR）同步检测乙型肝炎病毒（HBV） DNA,丙型肝炎病毒（HCV） RNA及人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 RNA在血液筛查中的应用前景.方法 选择2012年8月至12月,于孝感市中心血站志愿献血的合格献血者血样中,经2次酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV表面抗原（HBsAg）、抗HCV及抗HIV-1,检测结果均呈阴性的4 800份血样为研究对象.采用全自动核酸混合提取仪对该4 800份血样进行核酸提取,然后利用多重定量PCR方法对血样中HBV、HCV及HIV-1进行同步扩增检测.采用中国药品和生物制品检定所提供的HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA标准参考品,检测多重定量PCR的灵敏度,并与单重定量PCR的灵敏度进行比较.在HBV、HCV及HIV-1 3者中任意1种病毒基因组浓度较高的条件下,对多重定量PCR检测另2种低浓度病毒基因组的能力进行评估.结果 增加多重定量PCR中c-MMLV逆转录酶和Hot Taq酶的用量,并适量加入单链结合蛋白（SSB）,可使其扩增效率提升至单重定量PCR扩增水平.本组4 800份血样中,经多重定量PCR检测出3份HBV DNA阳性样品,ELISA漏检率为0.062 5％,未发现HCV RNA和HIV-1 RNA阳性样品;多重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为115 IU/mL、376 IU /mL和232 IU /mL;单重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为51 IU /mL、94 IU /mL和78 IU/mL.结论 本研究初步建立了对献血者血液同时进行HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA检测的多重定量PCR检测方法;该检测体系经过进一步优化后,有望应用于临床大规模血液病毒筛查.     

乙型肝炎e抗体定量在慢性乙型肝炎中的临床研究

目的探讨乙型肝炎(简称乙肝)病毒e抗体在慢性乙肝中的临床价值。方法采用时间分辨免疫荧光分析法(TR-FIA),对494例慢性乙肝的标志物(HBV M)定量检测,对HBsAg发生变化了的慢性乙肝患者采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测HBV DNA载量。结果 494例慢性乙肝e抗体阳性者常见的HBV M有5种模式,以"HBsAg>0.2 ng/mL、抗-HBe>0.2 PEIU/mL、抗-HBc>0.9 PEIU/mL、抗-HBs<10 mIU/mL、HBeAg<0.5 PEIU/mL"模式为主(74.7%),其次为"HB-sAg<0.2 ng/mL、抗-HBs<10 mIU/mL、HBeAg<0.5 PEIU/mL、抗-HBe>0.2 PEIU/mL、抗-HBc>0.9 PEIU/mL"模式(18.1%);两种模式中,抗-HBe与HBsAg定量值各组差异无统计学意义(P>0.2),但抗-HBe定量与HBsAg的阳性率各组差异有统计学意义(χ2=29.86,P<0.01);持续高含量的抗-HBe,HBsAg发生变化的概率明显升高,HBsAg变化值与HBV DNA变化值呈正相关(r=0.784,P<0.01)。结论慢性乙肝在"HBsAg<0.2 ng/mL、抗-HBs<10 mIU/mL、抗-HBe>2.0 PEIU/mL"时,提示有低含量HBsAg或隐匿性乙型肝炎的可能性;同时,在"HBsAg<10 mIU/mL、抗-HBe>2.0 PEIU/mL"的慢性乙肝发生活化可能性大。因此,对慢性乙肝抗-HBe定量持续很高的患者密切观察,及时给予干预性治疗显得非常重要。     

混合血浆荧光定量PCR法筛查献血者HCV RNA的初步研究

目的 研究用荧光定量PCR方法检测混合血浆中的HCV RNA。方法 用12人份混合血浆为基本单元提取HCV RNA，逆转录，四份逆转录产物混合上样于HCV PCR扩增反应体系，用PE5700荧光定量PCR仪检测。HCV RNA质控品检测灵敏度。结果 检测4128份标本中1例HCV RNA阳性，HCV RNA冻干质控品检测灵敏度为105IU／ml。结论 48人份混合血浆荧光定量PCR法可用于血液筛查。     

不同方法提取血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌核酸的比较

目的 比较不同提取方法对血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌检出率的影响。方法 将定量检测的灭活菌液/基因组DNA梯度添加至含抗凝血的血培养瓶中,选择不同的方法提取核酸,利用荧光定量检测其含量。结果 磁珠法和裂解法最低能检测添加10² CFU/mL的灭活菌液以及10-3 ng/μL的基因组DNA;离心柱法无法检测未经红细胞裂解液处理的添加10⁶ CFU/mL的灭活菌液以及10 ng/μL的基因组DNA,经红细胞裂解液处理后也只能检测到添加10⁴ CFU/mL的灭活菌液以及1 ng/μL的基因组DNA的模拟样品。结论 红细胞裂解液处理模拟样品能够增加核酸的提取量,裂解法提取效果最好,其次是磁珠法,再次是离心柱法。本研究为疑似布鲁氏菌病样品血培养物的核酸检测提供了方法参考,为提高布鲁氏菌病的诊断率提供了新的思路。     

慢性HBV感染者肝组织HBV cccDNA的定量检测

目的建立一种肝活检组织中HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的定量检测方法。方法待检肝组织标本共21份，来源于江苏省人民医院肝脏手术患者，包括19份慢性HBV感染，其中HBeAg（＋）标本10份，HBeAg（-）标本9份，4份非HBV感染为阴性对照组，取HBVDNA阳性的患者外周血作为rcDNA组。检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶K和细胞裂解缓冲液消化后，用液相抽提法提取核酸，将提取的核酸溶液分为2等份。1份用特异性降解单链DNA的核酸酶加以消化，纯化后使用跨缺口引物和SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时荧光定量PCR分析；另1等份则用以定量检测肝细胞看家基因（β-Globin）作为样本细胞参数。检测结果的特异性主要通过PCR反应产物的序列分析及rcDNA组结果的对照进行证实，HBeAg（＋）组和HBeAg（-）组cccDNA水平的差异通过两样本t检验进行分析。结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350bp左右，DNA测序分析提示产物与目的片段的序列符合率为99％以上，且以rcDNA为对照的结果均为阴性，排除最有可能造成假阳性的rcDNA对结果的干扰。本方法对10mg HBeAg（＋）肝组织标本的cccDNA的检测阳性率为100％。血清HBeAg（＋）的肝组织样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb（＋）的肝组织标本（P〈0．05）。结论通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性。应用SYBR GreenⅠ荧光染料和β-Globin作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量PCR方法检测肝细胞内HBV cccDNA，具有较高的特异性、敏感性，且成本较低的特点。     

荧光定量聚合酶链反应检测胃癌let-7 MicroRNA

目的建立一种快速、准确、特异、定量检测let-7 miRNA的方法并探讨其在胃癌发生发展中的意义。方法提取20例胃癌及癌旁正常胃黏膜组织总RNA,采用颈环逆转录引物进行逆转录;以let-7a micro RNA为靶基因,设计合成引物和荧光（MGB）探针;建立荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测let-7 miRNA,并检测其在胃癌组织中的表达。结果该方法检测let-7a miRNA的灵敏度为1．0×10^1拷贝;检测总RNA的下限为0．05ng。20例临床标本中,7例（35％,7／20）胃癌组织中let-7a miRNA表达明显低于其远癌端正常胃黏膜对照组织。结论应用颈环逆转录引物及MGB探针技术荧光定量PCR方法能够准确、快速、特异、敏感地检测胃癌let-7 miRNA,且其表达下调可能与胃癌的发生发展有密切关系。     

人血浆毒鼠强气相色谱-氮磷检测器检测及其临床应用

目的:利用气相色谱-氮磷检测器(GC/NPD)建立一种快速检测人血浆中毒鼠强(TET)的方法.方法:血浆中TET用乙酸乙酯作液液提取,毛细管气相色谱柱,GC/NPD法测定血浆中毒鼠强的浓度,以甲基1605为内标,内标法定量.结果:方法学显示毒鼠强与内标分离良好,不受样品中内源性物质干扰,在50～700 ng/mL范围内具有良好的线性关系(r＞0.99),最低检出浓度为5 ng/mL,最低检测限为10 ng/mL.血浆样本回收率的在70%以上.日内、日间精密度分别为RSD 3.5%～12.8%和6.5%～12.0%.结论:该本方法灵敏、稳定,能满足毒鼠强药物代谢动力学研究和临床检测的需要.     

血清层粘连蛋白荧光免疫层析检测方法的建立及性能评价

建立一种荧光定量层粘连蛋白(LN)检测方法,定量检测人血清LN水平。将鼠抗LN抗体用划线机喷到硝酸纤维素膜表面作为检测线(T),将链霉素亲和素用划线机喷到硝酸纤维素膜表面作为质控线(C);用生物素荧光微球标记鼠抗LN抗体作为缓冲液。利用双抗体夹心法原理定量检测LN水平,对方法的线性、精密度、空白限、回收率、相关性等性能指标进行验证,并使用市售化学发光LN试剂盒比对。荧光免疫分辨检测LN方法的回收率为86.03%~97.50%,空白限为4.22 ng/mL,线性范围为20~800 ng/mL,相关系数(r)为0.9989;批内精密度为6.51%,批间精密度为6.23%。与市售LN试剂平行检测100份血清标本,有良好的相关性(Y=1.0219X-1.1720,r=0.9871)。本研究建立了LN荧光免疫检测方法,各项性能指标均达到临床检验要求,操作便捷、结果准确,可用于临床血清LN水平的检测。     

实时荧光定量PCR测定TRAIL mRNA质粒标准品的构建

目的 构建pGEM-T-TRAIL重组质粒标准品为临床检测TRAIL mRNA水平奠定基础.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,提取血清HBV DNA阳性乙肝患者的外周血单个核细胞总RNA,逆转录合成cDNA,扩增目的 片断,纯化PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,转化感受态菌DH - 5α,经蓝白斑筛选,PCR鉴定阳性克隆,并进一步测序分析.提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立TRAIL质粒标准品.结果 扩增目的 片段长度为110 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库TRAIL序列性一致.结论 成功构建了实时荧光定量PCR 测定TRAIL mRNA质粒标准品.     

Landsteiner-Wiener血型系统测序分型技术的建立

目的建立Landsteiner-Wiener血型系统的测序分型技术。方法(1)随机采集45名非血缘关系无偿志愿捐献者外周血样,用EDTA抗凝。(2)从外周抗凝血样中提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,反转录产生LW基因的cDNA(包括3个外显子),采用ABI PrismTM 3100 DNA测序仪对RT-PCR产物中LW基因的第1外显子进行测序。(3)提取基因组DNA,采用一对引物扩增LW基因的第1外显子、第1内含子和第2外显子,全长1224bp,对第1外显子PCR产物直接进行DNA测序分析。结果45例捐血者的样本,分别经RT-PCR产物测序和PCR产物直接测序,均取得了成功,LW基因第1外显子多态性位置第308碱基均为腺嘌呤。结论本研究在国内率先建立了LW血型基因的分子测序方法,可为进一步研究中国人群LW血型基因多态性提供有效方法。