小鼠胚胎成纤维细胞与人胚共培养对胚胎体外发育影响

[目的]评价小鼠胚胎成纤维细胞共培养是否促进d3质量差的人胚胎的囊胚发育。[方法]使用小鼠胚胎成纤维细胞与受精后第3天(d 3)质量差的胚胎共培养,对照组使用Quins囊胚培养液进行序贯培养,观察各阶段囊胚形成率,检测囊胚总细胞数。[结果]d5共培养组12.3％胚胎开始出现早期囊腔化,d 6 7.4％胚胎出现囊腔扩张,4.2％的胚胎d 7孵出。而序贯培养组d 5仅4.2％胚胎开始早期囊腔化,d 6仅1.5％胚胎出现囊腔扩张,d 7仅0.6％的胚胎孵出,表明共培养组囊胚形成率更高,囊胚发育速度快于对照组。此外,共培养组囊胚总细胞数更多,d 6扩张囊胚总细胞数为62.6±13.4,而未扩张囊胚总细胞数26.1±8.9,分别高于序贯培养组。[结论]小鼠胚胎成纤维细胞共培养与 Quins囊胚培养液序贯培养比较,前者更能促进d 3质量差的人胚胎体外发育。     

冻融人早孕蜕膜单层细胞对小鼠胚胎发育的影响

目的　探讨冻融的人早孕蜕膜单层细胞对小鼠胚胎发育的影响。方法　蜕膜单层细胞解冻后接种获得冻融蜕膜单层细胞;观察昆明白小鼠单细胞受精卵与传代的、冻融的人早孕蜕膜单层细胞共培养 (A、B组)及仅用培养液培养(C组)的胚胎发育情况。分析A、B组与C组各期鼠胚的发育情况及 8 细胞期A类胚胎形成情况。结果　A、B、C组的2 细胞期形成率差异无显著性,A组在 4 细胞形成率上高于B、C组。A、B组 8 细胞期、桑椹期、早期囊胚形成率和囊胚孵出率高于C组(P<0 05)。而A、B组之间差异无显著性。A、B组在 8 细胞阶段A、B类胚胎形成率与C组相比,差异有显著性(P<0 05)。同样A、B组之间差异无显著性。共培养 20d的培养液经检查,细菌及真菌均阴性。结论　冻融的人蜕膜单层细胞与传代细胞一样在小鼠胚胎的发育中起到了促进作用,该结果说明了人胚胎与其冻融的自体子宫增殖晚期-分泌早期的内膜单层细胞共培养的可行性。     

小鼠早期胚胎几种不同培养方法的比较

目的探讨小鼠胚胎体外发育中的最佳培养方案。方法将从超排的ICR雌鼠输卵管内收集的1-细胞放入无糖CZB中培养,分别于2-细胞、4-细胞、桑椹胚阶段更换入含3.0 mmol/L葡萄糖(最适浓度)的CZB中,以及胚胎培养全程均在含糖CZB中更换1次培养液、胚胎培养全程均在含糖CZB中不更换培养液,对照组胚胎培养全程均在无糖CZB中,观察记录胚胎的发育情况。结果2-细胞、4-细胞阶段换入含糖CZB中的序贯培养及培养全程在含糖CZB中单一培养,囊胚率均高于对照组(P0.05);桑椹胚阶段换入含糖CZB中的序贯培养,囊胚率与对照组差异无统计学意义(P0.05);2-细胞、4-细胞阶段换入含糖CZB中的序贯培养与全程在含糖CZB中的两步法单一培养及一步法单一培养,囊胚率分别为46.5%、38.4%、41.7%、56.6%,其差异无统计学意义(P0.05)。结论在小鼠早期胚胎体外发育中,2-细胞至桑椹胚前对葡萄糖存在依赖性;尽管序贯培养是有效的,但并不一定优于一步单一培养。     

冻融后2-细胞胚胎发育至囊胚建立人胚胎干细胞系

目的 用解冻后废弃胚胎及部分患者捐献的冷冻胚胎建立胚胎干细胞系.方法 用程序解冻法解冻2001-2007年来我生殖中心就诊的患者剩余冷冻胚胎,培养至囊胚,Pronase酶去除透明带后,全囊胚置于小鼠饲养层(MEF)中培养获得原代细胞,机械法结合Ⅳ型胶原酶消化法传代,并利用细胞形态观察、免疫荧光染色、核型分析、畸胎瘤切片胚层分析方法对所建胚胎干细胞系进行鉴定.结果 序贯培养23枚废弃胚胎,有4枚培养到囊胚阶段;去除透明带后有2枚在MEF上贴壁生长,但只有1株成功扩增稳定传代至第80代;细胞集落呈典型的鸟巢状,有稳定的46XY核型;细胞系表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81抗原,RT-PCR检测有Nanog、Oct-4、Sox2等基因表达;同时在体外能分化为内、中、外3个胚层.结论 解冻后2～3细胞Ⅲ～Ⅳ级的废弃胚胎仍具有发育形成囊胚的潜能,并利用所得囊胚采用酶去透明带全胚培养法能建立稳定增殖的hESC细胞系.     

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响

目的:采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法:对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定,然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养,观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果:与无上皮细胞相比,共培养明显促进了小鼠桑椹胚率(71.3%和61.2%,P<0.05),囊胚率(50.0%和39.7%,P<0.05),囊胚孵化率(34.8%和24.3%,P<0.05)和胚胎总细胞数(44.1和35.6,P<0.05)。结论:子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育,对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

序贯培养对小白鼠胚胎体外发育的影响

目的:探索序贯培养技术对小白鼠胚胎体外发育的影响。方法:将 2 -细胞期的小鼠胚胎随机分为序贯培养组与传统培养组进行培养 ,观察分析两组的 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率。结果:序贯培养组 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率分别为 70 .5 %、6 8.2 %、6 5 .9% ,传统培养组分别为 4 5 .7%、4 5 .7%、34.3%。两组比较 ,序贯培养组高于传统培养组 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :采用适当的培养液进行序贯培养 ,更适合小白鼠胚胎的体外发育     

序贯培养体系和单一培养体系对人卵母细胞受精和早期胚胎发育的影响

目的：比较在体外受精/卵胞质内单精子显微注射（IVF/ICSI）治疗周期中序贯培养体系和单一培养体系对人类早期胚胎发育的影响，为人类辅助生殖技术中胚胎培养体系的选择和评估提供参考。方法：选取155例行IVF/ICSI助孕的患者，将同一个患者的卵子分为2组，分别在Vitrolife的序贯培养体系G-IVF/G1/G2培养液（序贯培养组）和Irvine的单一培养体系CSCC培养液（单一培养组）中进行体外受精和胚胎培养，观察2组不同培养体系中胚胎受精和胚胎早期发育情况。结果：与单一培养组比较，序贯培养组受精率、双原核（2PN）受精率和多核受精率差异均无统计学意义（P>0.05）。在IVF患者中，序贯培养组和单一培养组的卵裂率、可用胚胎率、优质胚胎率和囊胚形成率比较差异均无统计学意义（P>0.05）；在ICSI患者中，序贯培养组和单一培养组的卵裂率、可用胚胎率和囊胚形成率比较差异均无统计学意义（P>0.05），但序贯培养组优质胚胎率明显高于单一培养组（P=0.015）。在IVF和ICSI患者中，单一培养组第3天胚胎致密化的比例均明显高于序贯培养组（P=0.001）。在序贯培养组中胚胎形态表面光滑均匀，单一培养组中胚胎表面较为粗糙且有颗粒状。结论：G-IVF/G1/G2序贯培养体系和CSCC单一培养体系对人卵母细胞受精和早期胚胎发育的影响无明显差异。     

Straw-top玻璃化与程序化冷冻小鼠8-细胞胚胎效果的比较

目的比较慢速程序化法与玻璃化法冷冻小鼠8-细胞胚胎的效果。方法将小鼠卵母细胞行体外受精后培养至8-细胞,分别采用慢速程序化法与玻璃化法进行冷冻,解冻后比较两组胚胎存活率及囊胚形成率。结果慢速程序化冷冻法解冻后的胚胎存活率为79.6%,囊胚形成率为70.7%;玻璃化冷冻法解冻后的胚胎存活率为94.9%,囊胚形成率为89.9%,胚胎存活率与囊胚形成率均显著高于前者（均P〈0.01）。结论在进行小鼠8-细胞胚胎冷冻时,玻璃化法冷冻效果较慢速程序化法效果好。     

解脲支原体血清3型对小鼠早期胚胎发育的影响

目的：观察不同浓度的解脲支原体（ureaplasma urealyticum,UU）血清3型（简称3型UU）对小鼠早期胚胎发育的影响,以探讨UU对早期胚胎发育的致病作用。方法：取小鼠2-细胞期胚胎随机分为实验组与对照组,对照组（组1）：2-细胞期鼠胚在不含3型UU的HTF培养液中培养;实验组（组2、组3、组4、组5）：2-细胞期鼠胚分别在含103～106 CCU/mL浓度的3型UU的HTF培养液中培养,在37℃、5%CO2的培养箱中培养72 h,每24 h在Nikon倒置显微镜下观察记录,通过统计各组的D2评分、4-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率、囊胚形成率,评价早期胚胎的发育情况。结果：3型UU在培养液中的终浓度分别为103、104、105 CCU/mL时,2-细胞胚胎以后的D2评分、4-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率、囊胚形成率等各阶段的胚胎发育指标与对照组比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。而UU终浓度为106CCU/mL组各项胚胎发育指标与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：UU能够影响小鼠早期胚胎的发育,3型UU≥106 CCU/mL时可阻碍小鼠早期胚胎的发育。     

GnRH类似物促进人早期胚胎体外发育能力的实验研究

目的研究促性腺激素释放激素（GnRH）类似物对人类早期胚胎体外发育能力的影响.方法IVF的受精卵进行体外培养.实验一的培养基中,GnRH类似物的浓度分别是0,0.1,0.2,0.5,0.8和1.0μg/mL;实验二的培养基中都含有0.5μg/mL的GnRH类似物,而GnRH拮抗剂的浓度分别为0,0.2,0.4,0.8,1.0和1.2μg/mL.结果培养基中的GnRH类似物浓度在0.5μg/mL及以上时,实验组的桑椹胚/囊胚生成率显著高于对照组（P〈0.05）,而且,实验组的8-细胞期胚胎形成率也同时显著高于对照组（P〈0.05）.培养基中含0.8μg/mL及以上浓度的GnRH拮抗剂时,实验组的桑椹胚/囊胚生成率显著低于对照组（P〈0.05）,而且8-细胞期胚胎形成率也显著降低（P〈0.05）.结论GnRH类似物对体外培养的人早期胚胎有促进分裂的作用,这种促进早期胚胎发育的效果在8-细胞期就能显现出来.GnRH拮抗剂能抵消GnRH类似物对早期胚胎发育的促进效果.     

Co-culture of early embryo with human decidual stromal cellsin vitro by improvement of early embryo development

Summary An early embryo co-culture system with human decidual stromal cells was established to study its effect on early embryonic cleavage and growth in vitro. Three hundred and eight 2-cell mouse embryos were co-cultured with human decidual stromal cell monolayer in MEM + 0.4 % bovine serum albumin (BSA) and 163 embryos cultured in MEM + 15 % FCS alone as control. Among the mouse 2-cell embryos co-cultured with human decidual stromal cells, 72.73 % developed to the morula stage and 67.21 % cavitated to blastocysts with 59.74 % hatching, as compared with 61.34 % to morula stage, 48.47 % to blastocysts and none hatching in the controls, respectively. Co-cultured embryos cleaved slightly faster than controls and showed no or less fragmentation than those in the control. These results suggested that human decidual stromal cells can support early embryonic development and yield a reasonable number of embryos with good quality up to blastocyst stage.     

Effects of Placental Isoferritin on the Mouse Embryo Development in vitro

To investigate the effect of placental isoferritin （PLF） on mouse embryo development in vitro, mice 2-cell embryos were co-cultured with human first trimester decidual cells at different concentrations of PLF in vitro. The following changes of the above system were observed under an invert microscope and the number of embryos were recorded and the embryos were classified. The results showed there was no significant difference in the percentage of embryos development to 4-cell 8-cell and morula （P〉0.05）. PLF at the doses of 10 and 100 U/mL significantly enhanced more embryos development to the blastocyst and hatching blastocyst （P〈0.05）. PLF at the dose of 1000 U/mL depressed more embryos development from 2-cell to hatching blastocyst, meanwhile such phenomena as cell degeneration and irregular cleavage were observed in part of embryos, but there was no significant difference in statistics （P〉0.05）. It was concluded that PLF at the concentration of 10-- 100 U/mL had no significant effects on the early development of mice embryos, however, PLF could promote the growth, differentiation, and hatching of preimplantion blastocysts.     

瘦素对小鼠着床前胚胎发育影响的体外研究

目的　探讨瘦素在体外对小鼠着床前胚胎发育的影响。方法　 1收集小鼠 2 -细胞胚胎 ,在不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎发育情况 ,并进行胚胎移植 ,观察着床率 ;2收集小鼠 2 -细胞胚胎在空白 CZB培养液中体外培养至桑葚胚期 ,再分别置入不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎进一步发育情况。结果　瘦素能提高 2 -细胞胚胎体外发育的质量、发育率和胚胎着床率。当瘦素剂量为 10 ng/ ml时平均胚胎形态学评分 (AES)为 16 .0 8± 0 .37,剂量为 5 0 ng/ ml时 AES为 17.5 7± 0 .4 2 ,两者间差别有统计学意义(P<0 .0 5 )。但剂量进一步增加 ,促进作用不再递增。瘦素对桑葚胚体外进一步发育无显著影响。结论　瘦素参与了小鼠着床前胚胎的发育 ,能提高胚胎发育质量、发育率 ,有利于胚胎的进一步着床。     

Co-Culture of Early Embryo with Human Decidual Stromal Cells in vitro by Improvement of Early Embryo Development

The quality of the in vitro culture conditionsfor human pre--implantation embryos is one of themost critical aspects of successful in vitro fertilization and embryo transfer (IVF--ET) and other biology techniques, such as embryo clone, geneknock--out, pre--implantation genetic diagnosis etc.The culture of pre--im:7lantation mammalian embryos can take place in a range of embryo culturemedia, ranging from simple chemically defined media to more complex media. In vitro pre--implantation embryo …     

IVF-ET周期中单原核胚胎的形态学及体外发育潜能

摘 要: 【目的】 探讨IVF-ET周期中单原核(1PN)胚胎形态学及继续体外培养潜能,指导其临床利用价值?【方法】 对受精后16 ~ 18 h观察到的486个1PN胚胎进行体外培养,观察其原核大小?极体及卵裂情况;通过囊胚序贯培养法将其中374个1PN胚胎培养至囊胚期,观察囊胚形成情况?【结果】 374个1PN胚胎共形成囊胚179个(47.86%),其中优质囊胚41个(22.91%)?行囊胚培养的374个1PN胚胎原核直径为(27.64 ± 3.30)μm,大于未达囊胚培养标准的81个胚胎的(26.22 ± 3.38)μm,以及对照组2PN胚胎(24.08 ± 1.85)μm(P 0.05)?IVF来源的1PN胚胎原核直径为(27.80 ± 3.44)μm大于ICSI组(26.77 ± 2.29)μm(P 0.05)均高于后者?不同极体数目(不确定?2PB?1PB)的1PN胚胎间原核大小无统计学差异(P > 0.05),但其优质囊胚率有统计学差异(39.39%,20.00%,17.65%;P < 0.05)?D3评分级别越优?卵裂球数目越多者,其囊胚形成率(P < 0.05)和优质囊胚率(P < 0.05)越高?【结论】 对于IVF来源的1PN(2PB)胚胎,可通过对其形态学和胚胎发育潜能进行初步筛选,冷冻发育良好的1PN囊胚,在无可利用的2PN胚胎情况下,可选择进行移植?