去泛素化酶OTULIN研究进展

泛素是一种进化上高度保守的具有76个氨基酸构成的蛋白,分子量为8.6 kDa.泛素化,即泛素/泛素链与蛋白质共价结合的过程,是真核生物蛋白质翻译后修饰的重要途径之一[1].目前发现,线性泛素链(Linear ubiquitin/Met1-linked ubiquitin chains/Met1-Ub)中泛素连接方式由泛素蛋白N末端的蛋氨酸Met1的氨基基团与另一泛素分子C末端甘氨酸分子首尾相连形成[2].     

泛素蛋白酶体抑制剂在急性髓系白血病中的研究进展

泛素蛋白酶体系统(UPS)在真核生物蛋白质循环中具有重要生物学作用,出现异常可导致肿瘤的发生。目前包括白血病在内的多种肿瘤患者体内均检测到高水平的泛素蛋白酶体活性。泛素蛋白酶体抑制剂通过影响泛素蛋白酶体系统的E3连接酶、去泛素化酶以及蛋白质降解活性位点能够有效地杀伤肿瘤细胞。临床上已经将相关泛素蛋白酶体抑制剂用于治疗血液系统肿瘤,但在急性髓系白血病中的应用相对较少。本文对影响蛋白质泛素化降解不同阶段的抑制剂在急性髓系白血病中的研究进展进行相关总结,为研发急性髓系白血病有效疗法提供新思路。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管内皮细胞凋亡及其机制

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人血管脐静脉内皮细胞（ECV-304）的致凋亡作用,并从泛素-蛋白酶体途径（UPP）相关基因E1、E2和E3及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表达初步探讨MG132的致细胞凋亡机制。方法采用蛋白酶体抑制剂MG132（2μmol/L和5μmol/L）处理ECV-304细胞;流式细胞术检测细胞凋亡率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测UPP相关基因E1、E2、E3和凋亡相关基因caspase-3的转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase-3蛋白表达。结果MG132处理组细胞的凋亡率明显增加;细胞内UPP相关基因E1、E2、E3 mRNA表达下降,而凋亡相关基因caspase-3 mRNA表达上调;细胞内caspase-3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导ECV-304细胞凋亡,其机制可能是MG132抑制UPP活性,使细胞内caspase-3蛋白降解减少,同时上调caspase-3基因转录而促进细胞凋亡。     

Ubiquitination-associated proteins in human lung adenocarcinoma cisplatin-resistant cell strain A549/CDDP

目的 研究肺腺癌中与耐药相关的泛素化或类泛素化蛋白质及其与耐药的关系.方法 从经顺铂处理和未处理的A549细胞及其耐顺铂细胞株中分离泛素化、类泛素化蛋白质,通过1D SDS-PAGE和Chip HPLC-MS/MS分析鉴别蛋白,Western blot法验证质谱结果;MTT法检测细胞对顺铂的耐药性.结果 鉴定出发生类泛素化修饰蛋白质-PKM2,并发现其在耐药细胞株中低表达;以蛋白酶体抑制剂MG132干预细胞后,PKM2表达上调;CDDP和MG132联合作用细胞后,细胞耐药性下降.结论 细胞中PKM2表达水平与肿瘤细胞耐药程度呈负相关,PKM2受蛋白质类泛素化修饰-SUMO化修饰调节,提示PKM2可能与肿瘤耐药的发生密切相关.     

人肺腺癌耐药细胞株A549/CDDP中相关泛素化蛋白质研究

目的研究肺腺癌中与耐药相关的泛素化或类泛素化蛋白质及其与耐药的关系。方法从经顺铂处理和未处理的A549细胞及其耐顺铂细胞株中分离泛素化、类泛素化蛋白质,通过1D SDS-PAGE和Chip HPLC-MS/MS分析鉴别蛋白,Western blot法验证质谱结果;MTT法检测细胞对顺铂的耐药性。结果鉴定出发生类泛素化修饰蛋白质-PKM2,并发现其在耐药细胞株中低表达;以蛋白酶体抑制剂MG132干预细胞后,PKM2表达上调;CDDP和MG132联合作用细胞后,细胞耐药性下降。结论细胞中PKM2表达水平与肿瘤细胞耐药程度呈负相关,PKM2受蛋白质类泛素化修饰-SUMO化修饰调节,提示PKM2可能与肿瘤耐药的发生密切相关。     

泛素蛋白连接酶复合体KPC的研究进展

泛素蛋白酶体途径是真核生物体内最重要的蛋白质降解途径之一,其中,目标蛋白的泛素化过程涉及泛素激活酶、泛素结合酶和泛素蛋白连接酶(E3)。目标蛋白识别中起关键作用的是E3,Kip1泛素-促进复合体(KPC)是一种E3复合体,由KPC1和KPC2组成,KPC1在C端含有一个环指结构域作为催化亚基,是E3不可缺少的组成部分,KPC2含有一个类泛素结构域和两个泛素相关结构域。KPC广泛存在于真核生物中,在神经系统疾病、血液系统疾病、肿瘤疾病等方面起着重要的调控作用。     

MG132对高糖刺激的肾系膜细胞中Smurf2表达的作用

目的 观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞胞内Smad泛素化调节因子-smurf2的表达,并以蛋白酶体抑制剂MG132作为阻断剂,探讨泛素化降解在糖尿病肾病中的作用.方法 将体外培养的大鼠肾系膜细胞分别设正常对照组(葡萄糖浓度5.6 mmol/L)、20 mmol/L高糖组、30 mmol/L高糖组、30mmol/L高糖加MG132组等.分别用Real time Quantitative PCR 法和细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞泛素连接酶Smurf2的mRNA和蛋白表达.结果 ①正常组细胞Smurf2的mRNA和蛋白表达较弱,高糖组Smurf2表达较正常组增强(P<0.05),呈浓度依赖性;②30mmol/L高糖组加入MG132后,Smurf2的mRNA和蛋白表达减弱.结论 高糖可诱导肾系膜细胞Smud2表达增强,MG132可阻止高糖所导致的上述变化.提示泛素-蛋白酶体途径参与了糖尿病肾病的发病.     

FBW7蛋白的研究进展

泛素蛋白酶体系统介导的快速蛋白降解途径可以调节不同的细胞进程。这种蛋白水解系统通过泛素激活酶El、泛素载体蛋白E2和泛素连接酶E3的一系列泛素化作用,然后由26S蛋白酶体对底物进行快速降解。根据泛素连接酶结构的不同将其分为两大类：RING-指型蛋白和HECT-结构域型蛋白。含有cullin蛋白亚单位的RING-指型泛素连接酶,被称CRLs（cullin RINGubiquitin ligases）。     

蛋白酶体抑制剂MG132对小鼠一次性被动回避实验记忆形成和提取的作用

目的 探索蛋白酶体抑制剂MG132对小鼠被动回避实验学习记忆的作用.方法 在不同时间点皮下注射MG132 (25mg/kg)测定海马区蛋白酶体系统活性的变化.在一次性被动回避实验训练前或测试前皮下注射蛋白酶体抑制剂MG132 (25 mg/kg),之后测定MG132对记忆形成和记忆提取的影响.采用皮下注射MG132 (12mg/kg)和新奇环境干扰,测定MG132对干扰引起的记忆提取障碍的作用.结果 皮下注MG132(25 mg/kg)0.5～1.5 h后海马蛋白酶体系统被显著抑制.训练前以及测试前皮下注射MG132的记忆时间[分别为:训练前(173.30±47.51)s,测试前(44.10±11.16)s],低于对照组记忆测试结果[分别为:训练前对照组(296.03±3.97)s,测试前对照组(199.23 ±43.01)s],差异有统计学意义(P＜0.05).测试前给予新环境干扰[(184.30±50)s]有降低记忆时间的趋势[对照组(287.37±12.63)s],而加入MG132后记忆测试[(84.70±23.92)s]显著低于对照组[(164.02±35.26)s],差异有统计学意义(P＜0.05).但MG132自身对测试结果无统计学意义[实验组(150.10±35.89)s,对照组(174.19±30.54)s].结论 皮下注射MG132抑制海马区蛋白酶体活性进而阻碍小鼠一次性被动回避记忆形成及提取,并且放大干扰造成的记忆提取障碍.     

可溶性糖基化终末产物受体对缺血再灌注泛素-26S蛋白酶体系统活性的影响

【目的】建立动物心脏缺血再灌注模型,观察缺血再灌注模型中泛素-26 S蛋白酶体系统活性及总泛素蛋白表达的变化,检测s RAGE对缺血再灌注泛素-26 S蛋白酶体系统活性及总泛素蛋白表达的影响。【方法】复制C57BL/6J小鼠心脏缺血再灌注模型,Evans blue/2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)双染色检测心肌缺血范围;检测泛素-26 S蛋白酶体系统活性:糜蛋白酶样、半胱天冬酶样、胰蛋白酶样;通过Western blotting检测总泛素蛋白的表达。【结果】与假手术组比较,缺血再灌注组梗死区面积/危险区面积%明显增加(I/R:36.3%±2.3%vs.Sham:0%),泛素-26 S蛋白酶体系统活性明显降低(半胱天冬酶样:0.74±0.04 vs.1.00±0.07;胰蛋白酶样:0.61±0.05 vs.1.00±0.02;糜蛋白酶样:0.63±0.06 vs.1.00±0.07),总泛素蛋白表达水平明显升高(2.73±0.14 vs.1.00±0.05);与缺血再灌注组比较,s RAGE预处理能够明显降低梗死区面积/危险区面积%(I/R+s RAGE:18.0%±1.1%vs.I/R:36.3%±2.3%),明显升高缺血再灌注的泛素-26 S蛋白酶体系统活性(半胱天冬酶样:1.25±0.09vs.0.74±0.04;胰蛋白酶样:1.05±0.06 vs.0.61±0.05;糜蛋白酶样:1.12±0.06 vs.0.63±0.06),同时明显抑制缺血再灌注诱导的总泛素蛋白表达水平(2.17±0.09 vs.2.73±0.14)。【结论】s RAGE能够抑制缺血再灌注诱导的泛素-26 S蛋白酶体系统活性降低及总泛素蛋白表达的增加。     

MG-132对高氧肺损伤中细胞凋亡的保护作用及对p38信号通路的影响

目的 探讨泛素蛋白酶体抑制剂MG-132对高氧诱导的大鼠损伤肺组织中细胞凋亡及p38信号通路激活的保护作用。 方法 将26只SD大鼠随机分为四组：正常对照组（n=5）、MG-132对照组（n=5）、高氧组（n=8）和MG-132高氧组（n=8）。制备高氧肺损伤动物模型,MG-132处理组给予蛋白酶体抑制剂0.5 mg/kg,1次/d,腹腔注射。所有大鼠行肺组织病理学检查;采用TUNEL法检测细胞凋亡;免疫组织化学法检测泛素化蛋白和p38蛋白的表达。 结果 高氧暴露的SD大鼠肺组织可见水肿、大量炎症细胞浸润等急性炎症反应。高氧组的凋亡指数、p38MAPK表达均高于正常对照组和MG-132高氧组（P<0.05或P<0.01）。 结论 高氧可以导致肺组织细胞发生凋亡,可能是通过激活p38MAPK信号通路来调控的。蛋白酶体抑制剂MG-132可以减轻高氧引起的肺损伤,可能对p38MAPK信号通路有抑制作用。     

Detection of ubiquityl-calmodulin conjugates with a novel high-molecular weight ubiquitylprotein-isopeptidase in rabbit tissues

The selective degradation of many proteins in eukaryotic cells is carried out by the ubiquitin system. In this pathway, proteins are targeted for degradation by covalent ligation to ubiquitin, a highly conserved protein [1]. Ubiquitylated proteins were degraded by the 26S proteasome in an ATP-depended manner. The degradation of ubiquitylated proteins were controlled by isopeptidase cleavage. A well characterised system of ubiquitylation and deubiquitylation is the calmodulin system in vitro [2]. Detection of ubiquityl-calmodulin conjugtates in vivo have not been shown so far. In this article we discuss the detection of ubiquitin calmodulin conjugates in vivo by incubation with a novel high-molecular weight ubiquitylprotein-isopeptidase in rabbit tissues. Proteins with a molecular weight of ubiquityl-calmodulin conjugates could be detected in all organs tested. Incubation with ubiquitylprotein-isopeptidase showed clearly a decrease of ubiquitin calmodulin conjugates in vivo with an origination of unbounded ubiquitin. These results suggest that only few ubiquitin calmodulin conjugates exist in rabbit tissues.     

MG-132对高氧肺损伤中细胞凋亡的保护作用及对p38信号通路的影响

目的 探讨泛素蛋白酶体抑制剂MG-132对高氧诱导的大鼠损伤肺组织中细胞凋亡及p38信号通路激活的保护作用.方法 将26只SD大鼠随机分为四组:正常对照组(n=5)、MG-132对照组(n=5)、高氧组(n=8)和MG-132高氧组(n=8).制备高氧肺损伤动物模型,MG-132处理组给予蛋白酶体抑制剂0.5 mg/kg,1次/d,腹腔注射.所有大鼠行肺组织病理学检查;采用TUNEL法检测细胞凋亡;免疫组织化学法检测泛素化蛋白和p38蛋白的表达.结果 高氧暴露的SD大鼠肺组织可见水肿、大量炎症细胞浸润等急性炎症反应.高氧组的凋亡指数、p38MAPK表达均高于正常对照组和MG-132高氧组(P<0.05或P<0.01).结论 高氧可以导致肺组织细胞发生凋亡,可能是通过激活p38MAPK信号通路来调控的.蛋白酶体抑制剂MG-132可以减轻高氧引起的肺损伤,可能对p38MAPK信号通路有抑制作用.     

PIH1D1对染色质重塑复合物SNF5亚基降解的影响

目的 探讨PIH1D1对其结合蛋白SNF5的稳定性的影响.方法 通过蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)和蛋白酶体抑制剂MG132抑制作用找到SNF5的降解路径,而后转染PIH1D1真核表达质粒,探讨其对SNF5稳定性的影响.结果 得到CHX和MG132的最佳作用浓度;SNF5通过蛋白酶体依赖的途径降解;PIH1D1抑制SNF5的降解,从而稳定SNF5.结论 PIH1D1可能通过阻断蛋白酶体依赖途径,抑制SWI/SNF染色质重塑复合物SNF5亚基的降解,从而起到稳定SNF5的作用.     

人泛素结合酶cDNA的分离与克隆

目的 分离、克隆人泛素结合酶基因,并初步研究其组织表达谱。方法 根据与鼠泛素结合酶有较高一致性的人表达序列标签（ＥＳＴ）设计筛库引物,筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库,采用生物信息学方法分析筛选到的阳性克隆;设计控针,应用人多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 从文库中筛选到两个互为剪接异构体的长度分别为１ ４７１和１ ３１５ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆,其开放读码分别编码１４７和１０９个氨基酸,与鼠、果蝇、线虫     

The Apoptosis of Bovine Lens Epithelial Cells Induced by Proteasome Inhibitor MG132

To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the apoptosis of bovine lens epithelial cells （BLECs）, the cells were treated with MG132 at different concentrations for12, 24 and 36 h. The cell viability was analyzed by MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of BLECs was assessed by flow cytometry （FCM）. The results showed that after treatment for the same period, the inhibitory effect of MG132 on BLECs proliferation was enhanced with the increment of the concentration of MG132 （0, 2, 5, 10, μmol/L） （P〈0.05）. The 50% inhibiting concentration （IC50） was 2.03 μmol/L when the BLECs were treated with MG132 for 36 h. MG132 also induced the apop- tosis of BLECs obviously. FCM showed that the apoptosis index of the cells treated by MG132 at 2 μmol/L for 12 h was （20.24±1.51）%, and that of the control was （0.98±0.20）% respectively （P〈0.01, n=3）. It was concluded that MG132 could lead to apoptosis of BLECs. The decrease of proteasome activity may play an important role in the formation and development of cataract.     

蛋白酶体抑制剂对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132对大肠癌细胞系HCT-8增殖和凋亡的影响及其机制。方法将不同浓度MG132分别作用于HCT-8细胞,MTT法测其对HCT-8细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫细胞化学检测NF—κB、caspase3蛋白表达。结果随着MG132剂量、作用时间的增加,细胞增值抑制率增加（P〈0．01）;MG132作用细胞48h后,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率增加（P〈0．01）;细胞内NF—kBp65的表达减少而caspase3的表达增加（P〈0．01）。结论MG132能显著抑制大肠癌细胞增殖并诱导其凋亡,可能与下调NF—κB表达、促进caspase3表达有关。     

与泛素-蛋白酶体代谢途径有关的放射敏感性基因

泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin proteasome pathway)是细胞内ATP依赖的非溶酶体蛋白降解系统,能将泛素分子从底物蛋白上移除,选择性地调节细胞内蛋白质表达.p53、Chkl、Survivin、Notch、Cyclin D1等影响肿瘤细胞放射敏感性的基因编码蛋白可以在细胞内经过泛素-蛋白酶体途径降解,本文就这些基因做一综述.     

MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86及对混合淋巴细胞反应的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及其对混合淋巴细胞反应的作用。方法流式细胞仪检测MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析CD80和CD86mRNA表达情况;75Gy照射MG132诱导的HL-60细胞后,用CCK-8检测提高共刺激分子表达后,HL-60细胞对健康人单个核细胞的增殖作用。结果MG132上调HL-60细胞表达CD86,高浓度的MG132对HL-60细胞有直接杀灭作用,MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86后,对健康人单个核细胞起增殖作用。结论MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86,促进对健康人单个核细胞的增殖作用。