葡萄糖-6-磷酸异构酶混合肽段诱导的DBA/1小鼠类风湿性关节炎模型的建立

 目的: 利用葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)单一肽段及混合多肽片段免疫DBA/1小鼠,建立类风湿性关节炎(RA)模型,分析其主要评价指标及特点,为探讨RA的免疫机制及治疗提供新的理想动物模型。方法: hGPI325-339、hGPI469-483多肽片段和hGPI325-339单一肽段分别与完全弗氏佐剂充分乳化后,于小鼠尾根部皮下注射进行造模,并从体重变化、足踝关节症状评分、足踝关节病理改变、外周血及脾组织CD4⁺T细胞的表达、外周血iNKT细胞比例以及血清TNF-α和IL-6水平等方面进行模型鉴定及分析。结果: 模型小鼠在造模第8天,后爪最先出现红肿,逐渐加重累及四肢,第14天红肿达到高峰,足踝肿胀,行动不利,此后开始逐渐缓解;组织形态学观察发现足踝关节有炎症细胞浸润,以单核细胞与淋巴细胞为主,浆细胞少量出现,混合肽段的炎症状况明显强于单肽片段。与健康对照组和单肽片段模型组相比,混合肽段模型组体重增长缓慢;外周血、脾脏CD4⁺T细胞数量明显增多;炎症高峰期外周血iNKT细胞比例下降明显(P<0.05),血清中TNF-α水平显著升高(P<0.05)。结论: 混合GPI肽段诱导的RA模型小鼠在免疫学特征,特别是iNKT细胞免疫病理方面与RA患者尤为接近,可作为RA免疫机制研究和治疗的良好工具。     

含噻唑烷-4-酮的免疫调节剂对RA 患者iNKT 细胞免疫调节功能的影响

目的:研究新型合成的含噻唑烷-4-酮的免疫调节剂(CH1b)对活动期RA患者iNKT细胞免疫调节功能的影响。方法:从RA患者外周血中分离得到单个核淋巴细胞(PBMC),α-Galcer和IL-2体外刺激扩增后,经磁珠分选(MACS)得到纯化的iNKT细胞,分成对照组(IL-2)、α-Galcer组(IL-2+α-Galcer)、CH1b组(IL-2+CH1b)。采用MTT法测定各组RA患者iNKT细胞增殖率;MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit检测各组RA患者iNKT细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的水平;采用RT-PCR方法检测各组RA患者iNKT细胞中IFN-γmRNA和IL-4 mRNA的表达水平。结果:与对照组和α-Galcer组相比,CH1b组iNKT细胞增殖率明显增加(P0.05);与对照组相比,α-Galcer组IFN-γ和IL-4分泌水平明显增加(P0.05),CH1b组IFN-γ和IL-4的分泌量也明显增加,IFN-γ/IL-4明显降低(P0.05);与对照组相比,α-Galcer组IFN-γmRNA与IL-4 mRNA表达均明显增高,CH1b组IFN-γmRNA表达差异不明显,IL-4 mRNA的表达明显增高。结论:新型合成的免疫调节剂(CH1b)可促进活动期RA患者活化的iNKT细胞增殖,并促进IL-4的分泌,上调IL-4 mRNA的表达,诱导iNKT细胞向Th2方向分化,对恢复RA病人体内免疫平衡具有重要意义。     

含噻唑烷-4-酮的免疫刺激剂CH2a增强人iNKT细胞的功能

目的 研究含噻唑烷-4-酮的糖类衍生小分子免疫刺激剂CH2a对人iNKT细胞功能的影响.方法 分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),经α-半乳糖神经酰胺(a-Galcer)和IL-2体外扩增后,利用磁珠分选分离纯化得到恒定型自然杀伤T细胞(iNKT细胞).5(6)-羧基二乙酸荧光黄琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记的纯化iNKT细胞,与CH2a共孵育后,流式细胞术检测细胞增殖和分代,IFN-γ和IL-4的表达;MTT法定量检测细胞增殖率及对K562细胞的杀伤活性.ELISA检测CH2a处理细胞培养基中IFN-γ和IL-4水平.结果 CH2a能显著促进IL-2引起的iNKT细胞体外增殖;提高IFN-γ和IL-4的生成量及IFN-γ/IL-4的比值;并显著增强iNKT细胞的杀伤活性.结论 CH2a有可能通过诱导iNKT分泌Thl类的细胞因子,调节T细胞向Th1分化,从而增强细胞免疫功能;同时显著提高iNKT的细胞毒功能.     

沉默HIF-1α表达逆转缺氧诱导肝癌免疫抑制的实验研究

目的:探讨缺氧诱导因子-1(HIF-1α)表达在缺氧诱导肝癌免疫抑制中的作用,以期阐明缺氧致肝癌免疫抑 制的分子机制。方法:构建缺氧C57BL/6 小鼠移植瘤模型,缺氧探针HypoxyprobeTM-1 标记缺氧组织,免疫组化检测缺氧组织 HIF-1α表达,qPCR 检测缺氧组织肿瘤免疫因子表达;慢病毒构建稳定敲减HIF-1α的Hepa1鄄6 小鼠肝癌细胞株,并移植于 C57BL/6 小鼠,6 周后检测移植瘤瘤重,Western blot 检测移植瘤HIF鄄1琢表达,流式细胞仪检测移植瘤中肿瘤浸润免疫细胞 CD4+CD25+ Foxp3+调节性T 细胞表达,qPCR 检测缺氧组织肿瘤免疫因子表达。结果:C57BL/6 小鼠缺氧移植瘤模型构建成 功,缺氧组织HIF鄄1琢高表达,肿瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b 和CXCL10 低表达,肿瘤促进因子IL-10、IL-1β和IL-17 高表达;敲减 HIF-1α明显抑制了移植瘤生长,降低了CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T 细胞浸润,同时抑制了肿瘤促进因子IL-10、IL-1β和IL-17 表达,促进了肿瘤抑制因子IFN鄄酌、IL鄄12b 和CXCL10 表达。结论:缺氧可诱导肝癌组织HIF鄄1琢表达及免疫抑制,相反,沉默 HIF鄄1琢可抑制移植瘤生长并逆转肝癌免疫抑制,揭示了HIF-1α在缺氧致肝癌免疫抑制中的作用,可能为将来肝癌诊治提供 新思路。     

含噻唑烷-4-酮的糖类衍生小分子免疫调节剂对人淋巴细胞分化的影响

目的 研究含噻唑烷-4-酮的糖类衍生小分子免疫调节剂对人外周血淋巴细胞活化与分化的影响.方法 从健康成年人分离外周血单个核淋巴细胞,经ConA+免疫调节剂CH1a、CH2a、CH1b CH2b和匹多莫德(pidotimod)刺激48 h后,收集培养上清,ELISA法检测IL-2、IL-4和IFN-γ含量；72 h后MTT法检测细胞增殖率；经ConA+免疫调节剂CH1a、CH2a、CH1b CH2b和pidotimod刺激,孵育72 h后收获细胞,利用流式细胞技术检测细胞表面黏附分子.结果 所有样品均可促进T细胞增殖；免疫调节剂CH1a、CH2a和pidotimod上调CD3、CD4、CD19和CD16CD56的表达并促进IL-2和IFN-γ分泌.免疫调节剂CH1b、CH2b上调CD3、CD4、CD19和CD16CD56的表达并促进IL-2和IL-4分泌.结论 免疫调节剂CH1a、CH2a和pidotimod有可能诱导Th0向Th1分化并可提高B细胞和NK细胞增殖活化水平.而CH1b、CH2b则有可能诱导Th0向Th2分化并提高B细胞和NK细胞的增殖活化水平.     

冬虫夏草菌丝体提取物通过抑制炎性因子及Treg 细胞功能缓解肺纤维化

目的:观察冬虫夏草菌丝体(Hirsutella sinensis mycelium,HSM)提取物对盲肠穿孔结扎(CLP)小鼠的炎症反应和肺纤维化程度的影响。方法:建立CLP 诱导脓毒症5 d 和10 d 小鼠模型,分别分为假术组(sham,n =5)、模型组(CLP,n =11)、治疗组(HSM,n =11)。冬虫夏草菌丝体组在术前2 h 和术后给予HSM 提取物200 mg/ (kg•d)(低于人体用量0.27 g/kg),假术组和模型组给予等量的生理盐水。利用Q-PCR 检测了肺组织中炎性因子TNF鄄琢和IL鄄1茁及纤维化因子TGF-1、TIMP1 和MMP9 的表达;利用流式细胞术分析了小鼠外周血和脾脏中Th1 细胞以及脾脏组织中Treg 细胞的数量;另外,还对肺组织切片进行了HE 染色以及琢鄄平滑肌肌动蛋白( SMA)和纤连蛋白(fibronection)免疫组化染色。结果:模型组外周血和脾脏中Th1 细胞以及脾脏组织中Treg 细胞的数量较假术组显著降低,而HSM 提取物治疗能上调上述细胞的数量。5 d 时,模型组肺组织中IL鄄1茁及纤维化因子TGF-1、MMP9 和TIMP1 表达显著上调,到第10 天时有所降低但仍高于sham 组,而治疗组上述因子表达明显降低;各组肺组织TNF鄄琢表达无显著差异;HE 染色显示模型组肺部炎性样变明显,到第10 天时炎性样变比5 d 时减轻,而治疗组均有改善;免疫组化显示与假术组比,模型组肺内间质 SMA 和fibronection 表达明显增多,而治疗组肺内间质表达低于模型组。结论:HSM 提取物具有抑制炎症、平衡免疫及缓解肺纤维化的功能。     

孟鲁司特钠对ITP 模型小鼠T 淋巴细胞亚群及晚期氧化蛋白产物的影响

目的:探讨孟鲁司特钠对特发性血小板减少性紫癜(ITP)模型小鼠T 淋巴细胞亚群、细胞因子及晚期氧化蛋 白产物(AOPP)的水平,分析孟鲁司特钠治疗ITP 的机制。方法:将40 只ITP 模型小鼠随机分为对照组、模型组、孟鲁司特钠 低剂量组(3 mg/ kg)和孟鲁司特钠高剂量组(12 mg/ kg)。成功造模后第8 天开始,连续14 d 给药后,计算血小板数量(PLT)、 胸腺、脾脏指数,采用流式细胞仪检测外周血T 淋巴细胞亚群,酶联免疫法检测血清中IL-6、TNF鄄琢、AOPP 水平。结果:与空白 组小鼠比较,模型组小鼠的PLT、脾脏指数、CD8+ 、IL-6、TNF-α、AOPP 水平显著升高(P<0.05),CD3+ 、CD4+ 、CD4+ / CD8+ 水平显 著下降(P<0.05);与模型组比较,孟鲁司特钠低、高剂量组小鼠脾脏指数、CD8+ 、IL-6、TNF-α、AOPP 水平显著降低(P<0.05), CD3+ 、CD4+ 、CD4+ / CD8+水平显著上调(P<0.05)。结论:孟鲁司特钠能够通过调节免疫功能紊乱,消除AOPP 积累,降低IL鄄6、 TNF鄄琢水平,对ITP 起治疗作用。     

iNKT细胞联合卵清蛋白对髓源性树突状细胞表型和功能的影响

目的:观察哮喘小鼠恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)联合卵清蛋白(OVA)对髓源性树突状细胞(BMDCs)表型和功能的影响。方法:取健康雄性野生型BLAB/c小鼠BMDCs,分别与哮喘小鼠脾脏iNKT细胞联合OVA(iNKT细胞联合OVA组)、脂多糖(LPS组)、iNKT细胞联合PBS(iNKT细胞联合PBS组)、OVA(OVA组)或PBS(PBS组)共培养20 h,采用流式细胞术检测各组BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40的表达水平,ELISA法检测培养上清液中白细胞介素12(IL-12)p70、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-10的水平;取各组共培养后的BMDCs,与DO11.10转基因小鼠脾CD4~+ T细胞共培养48 h,采用ELISA法检测培养上清液中IL-4和干扰素γ(IFN-γ)的水平。结果:iNKT细胞联合OVA组BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40及培养上清液IL-12 p70、IL-6和TNF-α水平与LPS组比较差异无统计学显著性(P0.05),但明显高于iNKT细胞联合PBS组、OVA组和PBS组(P0.05或P0.01);iNKT细胞联合OVA组BMDCs与DO11.10 CD4~+ T细胞共培养上清液IL-4水平与LPS组比较差异无统计学显著性(P0.05),但明显高于iNKT细胞联合PBS组、OVA组和PBS组(P0.01)。结论:存在OVA时,iNKT细胞可以诱导BMDCs表型和功能的免疫原性成熟。     

类风湿关节炎患者外周血单核细胞亚群的变化及其意义

目的:本次研究通过检测类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞亚群比例及其分泌促炎细胞因子的功能,探讨单核细胞亚群在RA 发病过程中的作用。方法:22 例RA 患者(RA 组)和22 例健康对照者(HC 组),经知情同意后抽取3ml 静脉血,肝素钠抗凝。流式细胞术(FCM)检测单核细胞亚群比例、中间型单核细胞表面HLA-DR、Toll 样受体2(TLR2)和髓系细胞触发受体-1(TREM-1)表达,及其细胞内肿瘤坏死因子(TNF)鄄琢平均荧光强度(MFI),并分析RA 患者单核细胞亚群比例与血清细胞因子的相关性。正态数据分析采用Students’t-test 检验。结果:与HC 组相比,RA 组中间型单核细胞比例升高[(4.6±1.2)% vs (11.7±1.6)%],差异有统计学意义(P<0.05);HLA-DR 表达(MFI)与HC 组比较差异无统计学意义(26.8±8.6 vs 30.2±6.1,P>0.05)。RA 组TLR2(750.2±110.3 vs 526.8±98.6)、TREM-1(58.4±12.1 vs 40.3依10.2)表达(MFI)高于HC 组,差异均有统计学意义(P<0.05);RA 组中间型单核细胞胞内TNF鄄琢(46.3±6.4 vs 36.7±8.3)MFI 高于HC 组,差异有统计学意义(P<0.05)。RA 患者中间型单核细胞比例与DAS28 评分和血清TNF 、白细胞介素(IL)-17 呈正相关,相关系数分别为0.593(P =0.003)、0.471(P =0.027) 和0.538(P =0.009)。结论:RA 患者外周血单核细胞向中间型极化,并处于活化状态,高表达TLR2 和TREM-1,分泌较多的促炎细胞因子TNF ,参与RA 的疾病过程。因此,抑制单核细胞向中间型极化或阻断表面受体表达可能是治疗RA 的新途径。     

扩张型心肌病小鼠Th1/Th2细胞亚群及其相关细胞因子的分析

目的:探讨体液免疫在扩张型心肌病发病机制中的重要性。方法:以线粒体腺苷酸转位酶(adeninenucleotidetranslocator,ANT)合成肽免疫液免疫小鼠建立扩张型心肌病动物模型(DCM组) ,运用三色荧光标记流式细胞术检测其脾淋巴细胞中Th细胞亚群分布,ELISA法检测其血清细胞因子IFN γ、IL 4、IL 2、IL 6、TNF α的表达及其抗ANT自身抗体的产生。以不含肽的免疫液免疫小鼠为对照组。结果:DCM组小鼠Th1及Th2细胞亚群较对照组均有增多,以Th2更为显著,且Th1/Th2比值明显低于对照组(P均<0 0 1) ;IL 4、IL 6和TNF α表达明显增高,而IFN γ和IL 2却较对照组明显降低(P均<0 0 1) ;抗ANT自身抗体均为阳性,对照组为阴性。结论:ANT合成肽诱导扩张型心肌病时Th细胞均被激活,Th2细胞介导的体液免疫应答在该病发病机理中起着优势作用。