激活TLR5 和NLRC4 通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用

目的:探究激活TLR5 和NLRC4 通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用。方法:表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC(同时激活TLR5 和NLRC4 两条通路)、FliC驻90-97(不能激活TLR5 通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4 通路)和FliC驻90-97:L3A(两条通路都不激活)。用不同浓度的重组鞭毛素蛋白刺激MCF-7 细胞和MDA-MB-231 细胞,72 h 后,利用CCK8 法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,并计算抑制率。软琼脂形成实验:每孔细胞数为1 000 个MCF-7 细胞铺于6 孔板中,重组鞭毛素蛋白浓度为1 g/ ml,培养14 d 后,结晶紫染色,显微镜下计数克隆数,计算克隆形成率。结果:四种鞭毛素蛋白在0.1 g/ ml 的浓度刺激下,对MCF-7 细胞的抑制率达到30%,FliC驻90-97 对MCF-7 的抑制作用是剂量依赖的。在1 g/ ml 时单独激活TLR5 的FliC-L3A 鞭毛素蛋白的抑制率高于全长的FliC 和单独激活NLRC4 的FliC 90-97。FliC 90-97:L3A 也对MCF-7 细胞有抑制作用。四种鞭毛素蛋白对MDA-MB-231 细胞在加转染试剂之后才表现出抑制效应。结论:鞭毛素蛋白可以抑制乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的增殖,其机制可能是由于分别激活胞膜和胞内的除TLR5 和NLRC4 以外的其他通路。     

NLRC4炎性小体的研究进展

炎性小体是胞质内的一组多蛋白复合体,一方面它能调节半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1的活化,促进IL-1β和IL-18成熟与分泌,引起炎性反应;另一方面可以引起细胞焦亡。NLRC4炎性小体的主要信号途径为:激活物(如细菌鞭毛蛋白)、感应蛋白(NAIP)、核效应蛋白(NLRC4)、连接蛋白(ASC)、效应蛋白。NLRC4活化的主要调控机制是配体结合机制和磷酸化作用。NLRC4是肠道免疫的重要组成成分,可抵御多种病原体,并与多种人类疾病相关,如自身炎性疾病、糖尿病肾病、胸腺癌等。     

TLR2和TLR4信号在肿瘤发生和发展中的作用及机制的研究进展

TLR2和TLR4信号活化对肿瘤发生发展具有抑制和促进双重作用,其机制涉及T细胞活化、细胞凋亡、NK细胞功能、免疫抑制和肿瘤转移等多个环节.本文对TLR2和TLR4信号在肿瘤发生发展中的作用及机制的最新研究进展进行综述.     

氯喹对内毒素、细菌DNA诱导的TLR4、TLR9表达的作用研究

目的 :内毒素 (LPS)、细菌DNA均为全身炎症反应综合征 (SIRS)的主要启动因素。氯喹 (CQ)为抗疟药 ,具有抗炎作用 ,能够拮抗LPS、细菌DNA诱导的细胞因子释放 ,但其作用机制尚不清楚。本研究旨在观察CQ对TLR4、TLR9表达的影响 ,探讨CQ拮抗LPS、细菌DNA的可能机制。方法 :体外培养小鼠巨噬细胞系ANA 1 ;实验分正常对照 (去热原水 )组、LPS1 μg/ml刺激组、大肠杆菌DNA(ECDNA) 1 0 μg/ml刺激组及相应的CQ 1mg/ml处理组 ,CQ在加去热原水、LPS、ECDNA刺激前 2h给药 ;采用RT PCR技术 ,观察LPS、ECDNA刺激组及CQ处理…     

人TLR2和TLR4胞外区cDNA的克隆

目的 从脂多糖诱导的外周血单个核细胞克隆人Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)胞外区cDNA.方法 用不同浓度脂多糖在不同时间刺激单个核细胞后提取总RNA,RT-PCR方法半定量测定TLR2和TLR4的表达,应用pUCm-T载体克隆胞外区cDNA,双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果 单个核细胞在四种浓度脂多糖刺激3 h,6 h和12 h后.TLR2和TLR4表达并不相同.15 μg/mL脂多糖作用6 h TLR2表达最高,10 μg/mL脂多糖作用3 hTLR4表达最高.经RT-PCR扩增TLR2和TLR4胞外区cDNA分别为1 700 bp和1 900 bp,T载体克隆、酶切鉴定及测序分析后证实,目的 片段与GenBank中序列一致.结论 脂多糖的诱导对外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达有显著影响,并且成功克隆了胞外区cDNA.     

4-1BB信号对小鼠树突状细胞表面TLR4表达的调节

目的 探讨4-1BB（CD137）激发型单克隆抗体2A对小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）表面TLR4表达的调节.方法 用不同剂量2A、LPS以及2A与LPS联合,或用LPS预刺激后再加入2A,以流式细胞术检测这些处理因素作用下DC表面TLR4表达情况.结果 LPS可下调DC TLR4的表达,下调作用可维持24 h,而2A可使DC TLR4的表达上调,上调作用可维持12 h,并可拮抗LPS对TLR4的下调作用.用LPS预处理DC后再加入2A,也可拮抗LPS的下调作用.结论 4-1BB信号可以上调DC表面TLR4的表达.     

TGF-β1下调炎性巨噬细胞RAW264.7 TLR4受体的表达

目的探讨TGF-β1对小鼠巨噬细胞RAW264.7 TLR4受体表达的调节作用。方法 Teal-Time PCR法检测RAW264.7细胞TGF-β1和TLR4受体mRNA表达,ELISA法检测RAW264.7细胞TGF-β1的分泌,流式细胞术检测RAW264.7细胞TLR4受体的表达。结果一定剂量的LPS促进RAW264.7分泌TGF-β1,且呈剂量依赖关系,一定剂量的TGF-β1单独刺激下调RAW264.7的TLR4受体的表达,TGF-β1能够下调LPS活化的RAW264.7细胞TLR4受体表达。结论 TGF-β1可以通过下调巨噬细胞TLR4受体表达来控制机体炎性反应,这可能是TGF-β1作为免疫抑制剂抑制炎症反应的重要途径之一。     

lncRNA VIM-AS5在人乳腺癌细胞系中的表达及对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨长链非编码RNA (lncRNA)VIM-AS5在人乳腺癌组织中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的作用机制。方法 利用Lnc2Cancer 3.0数据库分析VIM-AS5在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌患者临床分期、生存期的相关性。RT-qPCR检测乳腺癌BT-549、MDA-MB-435、MDA-MB-231、CAL-51细胞中VIM-AS5的表达量。通过脂质体分别将VIM-AS5过表达质粒和阴性对照质粒转染至CAL-51细胞,依次记为VIM-AS5组和NC组。采用集落形成实验、划痕愈合法分别检测CAL-51细胞的增殖活力和迁移率。双荧光素酶报告基因实验验证VIM-AS5与miR-500a的靶向关系。RT-qPCR检测CAL-51细胞中miR-500a表达。Western blot检测CAL-51细胞中JAK/STAT3分子通路蛋白表达。结果 乳腺癌组织中VIM-AS5表达显著低于癌旁组织(P<0.01)。VIM-AS5表达量与乳腺癌患者的临床分期呈负相关(P<0.01)。VIM-AS5低表达乳腺癌患者的生存期明显短于VIM-AS5高表达乳腺癌患者(P&...     

TLR2和TLR4相关疾病与药物的研究进展

Toll样受体(TLR)家族的TLR2和TLR4在天然免疫和炎症反应中起到重要作用,有利于机体抵抗病原体感染或组织损伤,但是过度的免疫反应也会带来负面影响,与心血管疾病等多种免疫过度相关疾病的发生密切相关。因此,将TLR2、TLR4作为这些疾病防治和药物开发的潜在靶点,研发TLR2、TLR4拮抗剂、对TLR2、TLR4进行负调控成为近年来的热点之一。本文重点对TLR2、TLR4相关的心血管疾病及TLR2、TLR4拮抗剂研发现状进行回顾与总结。     

Toll样受体4(TLR4)信号通路及其靶向药物的研究进展

先天免疫系统利用模式识别受体(PPR)或其他分子受体识别入侵的细菌等病原微生物,通过触发炎症反应来阻止感染的传播,在抗菌防御中起着至关重要的作用.Toll样受体4(TLR4)是哺乳动物先天免疫系统的核心,在细菌内毒素介导的炎症中起关键作用.TLR4可以识别Gram阴性菌细胞壁上的脂多糖(LPS),从而激活TLR4信号通...     

激活TLR5 和NLRC4 通路对小鼠先天免疫细胞的影响

目的：探讨用重组鞭毛素蛋白同时或者分别激活C57BL/6小鼠模型TLR5和NLRC4通路对小鼠先天免疫细胞的影响。方法：首先,表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC（同时激活TLR5和NLRC4两条通路）; FliCΔ90-97（不能激活TLR5通路）;FliC-L3A（不能激活NLRC4通路）;FliCΔ90-97:L3A（两条通路都不激活）。将小鼠分为5组,分别为:PBS组、FliC组、FliC-L3A组、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A组。分别用PBS和10 μg重组鞭毛素蛋白腹腔注射C57BL/6小鼠,每组3只。12 h后收集腹腔灌洗液,流式抗体染色检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞和NK细胞的比例。同时,取小鼠脾脏制成脾细胞悬液,流式抗体染色检测DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达情况及脾细胞中调节性T细胞（Treg）的比例。结果：激活TLR5（FliC组和FliC-L3A组）和NLRC4通路（FliCΔ90-97组）小鼠的腹腔灌洗液中中性粒细胞和NK细胞的比例都显著高于PBS组和FliCΔ90-97:L3A组（P <0.01）。激活TLR5通路的FliC组和FliC-L3A组的DC表面CD80和CD86表达水平显著高于PBS组、FliCΔ90 97和FliCΔ90-97:L3A组（P<0.01）。FliC-L3A组调节性T细胞的比例高于其他组（P<0.05）。结论：激活TLR5和NLRC4通路可以趋化中性粒细胞、NK细胞,两条通路激活对中性粒、NK细胞有相同的趋化能力。鞭毛素蛋白只有激活TLR5通路才可以上调DCs表面共刺激分子CD80和CD86,促进DCs的成熟。     

TLR5 or NLRC4 is necessary and sufficient for promotion of humoral immunity by flagellin

The fact that some TLR-based vaccine adjuvants maintain function in TLR-deficient hosts highlights that their mechanism of function remains incompletely understood. Thus, we examined the ability of flagellin to induce cytokines and elicit/promote murine antibody responses upon deletion of the flagellin receptors TLR5 and/or NLRC4 (also referred to as IPAF) using a prime/boost regimen. In TLR5-KO mice, flagellin failed to induce NF-κB-regulated cytokines such as keratinocyte-derived chemokine (CXCL1) but induced WT levels of the inflammasome cytokine IL-18 (IL-1F4). Conversely, in NLRC4-KO mice, flagellin induced keratinocyte-derived chemokine, but not IL-18, whereas TLR5/NLRC4-DKO lacked induction of all cytokines measured. Flagellin/ovalbumin treatment resulted in high-antibody titers to both flagellin and ovalbumin in WT, TLR5-KO and DKO mice but did not elicit antibodies to either in TLR5/NLRC4-DKO mice. Thus, flagellin's ability to elicit/promote humoral immunity requires a germ-line-encoded receptor capable of recognizing this molecule. Such promotion of adaptive immunity can be effectively driven by either TLR5-mediated activation of NF-κB or NLRC4-mediated activation of the inflammasome.     

MAPK信号通路相关信号转导分子在人乳腺癌细胞系中的表达及活化水平

目的 :检测化疗药物环磷酰胺及表阿霉素对 4种乳腺癌细胞增殖的抑制作用 ,以及对细胞外信号调节激酶 (ERK1/2 )及其上游激酶 (MEK1/2 )蛋白表达及活化水平的影响。方法 :按常规方法培养细胞及制备蛋白电泳样品。应用Westernblot检测培养的正常乳腺上皮细胞系MCF 10及MCF 7、T4 7D、Bcap 37、SK BR 3乳腺癌细胞系中 ,ERK1/2和MEK1/2的表达及活化 (磷酸化 )水平 ,以及这两种药物对ERK1/2和MEK1/2的表达及活化的影响。用MTT比色法检测这两种化疗药物对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。结果 :与对照MCF 10细胞相比较 ,4种乳腺癌细胞系中 ,MEK1/2、ERK1/2蛋白的表达及活化水平均明显增高 ;两种化疗药物均可抑制乳腺癌细胞的增殖。这两种药物处理的乳腺癌细胞中 ,MEK1/2、ERK1/2蛋白的表达及其活化水平明显低于未处理组。结论 :MEK、ERK蛋白的过度表达及活化 ,可能在人乳腺癌的发生、发展中起重要作用。这两种化疗药物可能是通过抑制MEK、ERK蛋白的过度表达及活化来抑制乳腺癌细胞的增殖     

Metronidazole affects breast cancer cell lines

PurposeThe aim of our study was to evaluate the impact of metronidazole (MTZ) on cytotoxicity and DNA synthesis in MCF-7 (estrogen receptor positive) and MDA-MB-231 (estrogen receptor negative) breast cancer cell lines.Material/MethodsToxicity of MTZ was determined by MTT test. MCF-7 and MDA-MB-231 cells were incubated with metronidazole used in different concentrations for 24, 48 and 72 hours. The effect of MTZ on DNA synthesis was measured as [3H]-thymidine incorporation.ResultsWe showed that MTZ in concentration 250 μg/ml significantly increases the growth of MCF-7 cell lines after 24 hours of incubation, but it reduces cell viability in concentrations 1 and 10 μg/ml 72 hours after the drug application. Significant increase of MDA-MB-231 cell viability was obtained in MTZ concentration of 250 μg/ml after 24 and 72 hours. The increase of [3H]-thymidine incorporation in MCF-7 cell line treated with MTZ in concentration 250 μg/ml was statistically significant after 24 hours. Great suppression of cell proliferation was obtained in MDA-MB-231 breast cell line after application of the following concentrations of MTZ: 0.1 μg/ml (after 24 hours) and 0.1, 10, 50, 250 μg/ml (after 72h).ConclusionsWe found that metronidazole exerts different dose- and time- dependent effects on human breast cancer cell lines characterized by presence or absence of estrogen receptors. We suggest that these discrepancies may be influenced by the estrogen signaling.     

Expression pattern of NLRC5 in the postnatal mouse brain

Nucleotide oligomerization domain-like receptors (NLRs), belonging to a large family of pattern recognition receptors, participate in the host’s first line of defense against invading pathogens. Caspase recruitment domain containing 5 (NLRC5), the largest member in the NLR family, is demonstrated to be involved in the innate immune response and inflammatory diseases far and wide. Recent studies report that NLRC5 is associated with some central nervous system (CNS) diseases. Besides, NLRC5 is a mastery regulator for the expression of MHC class I both in the immune system and the CNS, while MHC class I is expressed and exerts its function in the brain. Therefore, it is necessary to investigate the expression pattern of NLRC5 in the developing and adult CNS. In our study, postnatal brain sections of C57BL/6 J mice are analyzed for the expression of NLRC5 protein by immunofluorescence. In the postnatal stages of developing telencephalon, NLRC5 exhibits a spatial and temporal expression pattern. NLRC5 is time-specifically expressed in subfields of hippocampus and different layers of prefrontal cortex. Moreover, it is shown that NLRC5 is highly cell type specific. It can be expressed in large quantities by neurons and microglia, but rarely expressed by astrocytes. Taken together, our research is important for further understanding the biological characteristics of NLRC5 and its function in the CNS.     

Expression of histamine receptors in different cell lines derived from mammary gland and human breast carcinomas

Inflammation Research -     

bcl—2／bax对不同乳腺癌细胞凋亡的调节作用

目的：了解bcl-2/bax在乳腺癌细胞的p53依赖性凋亡和p53非依赖性凋亡中的作用。方法：用原位杂交的方法检测化疗药物VM-26诱导入乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-435S凋亡前后bcl-2和bax的mRNA表达情况。结果：与MDA-MB-435S细胞相比,MCF-7细胞的bcl-2 mRNA水平较高。两株细胞均能在VM-26的作用下发生凋亡。药物诱导后,MCF-7细胞的bcl-2 mRNA表达下降,bax mRNA表达增加;MDA-MB-435S细胞bax mRNA表达增加,bcl-2、mRNA无明显变化。结论：wt p53可在转录水平调节bcl-2/bax的表达,从而介导凋亡作用;bax在p53非依赖性凋亡中也发挥一定作用;bcl-2的高表达可能与肿瘤耐药性有关。     

TLR2和TLR4在原发性肝癌中的表达

目的：本研究通过检测原发性肝癌Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）的表达，分析其与临床病理生理因素的关系，探讨TLR2，TLR4在原发性肝癌疾病过程中的可能作用。方法：采用免疫组化法和实时荧光定量PCR分别在蛋白水平及mRNA水平检测原发性肝癌组织和配对癌旁组织TLR2、TLR4的表达。结果：原发性肝癌组织在蛋白水平和mRNA水平TLR2和TLR4的表达均明显低于癌旁组织（P<0.01）。但免疫组化结果显示不论是肝癌组织还是癌旁组织，TLR2和TLR4的表达均明显高于正常肝组织（P<0.01，P<0.05），有门静脉分支癌栓的患者癌组织TLR4的表达强度低于无门静脉分支癌栓的患者（P<0.05）。结论：肝癌组织TLR2和TLR4的表达与癌旁组织相比受到相对抑制，但高于正常肝组织，TLR2和TLR4信号途径可能参与了原发性肝癌的病理过程。