丹皮酚通过抑制miR-21表达减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

目的研究丹皮酚(PAE)通过抑制微小RNA-21(miR-21)减轻博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化的相关机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、BLM组、阳性对照(PC)组、PAE组,比较各组大鼠的肺纤维化相关指标,miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平,及Smad7、TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平;将制备好的纤维细胞分为对照组,TGF-β1组,PAE-L组,PAE-M组,PAE-H组,miR-21抑制剂组,检测各组细胞中miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平及Smad7、COLIA1、α-SMA蛋白水平,并验证miR-21与Smad7的靶向关系。结果与对照组相比,BLM组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度,miR-21mRNA表达水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白表达水平显著升高均显著升高(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.01),与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度均显著降低(P0.01);与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠肺组织中miR-21 mRNA水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低,Smad7的mRNA及蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组相比,TGF-β1组成纤维细胞中miR-21的mRNA及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著升高(P0.01),Smad7的m RNA及蛋白水平显著降低(P0.01);与TGF-β1组相比,PAE-L组、PAE-M组、PAE-H组、miR-21 inhibitor组成纤维细胞中miR-21的mRNA水平及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P0.01);靶基因数据库预测及双荧光素酶报告实验表明,miR-21靶向抑制Smad7。结论 PAE可能通过抑制miR-21表达靶向促进Smad7表达,并抑制TGF-β1表达来减轻BLM诱导的肺纤维化。     

丹酚酸B对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响

目的:研究丹酚酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响及其机制。方法:培养人肾小球系膜细胞(HGMCs),随机分为正常对照组、高糖组及高糖+丹酚酸B高、中、低剂量组,高糖组和丹酚酸B各组用含高浓度(33.3 mmol/L)葡萄糖的培养基培养72 h,丹酚酸B各组同时加人相应浓度丹酚酸B共同孵育。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,ELISA法检测细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)的分泌水平,Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及Smad2和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化水平。结果:高糖孵育72 h后,肾小球系膜细胞α-SMA的蛋白表达水平明显升高,ColⅠ、ColⅢ、FN及LN蛋白的分泌水平显著增加(P 0.01),TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平也明显升高(P 0.01);与丹酚酸B共同孵育可明显降低α-SMA蛋白的表达水平,ColⅠ、ColⅢ、FN和LN的分泌明显减少,TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平显著下降(P 0.01或P 0.05)。结论:丹酚酸B可明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化,减少ColⅠ和ColⅢ等细胞外基质分泌,其机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路及p38 MAPK活化有关。     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

硫化氢通过抑制TGF-β1/Smad信号通路抗大鼠肺纤维化

目的观察硫化氢(H2S)对博莱霉素所致大鼠肺纤维化的影响,并探讨其是否通过转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路发挥作用。方法 SD大鼠50只随机分为正常对照组、假手术组、模型组、硫氢化钠(Na HS)组和地塞米松组,每组10只,假手术组大鼠以生理盐水气管内注入,而后3组大鼠以博莱霉素A5气管内注入制备肺纤维化模型。自第2天起,Na HS组、地塞米松组大鼠分别以Na HS、地塞米松腹腔注射,其余3组腹腔注射等量生理盐水。全部大鼠第28天处死,留取肺组织,行HE和Masson染色,通过试剂盒测定肺组织羟脯氨酸(HYP)含量,采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)m RNA和蛋白表达。结果与模型组比较,Na HS组和地塞米松组肺泡炎症与肺纤维化程度明显减轻(P0.01)。与正常对照组或假手术组比较,模型组肺组织HYP含量以及TGF-β1、Smad 2、Smad 3、α-SMA、ColⅠ、ColⅢm RNA和蛋白表达水平升高,但Smad 7 m RNA和蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P0.01)。通过Na HS或地塞米松处理后,肺组织HYP含量以及TGF-β1、Smad 2、Smad 3、α-SMA、ColⅠ、ColⅢm RNA和蛋白表达水平减少,而Smad 7 m RNA和蛋白表达水平增加,与模型组比较,差异均有统计学意义(P0.01)。然而,Na HS组与地塞米松组以及假手术组与正常对照组上述指标相比无显著性差异(P0.05)。结论 H2S可能通过抑制TGF-β1/Smad信号转导通路下调α-SMA表达,从而减少ColⅠ、ColⅢ合成发挥抗大鼠肺纤维化作用。     

松脂醇二葡萄糖苷对光老化HDF细胞ER/TGF-β1/Smads信号通路的调控机制

目的从分子生物学水平探讨杜仲中松脂醇二葡萄糖苷(PDG)对光老化人真皮成纤维细胞(HDF)ER/TGF-β1/Smads信号通路的调控机制。方法建立以长波紫外线模型损伤HDF细胞。给予不同浓度PDG和通路阻断剂进行干预,用MTT检测细胞增殖率,Real time-PCR和Western blot法检测各组细胞内含有的信号转化生长因子(TGF-β1)、转导分子(Smad3)、I型胶原(COL1A1)对应mRNA和蛋白的表达。结果与空白组比较,模型组增殖率及TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA和蛋白表达均显著降低(P 0.01);与模型组比较,各给药组增殖率和TGF-β1、Smad3、COL1A1mRNA和蛋白表达均显著升高(P0.01);与PDG高浓度组比较,TGF-β1、Smad3、ER三个阻断剂组相对应的TGF-β1、Smad3和COL1A1相应mRNA和蛋白表达均显著降低(P 0.01)。结论 PDG能增加HDF细胞TGF-β1、Smad3、COL1A1对应mRNA和蛋白表达,对光老化HDF细胞胶原合成有促进作用;但这种作用能被TGF-β1、Smad3和ER阻断剂所抑制, PDG促进胶原合成的作用机制可能与ER/TGF-β1/Smads信号通路有关。     

柴胡皂甙D通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制人胚肺成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生

目的研究柴胡皂甙D(SSD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖、转分化以及TGF-β1/果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白家族(Smads)信号通路的影响。方法体外培养HELF,设立正常对照组、 1 ng/mL TGF-β1处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合0.5μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合1μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合2μmol/L SSD处理组。采用CCK-8法检测HELF的增殖情况,荧光定量PCR法检测Smad2、 Smad3、 Smad7的mRNA水平, Western blot法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、 1型胶原蛋白(Col1)、 Smad2、 Smad3、磷酸化的Smad2(p-Smad2)、 p-Smad3、 Smad7的蛋白水平。结果与正常对照组比较, TGF-β1处理组细胞增殖明显, Col1、α-SMA蛋白水平增加, Smad2和Smad3 mRNA和蛋白磷酸化水平显著增加, Smad7 mRNA和蛋白水平显著降低;与TGF-β1处理组比较,不同浓度SSD处理组细胞增殖降低,可逆转以上各指标的改变,呈一定的量效关系。结论 SSD通过调控TGF-β1/Smads信号通路,发挥抗肺纤维化的作用。     

HMGB1RNAi抑制TGF-β1诱导的A549细胞系EMT

目的探讨HMGB1在肺泡上皮细胞间质转分化中的作用。方法设计并合成针对HMGB1的小干扰RNA(siRNA),体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞系细胞-A549细胞,将细胞分为4组:1)对照组,2)TGF-β1刺激组,3)RNAi组(TGF-β1+HMGB1 siRNA),4)RNAi阴性对照组(TGF-β1+siRNA阴性对照);倒置相差显微镜观察细胞形态学;RT-PCR法检测HMGB1和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达;Western blot法检测α-SMA和HMGB1蛋白表达。结果 TGF-β1刺激组细胞HMGB1和α-SMA的mRNA和蛋白表达均较对照组显著增加(P0.01);RNAi组HMGB1、α-SMA mRNA和蛋白表达均较正常对照组显著下降(P0.01)。结论 HMGB1可能参与了TGFβ1诱导的肺泡上皮细胞转分化。     

慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化

目的:构建携带线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因的慢病毒载体,并探讨Mfn2过表达对大鼠肝星状细胞活化的抑制作用及其减少肝纤维化相关因子生成的机制。方法:构建含Mfn2的慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP,转染肝星状细胞;荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达及转染效率;RT-qPCR和Western blot法检测转染后细胞中Mfn2的mRNA和蛋白表达水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、α-SMA、TGF-β1、Smad2和Smad3的水平;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白水平。结果:与各对照组相比,慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染后,细胞促凋亡蛋白表达增多,TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad和p-Smad3的蛋白水平均降低,纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平降低(P0.01)。结论:转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP在体外可有效抑制肝星状细胞活化,并可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝纤维化相关因子的生成。     

Apelin抑制TGF-β诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换

目的探讨多肽Apelin对转化生长因子β(TGF-β)诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换(EMT)的抑制作用及其机制。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞,分别给予含TGF-β1(2μg/L)和/或不同浓度Apelin-13的培养基孵育细胞48 h,设立6个实验组(每组n=5):对照组、TGF-β组、TGF-β+Apelin(10-8,10-7和10-6mol/L)组和Apelin(10-6mol/L)组。刺激结束后,用免疫荧光染色观察细胞的上皮标志物E-钙黏素(E-cadherin)、间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的分布和表达。Western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA及Smads信号通路的主要信号分子p-Smad2/3、Smad2/3和Smad-7的蛋白表达。RT-PCR法检测细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)及细胞自身Apelin和APJ受体的mRNA表达量。结果与对照组相比TGF-β组细胞为长梭形,E-cadherin的表达减少,α-SMA的表达增多,细胞外基质FN和Col-Ⅰ的mRNA表达量也显著升高;TGF-β+Apelin组上述效应被显著抑制,且呈浓度依赖性。与TGF-β组相比,TGF-β+Apelin组细胞活化型Smads的水平降低(P0.05),Smad7的表达增加(P0.05)。TGF-β组细胞自身APJ受体的表达量显著升高(P0.05),TGF-β+Apelin组上述效应受到抑制,且呈浓度依赖性。结论 Apelin干扰TGF-β/Smads信号通路从而抑制肾小管上皮细胞EMT;肾小管上皮细胞自身Apelin/APJ系统可能起到一定的代偿作用。     

ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响

目的： 观察丹参素对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)Smad信号转导通路的影响。方法：体外分离、培养大鼠肝HSCs,用不同浓度丹参素作用于HSCs,检测丹参素对HSCs增殖和TGF-β1刺激后HSCs增殖的影响;观察丹参素对TGF-β1刺激HSCs表达α-SMA的影响;观察HSCs转化生长因子受体(TβRⅠ、Ⅱ)的表达;观察丹参素和TGF-β1作用HSCs后,其Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化。结果：(1)丹参素在0.0625 mmol/L-1 mmol/L时,对HSCs的生长增殖具有抑制作用 (P<0.05);丹参素对TGF-β1诱导的HSCs增殖也具有明显的抑制作用 (P<0.05)。(2)丹参素0.25 mmol/ L作用HSCs能下调α-SMA的表达(P<0.05),也能下调TGF-β1诱导的HSCs的α-SMA表达(P<0.05)。（3）HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达定位于细胞膜上,丹参素能下调活化HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达（P<0.05或P<0.01）。 (4) TGF-β1促进HSCs中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达（P<0.01）;丹参素能下调TGF-β1诱导的HSCs内Smad2、Smad3 mRNA的表达(P<0.05),并能上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。 结论：体外细胞实验表明,丹参素能通过下调活化HSCs细胞膜上TβRⅠ、Ⅱ蛋白的表达来抑制HSCs的活化增殖。丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA表达,抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。     

RAD51相关蛋白1在宫颈癌组织中的表达及通过TGF-β/Smad 通路 参与调控人宫颈癌细胞的增殖和凋亡*

目的：探讨RAD51相关蛋白1（RAD51AP1）通过调节转化生长因子β（TGF-β）/Smad 信号通路对人宫颈 癌细胞（SiHa）增殖和凋亡的影响。方法：收集2018 年7 月至2021 年3 月间南阳市中心医院51 例宫颈癌组织与 癌旁组织标本,免疫组织化学法检测宫颈癌组织RAD51AP1蛋白表达。筛选RAD51AP1高表达宫颈癌细胞系, 体外培养SiHa 细胞,分为对照组、si-RAD51AP1 组（ 转染si-RAD51AP1 质粒）、si-NC 组（ 转染si-NC 质粒）、 抑制剂组（TGF-β/Smad 通路抑制剂LY2109761）、si-RAD51AP1+ 激活剂组（ 转染si-RAD51AP1 质粒+TGF-β/ Smad 通路激活剂人重组TGF-β1）。采用MTT法与平板克隆形成实验检测各组SiHa 细胞增殖;流式细胞术检测 细胞凋亡;实时荧光定量PCR法检测细胞中RAD51AP1、TGF-β1 mRNA 水平;免疫印迹检测细胞中RAD51AP1 蛋白、TGF-β/Smad 通路相关蛋白及增殖、凋亡相关蛋白表达。结果：RAD51AP1在宫颈癌组织与SiHa 细胞系中 均显著高表达;抑制RAD51AP1表达或抑制TGF-β/Smad 通路后,细胞增殖活性、细胞克隆形成率及cyclin D1、 TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3 蛋白表达水平显著减低,细胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3 蛋白 表达水平显著升高,而抑制RAD51AP1表达基础上使用TGF-β/Smad 通路激活剂后,可部分逆转上述变化。结 论：RAD51AP1在宫颈癌中表达上调,抑制RAD51AP1表达可通过抑制TGF-β/Smad 通路而抑制宫颈癌细胞增殖, 促进细胞凋亡。     

柚皮素通过抑制TGF-β1/smad信号传导通路缓解糖尿病肾病大鼠肾损伤

目的探讨柚皮素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其对TGF-β1/smad信号传导通路的影响。方法将糖尿病肾病模型大鼠随机分为糖尿病肾病组和糖尿病肾病+柚皮素组,用药治疗6周。检测大鼠24 h尿蛋白定量、肌酐清除率和肾脏指数;HE染色观察肾组织形态和检测肾小球面积;实时荧光定量PCR检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的表达;Western blot检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、smad7、总smad2和磷酸化smad2蛋白。结果糖尿病肾病组大鼠24 h尿蛋白(P0.01)和肾脏指数(P0.01)显著升高,肌酐清除率明显下降(P0.01),肾小球明显肥大(P0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量均升高,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均升高,smad7蛋白表达量降低;经柚皮素50 mg/kg治疗后能明显降低糖尿病肾病大鼠的24 h尿蛋白(P0.01)和肾脏指数(P0.05),提高肌酐清除率(P0.05),减轻肾小球肥大(P0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量降低,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均降低,smad7蛋白表达量升高。结论柚皮素可能通过调控糖尿病肾病肾组织TGF-β1/smad信号通路表达,减轻肾脏病理损害。     

转染Smad 2基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变

目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染Smad 2基因,观察转染的阳性细胞克隆纤连蛋白(FN)及Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的改变,以探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导通路引起细胞外基质积聚导致肾小球硬化发生的分子机制.方法经磷酸钙介导将含有Smad 2重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及Western印迹分析法鉴定,又分别采用Western印迹分析法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染阳性细胞克隆FN及ColⅣ表达的改变.结果成功建立高表达Smad 2蛋白的阳性MsC克隆(T-12、T-31、T-35、T-40),并证实其FN及ColⅣ的mRNA和蛋白的表达水平均明显上调.阳性MsC克隆FN蛋白为对照组2.4倍(P<0.05),mRNA为对照组的2.7倍(P<0.05);阳性MsC克隆ColⅣ蛋白为对照组2.9 倍(P<0.01);mRNA为对照组的3.3倍(P<0.01 ). 结论 TGF-β/Smad信号转导途径中的Smad 2可能是促进FN及ColⅣ在肾小球中积聚,是导致肾小球硬化发生的重要信号转导分子.     

BMSCs调节TGF-β1/Smad通路对肝硬化大鼠免疫调节功能的作用研究

目的：探究BMSCs调节TGF-β1/Smad通路对肝硬化大鼠免疫调节功能的作用。方法：36只大鼠随机分为对照组、模型组和BMSCs组,每组12只。模型组和BMSCs组大鼠通过四氯化碳构建肝纤维化模型,BMSCs组大鼠尾静脉注射BMSCs(3×10~6个)。检测各组大鼠肝功能指标,HE和Masson染色检测肝组织损伤和纤维化情况,流式细胞术检测外周血中Th17细胞和Treg比例。Western blot、RT-qPCR检测胶原蛋白(Col)Ⅰ、ColⅢ、TGF-β1和Smad水平。结果：模型组大鼠ALT、AST、纤维化水平、肝组织ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1和Smad mRNA和蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。BMSCs组ALT、AST、纤维化水平、肝组织ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1和Smad mRNA和蛋白水平显著低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠Th17细胞占比和Th17/Treg显著高于对照组,Treg水平显著低于对照组(P<0.05)。BMSCs组Th17水平和Th17/Treg显著低于模型组,Treg水平显著高于模型组(P<0.05...     

大黄素抑制肺成纤维细胞增殖及转分化和胶原蛋白合成

目的探讨大黄素对肺成纤维细胞增殖、向肌纤维母细胞转化、胶原合成的影响及相关机制。方法用二甲基亚砜(DMSO)和(0、10、20、40、80、160)μmol/L大黄素处理MRC-5人胚肺成纤维细胞24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖。根据细胞增殖实验结果,以DMSO及(40、80)μmol/L大黄素分别培养MRC-5细胞48 h后,采用荧光实时定量PCR检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)、含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶1(ADAMTS-1)、1型胶原蛋白(Col1)、Col3 mRNA表达水平;Western blot法检测上述分子的蛋白水平。结果 MRC-5细胞增殖抑制率随着大黄素浓度的增加和处理时间的延长而逐渐增高。在处理48 h后,与对照组相比,(40、80)μmol/L大黄素处理组α-SMA、TGF-β1、Col1、Col3 mRNA与蛋白表达水平均降低,而ADAMTS-1 mRNA与蛋白水平升高;与40μmol/L大黄素处理组比较,80μmol/L大黄素处理组α-SMA、TGF-β1、Col1、Col3 mRNA与蛋白表达进一步下调,ADAMTS-1 mRNA与蛋白表达进一步上调。结论大黄素可抑制肺成纤维细胞增殖及其向肌纤维母细胞转化,并通过抑制TGF-β1/ADAMTS-1信号通路减少Col1、Col3合成。     

c-SKI对冠脉内皮细胞增殖及内皮-间充质转化的影响

目的:探讨核蛋白c-SKI对冠状动脉内皮细胞增殖能力及内皮-间充质转化的影响。方法:使用不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1)作用人冠脉内皮细胞不同时点,Western blot法检测各组细胞中c-SKI、间充质细胞标志物波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及内皮细胞标志物E-钙黏蛋白的表达。使用携带c-ski基因的慢病毒转染冠脉内皮细胞后采用RT-qPCR验证转染效率。将细胞分为4组:对照组、TGF-β1(5μg/L)组、c-ski基因感染+TGF-β1组及对照病毒感染+TGF-β1组。过表达c-SKI后,MTT实验和集落形成实验检测冠脉内皮细胞的增殖能力,Western blot检测波形蛋白、α-SMA、E-钙黏蛋白、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3蛋白的水平。结果:TGF-β1处理冠脉内皮细胞后,c-SKI在冠脉内皮细胞中的表达呈剂量和时间依赖性下降(P0.01)。MTT及集落形成实验结果显示,过表达c-SKI可显著抑制冠脉内皮细胞增殖(P0.01)。Western blot检测结果显示,与病毒对照组相比,过表达c-SKI可显著下调冠脉内皮细胞中α-SMA和波形蛋白的表达量(P0.01),上调E-钙黏蛋白的表达量(P0.01),同时抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化(P0.01),逆转TGF-β1诱导的内皮-间充质转化。结论:内皮-间充质转化过程中c-SKI表达下调,而过表达c-SKI能够抑制冠脉内皮细胞增殖及内皮-间充质转化,其机制可能与调控TGF-β1/Smad信号通路活性有关。     

白细胞介素-34/集落刺激因子-1R在转化生长因子-β1诱导A549细胞上皮-间质转化中的表达

目的探讨白细胞介素-34/集落刺激因子-1受体(IL-34/CSF-1R)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导A549细胞发生上皮-间质转化(EMT)中的表达。方法体外培养A549细胞;CCK 8法检测不同浓度TGF-β1在不同时间点对A549细胞增殖的影响;选用5μg/L TGF-β1刺激A549细胞(0、12、24、48h),提取细胞蛋白和RNA,Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏连蛋白(E-Cad)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白的变化;Real-time PCR法检测IL-34、CSF-1R、MMP-2、MMP-9基因表达的变化。结果 TGF-β1对A549细胞的增殖无明显影响(P0.05)。TGF-β1刺激A549细胞后,间质细胞标志性蛋白α-SMA表达升高,上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达下降,纤维化相关的MMP-2蛋白表达升高,MMP-9蛋白表达先升高后下降,TIMP-1蛋白早期出现短暂性增高后,呈持续降低趋势(P0.01)。IL-34mRNA表达逐渐升高,CSF-1R mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达先升高后下降(P0.01)。结论 TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程中,存在IL-34/CSF-1R的动态表达。     

敲除Dock180抑制大鼠H9C2心肌细胞系增殖和促凋亡

目的探讨敲除细胞质移动蛋白1(Dock180)对大鼠H9C2心肌细胞系增殖和凋亡的影响及其机制。方法用CRISPR/Cas9系统构建single guide RNA(sgRNA)Dock180质粒,并将其包装成敲除Dock180重组慢病毒再进行筛选,建立敲除Dock180的H9C2心肌细胞稳定株。实验分为A:阴性慢病毒组(Cas9)、B:敲除Dock180组、C:阴性慢病毒低氧组、D:敲除Dock180低氧组。RT-PCR检测各组细胞Dock180 mRNA表达水平,Western blot检测相关蛋白的表达水平,MTT检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 B组和D组Dock180 mRNA和蛋白无表达;分别较A组和C组,B组和D组p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低(P0.01),Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01);较A组,C组Dock180 mRNA和蛋白表达降低,p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低,Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01);较B组、D组p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低,Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01)。结论敲除Dock180可抑制H9C2心肌细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用可能通过p-ERK1/2、Bax和Bcl-2分子介导。     

脂多糖刺激巨噬细胞获得的外泌体促进TGF-β1诱导的人A549细胞上皮间质转化

目的探索炎性环境下巨噬细胞来源外泌体对转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的肺脏上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用透射电镜鉴定外泌体形态, Western blot法检测外泌体特异性标志物肿瘤易感基因101(TSG101)、附属蛋白质凋亡关联基因α相互作用蛋白X(ALIX)、 CD81、 CD9蛋白及外泌体不含有的钙连蛋白(calnexin)对THP-1巨噬细胞来源的外泌体进行鉴定。利用TGF-β1诱导肺泡上皮A549细胞发生EMT,比较脂多糖(LPS)刺激和未刺激THP-1细胞来源外泌体对A549细胞间质化特征的影响。结果成功建立TGF-β1诱导A549细胞发生EMT模型和获得THP-1巨噬细胞来源的外泌体。与未经LPS处理巨噬细胞来源外泌体比较, LPS刺激THP-1细胞来源的外泌体能显著促进TGF-β1诱导A549细胞EMT,包括显著下调上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平,上调波形蛋白(vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1/SMAD家族成员2/3(Smad2/3)通路Smad2/3蛋白和磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)和1型胶原蛋白(Col1)等细胞间质化相关的信号蛋白表达。结论 LPS刺激巨噬细胞来源的外泌体通过激活TGF-β/Smad2/3信号,上调A549细胞中vimentin、α-SMA和Col1等细胞间质化相关蛋白的表达,促进A549细胞发生EMT。