NK细胞研究的几个热点问题

田志刚，男，４２岁，研究员，博士，博士生导师，山东省医学科学院基础医学研究所所长，山东肿瘤生物治疗中心主任，中国免疫学会理事，《中国免疫学杂志》编委，主要从事免疫学及分子生物学研究。１ＮＫ细胞研究的沿革７０年代初ＮＣＩ的研究人员在研究Ｔ细胞对靶细胞的...     

HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究HSP70-TKD诱导的自然杀伤细胞(NK)对胰腺癌原位移植模型的体内抗肿瘤作用。方法:用干细胞培养基富集人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10天时,加入2μg/ml TKD,4 d后用流式细胞仪检测诱导后NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达情况,MTT法测定诱导后NK细胞体外对细胞表面HSP70表达阳性的胰腺癌Colo357细胞的杀伤活性。在BALB/c裸鼠胰腺原位接种胰腺癌Colo357细胞至第15天时,尾静脉注射HSP70-TKD诱导的NK细胞,观察NK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。免疫组化染色检测NK细胞在胰腺癌组织的浸润情况。结果:NK细胞在干细胞培养基中可大量增殖,14 d时平均细胞纯度为(87.50±1.35)%。HSP70-TKD诱导的NK细胞其细胞表面CD94/NKG2C的表达明显增加,其平均荧光强度为(220.56±6.82),高于未诱导组的(68.72±1.85)。HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞Colo357有更强的杀伤活性,当效靶比为40∶1时杀伤率高达(68.72±2.55)%。体内实验表明,TKD诱导的NK细胞能显著抑制胰腺癌的生长,其抑瘤率可达(61.3±1.5)%,与对照组差异显著(P0.01)。免疫组化染色表明IL-2和TKD同时诱导的NK细胞更易向胰腺癌组织浸润。结论:HSP70-TKD诱导的NK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞,具有较强的体外抗细胞表面HSP70表达阳性的胰腺癌细胞活性,具有明显的抑制胰腺肿瘤生长的作用。     

异种HSP70及固相抗体法体外扩增人γδT细胞的比较

目的：比较异种HSP70及固相抗体法体外扩增人γδT细胞。方法：分别用固相抗体法、HSP70BCG及小鼠榄香烯复合瘤苗热休克蛋白70-肽复合物(HSP70m-肽复合物)体外扩增人PBMCs的γδT细胞，流式细胞仪检测细胞表型及亚型分布，RT-PCR检测各亚型基因的取用。MTT检测γδT细胞的细胞毒作用。结果：培养14天后，抗体法扩增的PMBCs总数增加30～40倍，御细胞的比率由3.2％提高到86．7％；HSP70BCG组PBMCs总数增加7—8倍，7趼细胞的比率由3．2％提高到71．32％；HSP70m-肽复合物组PBMCs总数增加4～5倍，γδT细胞的比率由3.2％提高到27.26％。抗体及HSP70BCG扩增的γδT细胞以表达Vγ9/Vδ2亚型为主，且Vδ1、Vδ2、Vδ3三种基因均得到取用，对Daudi具较高的杀伤活性。结论：抗体及HSP70BCG均能扩增出高纯度的γδT细胞，且具有完整的受体库，扩增的γδT细胞具细胞毒活性。     

体外构建的HSP70—肝癌抗原肽诱导抗原肽特异性免疫反应

目的：研究体外构建的HSP70-肝癌抗原肽复合物诱导针对肝癌的特异性免疫反应能力,为该复合物的临床应用奠定基础。方法：在体外构建HSP70-肝癌抗原肽复合物,联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4-（IL-4）直接从志愿者外周血中培养出DC;以HSP70、HSP70-肝癌抗原肽、抗原肽分别刺激DC,DC激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,检测其杀伤72细胞和肝癌细胞系的能力。结果：HSP70-肝癌抗、抗原肽均可诱导CD8^ 的抗原肽特异性CTL,而前者的诱导效果更强。结论：体外构建的HSP70-抗原肽复合物具有免疫原性,HSP70可以增强抗原肽诱导特异性免疫反应的能力,HSP70-抗原肽复合物有可能作为肽疫苗用于临床肿瘤免疫治疗。     

运动应激诱导HSP70表达与心肌缺血再灌注

尽 早恢复血流供应是挽救缺血心肌的根本途径 ,早在5 0年代就有人注意到再灌注所带来的损伤现象。随介入心脏学的广泛开展 ,再灌注损伤日益受到人们重视。许多科学工作者已在这方面做了大量的工作 ,尝试了许多药物 ,如 β受体阻滞剂、自由基清除剂等。由于再灌注损伤机制极其复杂 ,牵涉很多 ,疗效都不够理想。在这种情况下 ,人们就想寻找一种内源性的心肌保护途径 ,即激发心肌提高自身的防护能力。因生物界广泛存在的热休克蛋白(heatshockproteins ,HSPs)及其特殊的抗损伤能力引起科学家的注意 ,从而发现加强HSPs表达的诱导是一种很有前…     

HSP70与肿瘤相关性的研究进展

HSP70是HSP家族中最重要最保守的一类,不仅能够有效维持细胞结构的稳定以及提高细胞对应激原的耐受性,还参与了肿瘤细胞的发生、生长以及凋亡,与肿瘤免疫也有很大的相关性.目前,HSP70在临床上已开始应用于肿瘤的免疫治疗与基因治疗,并取得了一定的成效.本文就近年来HSP70与肿瘤相关性的研究展开综述.     

基质刚度调节细胞-细胞外基质间黏附对肿瘤细胞迁移影响的模型研究

目的 研究细胞外基质(extracellular matrix,ECM)刚度对细胞和ECM间黏附及肿瘤迁移的影响.方法 建立基于网状波茨模型(cellular Potts model,CPM),模拟肿瘤细胞生长与细胞间免疫反馈过程,观察细胞力学行为改变对细胞-ECM黏附的影响状况,分析不同ECM下肿瘤细胞迁移的变化.结...     

神经肽P物质对小鼠脾NK细胞迁移及趋化因子受体表达的影响

探讨神经肽P物质(substance P,SP)对小鼠NK细胞迁移能力和趋化因子受体表达的影响,揭示SP对NK细胞迁移功能的调节作用。采用Transwell法检测SP对C57BL/6小鼠脾NK细胞迁移活性的影响;实时荧光定量PCR检测趋化因子受体(CCR5、CXCR4)的mRNA表达水平;流式细胞术检测趋化因子受体(CCR5、CXCR4)的膜表达水平。结果显示,选用10~(-14)～10~(-6)mol/L SP处理小鼠脾NK细胞,在较低浓度范围内,NK细胞迁移作用随着SP浓度的升高而增强;在较高浓度范围内,NK细胞迁移作用随着SP浓度的升高而回落至基础水平。在所选浓度范围内,SP均可增加CCR5 mRNA和CXCR4 mRNA表达;受较低浓度SP刺激后,CCR5和CXCR4表达阳性细胞数随SP浓度升高而逐渐增加,而受较高浓度SP刺激后,CCR5和CXCR4表达阳性细胞数随SP浓度升高而逐渐回降,该趋势与SP促进NK细胞趋化活性的作用趋势基本一致。这些结果提示SP对NK细胞具有直接趋化作用,且SP对某些趋化因子受体的表达有一定的调节作用,这些趋化因子受体的表达可能参与了SP对NK细胞迁移活动的调控。     

热休克蛋白70在诱导肿瘤免疫中的效应

目的：研究不同剂量的热休克蛋白70（HSP70）对诱导小鼠抗肿瘤免疫效应及耐受的机理。方法：不同剂量的纯化HSP70免疫小鼠后2周再接种HcaF肿瘤细胞，观察实验组与对照组肿瘤形成的情况，结果：10μgHSP70免疫后的小鼠100％获长期生存，肿瘤全部消退；5μgHSP70免疫组可见部分抗肿瘤效应，而20μg、40μg及60μgHSP70不能抑制肿瘤形成，这3组小鼠肿瘤形成的指标与对照组无差别，结论：HSP70作为肿瘤抗原在诱导抗肿瘤免疫中具有双重性，可能与其活化T细胞的方式有关，该发现对于研究应用HSP70治疗人类恶性肿瘤时注意使用注意防止不适宜的剂量引起负效应有参考意义。     

A 14-mer peptide from HSP70 protein is the critical epitope which enhances NK activity against tumor cells in vivo

Heat shock protein 70 (Hsp70) has been found to play key roles in tumor immunity due its chaperone function of binding antigenic peptides. Here we report it can also stimulate NK cells in vivo, which is another role in Hsp70s' anti-tumor response. Injecting Hsp70 into mice increased splenic NK cell populations, which may be reason for anti-tumor effect of Hsp70. The Hsp70 14-mer peptide (aa450-463, TRD) was identified as the critical epitope for this stimulatory activity. It was the murine Hsp70 14-mer peptide TRD instead of the corresponding human Hsp70 14-mer peptide TKD that functioned in the mouse experimental model.     

汉坦病毒诱导人脐静脉内皮细胞HSP70的表达及意义

目的: 研究人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)感染汉坦病毒(Hantavirus, HTV)后应激反应的规律及意义。方法: 采用免疫细胞化学染色法和核酸分子原位杂交, 检测热休克蛋白 70(HSP70)的表达; 用RT --PCR观察HSP70mRNA水平变化的规律。结果: HTV感染HUVEC后, 免疫细胞化学染色法可检出HSP70呈高表达, 原位杂交发现细胞质内有HSP7mRNA的阳性信号。感染后不同时间点RT- PCR的结果表明与对照组相比较, HSP70mRNA的水平在感染后迅速升高并持续高表达 (P<0. 05 )。结论: HTV可诱导HUVEC高表达HSP70。HSP70可能具有抑制病毒复制和保护内皮细胞的作用。     

小鼠肝癌细胞膜上HSP70的表达及检测分析

应用流式细胞仪和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测了６１５ 系小鼠肝癌细胞系Ｈｃａｆ 细胞膜上ＨＳＰ７０ 的表达。结果表明Ｈｃａｆ 细胞膜上有较高的ＨＳＰ７０ 表达且具有可诱导性,推测肿瘤细胞ＨＳＰ７０ 的高表达与其生物学行为相关。应用亲合层析技术对ＨＳＰ７０ 进行了分离,对其进一步研究和应用有重要的意义。     

热休克蛋白70对H2O2诱发大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

目的:探讨热休克蛋白70(HSP₇₀)对心肌细胞凋亡的保护作用。方法:体外培养大鼠心肌细胞同时温度诱导细胞产生HSP₇₀,用过氧化氢(H₂O₂)造成心肌细胞损伤。采用免疫组化、DNALadder、流式细胞仪、细胞色素C氧化酶及琥珀酸脱氢酶比活力的测定、电镜观察等作为检测指标的方法。结果:温度诱导后HSP₇₀在胞浆中大量表达,H₂O₂损伤组与HSP₇₀保护组凋亡率(12.18±1.94,6.42±0.86,P<0.01)、细胞色素C氧化酶比活力(5.824±1.949,10.375±2.513)及琥珀酸脱氢酶比活力(0.884±0.152,1.174±0.214,P<0.01)有显著差异。电镜观察损伤组细胞膜、细胞器损伤明显,并出现凋亡小体。结论:HSP₇₀可延迟细胞凋亡,对心肌细胞具有保护作用。     

细胞外HSP70/HSP70-PCs对人肝癌HepG2细胞上皮-间充质转化的影响及机制研究

 目的：探讨细胞外热休克蛋白70(HSP70)/HSP70肽复合物(HSP70-PCs)对肝癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响和可能机制。方法：将HepG2细胞分为3组：正常对照组、HSP70/HSP70-PCs组（终浓度2 mg/L）和LY294002+HSP70/HSP70-PCs组。应用real-time RT-PCR与Western blotting法检测上皮细胞表面标志E-cadherin和间质细胞表面标志α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化,以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和缺氧诱导因子1α(HIF1-α)的表达变化。结果：细胞外HSP70/HSP70-PCs可以促进HepG2细胞EMT的发生。HepG2细胞的EMT过程伴随HIF-1α和PI3K表达增加。应用LY294002阻断PI3K后,HepG2细胞没有发生EMT,同时细胞外HSP70/HSP70-PCs上调HIF-1α表达的作用消失。结论：细胞外HSP70/HSP70-PCs可以通过PI3K/HIF-1α促进肝癌细胞发生EMT。     

热休克蛋白70诱导抗肿瘤免疫的机制研究

目的　研究肿瘤热休克蛋白 70 (HSP70 )诱导的抗肿瘤免疫产生的机制。方法　用液相色谱法提纯小鼠肿瘤细胞株中的HSP70。通过动物实验观察HSP70的抗肿瘤作用 ,并用流式细胞技术测定HSP70免疫后小鼠外周血中T细胞亚群的变化。用ELISA法测定HSP70免疫后小鼠体内细胞因子的水平。结果　用HSP70免疫后 ,小鼠外周血中CD8+T细胞及几种主要Th1型细胞因子 (IL 2、TNF α、TNF β和IFN γ)均升高 ,与对照组相比较 ,差异显著 (P <0 .0 1)。结论　HSP70免疫后 ,小鼠外周血中CD8+ T细胞及Th1型细胞因子均有明显升高。此作用可能是其诱导特异性抗肿瘤免疫的重要机制     

兔脂肪干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞（ADSCs）向髓核细胞（NPCs）分化的潜能,证实脂肪干细胞可以作为种子细胞用于组织工程髓核研究.方法 提取兔ADSCs,进行培养传代至第3代,提取培养异体兔NPCs,将第3代ADSCs与NPCs共同培养作为共同培养组,将NPCs单纯培养作为单纯培养组.倒置显微镜进行细胞观察,通过RT-PCR技术测定Ⅱ型胶原mRNA和聚集蛋白多糖mRNA,测定其在共同培养3 d、7 d、14 d、21 d的表达量,两组进行对比分析.结果 共同培养组聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达量均明显高于单纯培养组.两组聚集蛋白多糖mRNA表达量比较,t=3.436,P〈0.05;两组Ⅱ型胶原蛋白表达量比较,t=2.733,P〈0.05,差异有统计学意义.结论 ADSCs具有向NPCs 分化潜能,在适当的培养条件下与NPCs共同培养可转化为髓核样细胞,同时能够促进NPCs生长.