呼吸道合胞病毒通过TRAF6/NF⁃κB通路调控人T淋巴细胞白血病细胞增殖

目的 通过呼吸道合胞病毒(RSV)感染人Jurkat细胞(T淋巴细胞白血病细胞),观察Jurkat细胞增殖及凋亡情况,探讨RSV是否对Jurkat细胞具有溶瘤作用及可能机制.方法 将RSV感染Jurkat细胞,设未感染RSV的Jurkat细胞为空白对照组(con),在感染后不同时间点(3、6、12、24、48 h)收集...     

乌司他丁对急性肺损伤大鼠肺组织高迁移率族蛋白B1表达的影响

【目的】探讨乌司他丁对急性肺损伤（acute lung injury,ALI）大鼠肺组织高迁移率族蛋白B1（HMGBl）表达的影响。【方法】采用腹腔注射脂多糖（LPS）制备Au动物模型。90只雄性SD大鼠,随机分为正常对照组（n=10）、ALI组（n=40）和乌司他丁（Ulinastatin,UTI）干预组（UTI组,n=40）,建模后6h、12h、24h、48h处死,光镜观察肺组织病理变化,检测肺含水分数、动脉血气分析,采用实时荧光定量聚合酶链反应（tealtime-PCR）法检测肺组织HMGB1mRNA的表达水平,酶联免疫吸附法（ELISA）检测肺组织匀浆中HMGB1表达水平。【结果】与正常对照组比较,ALI组大鼠肺组织呈局灶性肺不张及肺水肿表现,伴有炎性细胞浸润,肺含水分数明显增加,PaO2进行性下降,肺组织HMGB1表达水平均升高;与ALI组相比较,UTI组肺组织炎症减轻,肺含水分数下降,PaO2明显上升,肺组织HMGB1表达水平明显下降。【结论】乌司他丁能够下调肺组织HMGB1表达,减轻脂多糖诱导的ALI。     

婴幼儿呼吸道合胞病毒和人鼻病毒急性下呼吸道感染临床特征及随访研究

目的：比较婴幼儿呼吸道合胞病毒（RSV）和人鼻病毒（HRV）急性下呼吸道感染的临床特征,探讨婴幼儿期RSV急性下呼吸道感染患儿后期哮喘和反复喘息的发生与HRV感染患儿是否存在差异。方法采用 RT-PCR 或 PCR 方法检测住院患儿咽拭子或鼻咽吸取物中常见的呼吸道感染病毒,选取单一RSV和HRV感染病例,回顾性比较两组患者的临床特征并进行随访。结果 RSV感染组纳入病例80例, HRV感染组纳入32例。两组患儿的临床特征相似,但RSV感染组患儿年龄偏小（P＝0.004）,有喘息表现者明显多于 HRV 感染组（P＝0.000）。在与哮喘和反复喘息发生的关系上,两组间的差异无统计学意义（P值均为1.000）。结论婴幼儿RSV和HRV急性下呼吸道感染的临床特征相似,但在平均年龄、临床喘息的发生率等方面存在统计学差异。未发现婴幼儿期 RSV 感染患儿后期哮喘和反复喘息的发生与HRV感染患儿间存在差异。     

黄芩苷抗呼吸道合胞病毒感染作用的体外研究

目的探讨黄芩苷（baicalin）的体外抗呼吸道合胞病毒（RSV）感染作用及最佳浓度。方法应用微量细胞培养技术，观察RSV感染人喉癌（Hep-2）细胞病变效应（CPE）。观察不同浓度黄芩苷对人肺癌腺上皮（A549）细胞的CPE及RSV感染后CPE的抑制作用。应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测黄芩苷对A549细胞的毒性作用和RSV感染后细胞存活率的影响。结果黄芩苷浓度≤0．156mg／ml时，A549细胞未显示明显CPE，MTT比色法结果与CPE观察结果相符；浓度在0．078～1．25mg／ml时，RSV感染的A549细胞仅出现轻微CPE，0．625mg／ml时对CPE有最好的保护作用；治疗指数（Ⅱ）为19．23；MTT比色法也显示以上浓度范围黄芩苷组的细胞存活率明显高于RSV感染组，差异有统计学意义（P均〈0．05），其中以0．3125mg/ml组的细胞存活率最高，达82．09％。结论黄芩苷具有体外抗RSV感染作用，有效浓度为0．078～1．25mg／ml，最佳作用浓度为0．156mg／ml。     

直接免疫荧光法检测儿童多种呼吸道病毒抗原的临床应用

目的探索一种高效、快速检测呼吸道病毒抗原的方法,为儿童呼吸道病毒感染诊断提供帮助。方法采用直接免疫荧光法D3 UhraTMDFA试剂盒,对400例住院呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中合胞病毒（RSV）、副流感病毒（pinf-1,pinf-2,pinf-3）、流感病毒（inf-A,inf-B）、腺病毒3（ADV3）抗原进行检测。结果（1）在400例呼吸道感染患儿,呼吸道病毒抗原阳性者140例,阳性检出率为35％。其中RSV78例（55．7％）、ADV6例（4．3％）、pinf-12例（1．4％）、pinf-22例（1．4％）、pinf-34例（2．9％）、inf-A28例（20．O％）、inf-B14例（10．0％）、混合型6例（4．3％）;（2）冬季是最易好发季节;（3）〈3岁的患儿病毒检出率最高。结论（1）直接免疫荧光法是一种高效、快速检测呼吸道病毒抗原的方法,适合基层医院普及。（2）运用D3Ultra TMDFA试剂,直接免疫荧光法,可同时检测多种呼吸道病毒抗原,灵敏度高。     

呼吸道合胞病毒对大鼠原代气道上皮细胞表达胸腺基质淋巴细胞生成素的影响

目的:探讨分离和培养大鼠原代气道上皮细胞(primary rat airway epithelial cell,PRAEC)的方法,研究呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)对PRAEC表达胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)的影响.方法:采用改良的酶消化法分离PRAEC,并在专用的支气管上皮培养基中培养.在培养成功的原代细胞中加入RSV以感染PRAEC.应用Real-time PCR检测正常的和受到RSV感染的PRAEC中TSLP基因表达.结果:获得纯度较高(约为97%)的PRAEC,细胞成活率为90%,获得细胞量为(1.02 ±0.33)×106个细胞/鼠.且存活时间较长.正常PRAEC表达少量的TSLP,但是在受到RSV感染后其TSLP表达出现增高.且TSLP的表达在一定范围内与RSV的滴度成正相关.结论:本实验成功地分离并培养了PRAEC.在此基础上进行的实验证实了RSV感染确实能够促进气道上皮细胞表达TSLP,为进一步研究RSV感染在哮喘发病中的作用机制奠定了基础.     

痰热清对呼吸道合胞病毒感染人支气管上皮细胞分泌胸腺基质淋巴细胞生成素作用的体外研究

目的探讨痰热清对体外呼吸道合胞病毒(RSV)感染人支气管上皮细胞(NHBE)分泌胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的影响。方法用Hep-2细胞扩增病毒,并进行毒力鉴定。建立RSV感染NHBE体外细胞模型。酶联免疫吸附(ELISA)法检测RSV感染NHBE后TSLP水平。将痰热清以不同给药方式(预防给药、直接灭活、治疗给药方式)干预RSV感染NHBE,ELISA法检测TSLP水平变化。结果实时荧光定量RT-PCR方法鉴定细胞模型建立成功。(1)RSV对NHBE分泌TSLP的影响:相同感染时间内(12h、24h、48h、72h、96h、120h),随着感染滴度增加(10TCID50、50TCID50、100TCID50、500TCID50、1000TCID50),各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势,与正常细胞对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。相同感染滴度内(10TCID50、50TCID50、100TCID50、500TCID50、1000TCID50),随着感染时间增加(24h、48h、72h、96h、120h),各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势,与12h组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。(2)痰热清对RSV感染NH-BE分泌TSLP的影响:在12h、24h、48h、72h给药时间内,痰热清、利巴韦林的不同给药方式与病毒对照组比较,均下调TSLP水平(P<0.05),以预防给药方式最为明显。预防给药方式下,痰热清组较利巴韦林组下调TSLP的作用更明显(P<0.05)。结论 RSV能诱导NHBE分泌TSLP,痰热清可抑制RSV引起的TSLP分泌增加,以预防方式给药明显,痰热清可在病毒感染的控制中起到重要作用。     

儿童呼吸道病毒感染的流行病研究

目的 进行2008年1月-2010年11月大连地区儿童呼吸道病毒感染的流行病调查,为临床提供相应的诊断和治疗依据.方法 确诊呼吸道感染的患儿抽取血清,采用ELISA法检测呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（ADV）、流感病毒（FLV）、副流感病毒（PFV）、EB病毒（EBV）、柯萨奇病毒（COX）、巨细胞病毒（CMV）、埃可病毒（ECHO）的IgM抗体.结果 抗体总阳性率为34.60%,其中RSV占首位,其次为ADV、PFV,其他病毒均为散发,阳性率较低.混合感染35例,多为RSV与其他病毒混合感染.以毛细支气管炎病毒感染阳性率最高,不同年龄组中1-6月婴幼儿病毒阳性率最高,各季节中以冬季阳性率最高,女性阳性率显著高于男性.结论 儿童呼吸道病毒感染以RSV为主.病毒阳性率与呼吸道疾病类型、年龄、发病季节、性别均有关.     

病毒唑抑制呼吸道合胞病毒的实验研究

目的：研究病毒唑（三氮唑核苷）在细胞培养中抑制呼吸道合胞病毒（RSV）的作用。方法：用细胞培养法,采用Vero细胞感染病毒后2h给药法、观察细胞病变（CPE）。结果：当病毒感染最小于或第于100TCID50时,病毒唑组无CPE,而病毒对照组有25％－75％的CPE。病毒唑抑制RSV的最大无毒浓度（TD0）,半数有效浓度（IC50）,最小有效浓度（MTC）和治疗指数（TI）分别为100、50、25μg/ml和4。结论病毒唑在细菌培养中确有显抑制RSV的作用,这为春治疗RSV感染提供了实验依据。     

呼吸道合胞病毒与成人支气管哮喘急性发作的相关性研究

目的：探讨呼吸道合胞病毒（RSV）与成人支气管哮喘急性发作的关系。方法：对162例哮喘急性发作期患者进行血清RSV抗体lgM（ELISA法）检测，并对RSV-IgM阳性组、RSV-IgM阴性组进行哮喘急性发作时病情严重程度分级。结果：68例患者血清RSV-IgM阳性；RSV-IgM阳性组中，重度、危重患者比例明显高于RSV-IgM阴性组数值，具有显著性差异。结论：支气管哮喘急性发作与呼吸道合胞病毒感染密切相关，其相关机理，可能与HSV感染后气道上皮损伤、免疫学机制、神经调节机制有关。     

Productive infection of isolated human alveolar macrophages by respiratory syncytial virus.

Respiratory syncytial virus (RSV) is a significant cause of lower respiratory tract disease in children and individuals with cell-mediated immunodeficiencies. Airway epithelial cells may be infected with RSV, but it is unknown whether other cells within the lung permit viral replication. We studied whether human alveolar macrophages supported RSV replication in vitro. Alveolar macrophages exposed to RSV demonstrated expression of RSV fusion gene, which increased in a time-dependent manner and correlated with RSV protein expression. RSV-exposed alveolar macrophages produced and released infectious virus into supernatants for at least 25 d after infection. Viral production per alveolar macrophage declined from 0.053 plaque-forming units (pfu)/cell at 24 h after infection to 0.003 pfu/cell by 10 d after infection and then gradually increased. The capability of alveolar macrophages to support prolonged RSV replication may have a role in the pulmonary response to RSV infection.     

高迁移率族蛋白B1对大鼠脾脏树突状细胞细胞因子表达的影响

目的 观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对树突状细胞(dendritic cells,DC)细胞因子蛋白合成和基因表达的影响.方法 分离正常Wistar大鼠脾脏DC后置于96孔培养板(1×105/孔),给予重组HMGB1刺激,研究HMGB1刺激与TNF-α,IL-12蛋白合成和基因表达的时间-效应关系,24孔细胞随机分为6组:正常对照24 h组(4孔/组)、正常对照48 h组(4孔/组)、正常对照72 h组(4孔/组)、HMGB1 24 h组(4孔/组)、HMGB1 48 h组(4孔/组)和HMGB1 72 h组(4孔/组),后3组分别以1 μg/mLHMGB1 刺激.刺激相应时间检测TNF-α,IL-12 mRNA的表达和蛋白水平.研究HMGB1刺激与TNF-α,IL-12蛋白合成和基因表达的剂量-效应关系,16孔细胞随机分为4组:正常对照组(4孔/组)、0.1μg/mL组(4孔/组)、1 μg/mL组(4孔/组)和10 μg/mL组(4孔/组),分别以相应剂量HMGB1刺激.刺激后48 h后检测TNF-α、IL-12 mRNA的表达和蛋白水平.应用Promega公司mRNA提取试剂盒裂解收集的DC,提取细胞mRNA.采用SYBR Green real-time(实时荧光定量)PCR技术检测TNF-α mRNA,IL-12mRNA表达水平.以三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)作为内参对照.扩增产物经Fast 7500 real-time PCR仪处理,作相对定量(RQ)分析.以ELISA试剂盒检测各组上清中IL-12,TNF-α蛋白水平.数据进行单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 1 μg/mL HMGB1 刺激后,脾脏DC IL-12,TNF-α蛋白合成和基因表达均分别于24～72 h明显上调(P<0.05或P<0.01),其中以作用48 h后其表达上调尤为显著(P<0.01);0.1/.μg/mL,1 tcVmL,10μg/mL HMGB1刺激48 h均可诱导DC IL-12、TNF-α蛋白合成和基因表达增强(P<0.01),其中HMGB1浓度在1 μg/mL时,DC IL-12和TNF-α蛋白合成和基因表达表达最明显(P<0.01).结论 HMGB1诱导DC成熟分化过程中能促进DC合成、释放IL-12和TNF-α,从而发挥其免疫调节作用.     

EV71感染横纹肌肉瘤细胞与MAPK信号通路分子基因差异表达的相关性

目的探讨肠道病毒71型(EV71)感染横纹肌肉瘤(RD)细胞后丝裂原活化蛋白激酶(MARK)信号通路分子的变化及作用机制。方法按感染复数(MOI)=5的病毒量感染RD细胞,用台盼蓝染色观察不同时间的细胞存活率,annexin V-FITC/PI染色法检测凋亡细胞形态学变化,ELISA法检测感染后不同时间细胞因子(IL-4、IL-10和TNF-α)水平变化,PCR芯片技术检测感染后8 h和12 h MAPK信号通路相关基因的差异表达情况。结果台盼蓝染色结果显示,RD细胞存活率随EV71感染时间延长明显下降,感染组IL-4、IL-10和TNF-α浓度随感染时间延长明显增加,与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。EV71感染RD细胞8 h时,88种MAPK相关基因中,FOS、JUN分别上调3.34和3.19倍,而IL-1A、IL-1B、MAP2K3、IRAK1、NGF、IL-4、MAP3K1、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K14、MAPK3下调2～5倍。EV71感染RD细胞20 h时,ELK1、FGF1、FOS、JUN、IRAK1、NGF、IL4、MAP3K1、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K14、MAPK3、PIK3CG、STAT1和TNF明显上调。结论 EV71感染激活RD细胞MAPK信号通路,产生炎症细胞因子,与细胞凋亡有关。     

Comparison of direct immunofluorescence of exfoliated cells (DIF), tissue culture immunofluorescence (TCIF) and conventional virus isolation (CVI) for the diagnosis of respiratory virus infections

Direct immunofluorescent staining (DIF) of exfoliated cells and immunofluorescent staining of infected tissue culture cells (TCIF) are superior to conventional virus isolation (CVI) techniques for the diagnosis of respiratory virus infections. Out of 197 specimens from patients with respiratory syncytial virus (RSV), influenza or parainfluenza virus, measles, adenovirus or cytomegalovirus (CMV) infections, DIF recognised 84%, TCIF 82% and CVI only 42%. DIF and TCIF were particularly useful for the diagnosis of RSV and parainfluenza virus infections, and the optimal specimen for diagnosis was nasopharyngeal aspirate.     

原发性肝癌高迁移率族蛋白B1表达改变及其机制

目的研究原发性肝癌（PHC）组织高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达改变和诱导机制,及PHC患者血清HMGB1水平变化和意义。方法对38例慢性乙肝、32例乙肝后肝硬化、23例继发性肝癌、39例PHC患者和48例健康对照者的血清HMGB1水平进行测定和分析。采用RT-PCR方法,检测11例PHC组织及其癌旁组织中的HMGB1基因表达水平。观察缺氧培养对肝癌细胞株SMMC-7721HMGB1基因表达和胞外释放的影响。结果PHC患者血清HMGB1水平（13．5±6．3μg／L）明显高于健康对照者（3．9±1．4μg／L）,并与AFP水平、TNM分期有关。PHC组织中HMGB1mRNA表达增强。SMMC-7721细胞经缺氧培养3h后,培养上清液中HMGB1含量即见升高,6h后,HMGB1mRNA表达明显增强（P〈O．01）。结论PHCHMGB1表达增强,缺氧为诱导因素。     

携带人可溶性TRAIL基因的重组腺病毒在肺癌细胞中的转染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒感染肺腺癌细胞A549的转染效率及重组腺病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(hTRAIL95-281)基因的体外表达。方法用不同感染滴度(MOI)(0-10 000 VP/cell)的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP转染A549细胞后48 h收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率,并在共聚焦荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;用MOI为5 000 VP/cell的Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞后不同时间(24 h、48 h、72 h和96 h)收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率;用重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281感染293T细胞后不同时间收集培养物用ELISA方法检测上清中的TRAIL表达。结果重组腺病毒载体对A549细胞的转染效率和绿色荧光蛋白表达在一定范围内随着MOI的增加而增高,MOI为5 000 VP/cell时转染效率达峰值,MOI为10 000 VP/cell时转染效率反而降低。重组腺病毒转染A549细胞后72 h内转染效率随时间的变化而增高,峰值为98%,96 h有所降低(P0.05)。转染重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281的293T细胞在转染后24 h表达量最高(P0.001),达到131.45 pg/ml,48 h时TRAIL蛋白表达量明显降低(P0.01),72小时也有继续降低的趋势。结论重组腺病毒在适宜的MOI值下,在A549细胞中96小时内均有较高的转染效率,且重组腺病毒介导的可溶性hTRAIL基因在体外能够有效表达。     

高迁移率族蛋白B1在失血性休克致急性肺损伤中的作用

目的 探讨高迁移率族蛋白 B1(high mobility group box1,HNGB1)在失血性休克(hemarrhag-ic shock,HS)所致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠体内的变化和意义.方法健康雄性BALB/c小鼠42只,随机分为对照组、HS致ALI组和抗HMGB1抗体干预组.心脏穿刺抽血复制小鼠HS致ALI模型,酶联免疫吸附(ELISA)法检测肺组织IL-1β,TNF-α,Westemblot检测肺组织HMGB1,比色法检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)、伊文蓝(EBD),观察肺脏病理变化.统计学采用方差分析及LSD-t检验.结果 HS后2 h即可见肺血管通透性增高,肺脏出现弥漫件炎细胞侵润.肺绀织IL-1β和TNF-α在HS诱导的ALI早期(4 h)升高[IL-1β(333.83±31.18)vs.(284.83±30.49),P=0.014;TNF-α(805.00±114.67)vs.(584.17±181.17),P=0.023];肺组织HMCB1在ALI 16～48 h显著升高[HMGB1/β-actin(0.99±0.16)vs.(0.50±0.18),P=0.003].ALI组小鼠肺MPO及EBD水平显著增高,分别于ALI 4 h和24 h达峰值[MPO(38.33±3.88)vs.(8.00±0.89),P<0.01;EBD(20.05±2.79)vs.(4.63±0.43),P<0.01];抗HMGB1抗体干预组肺组织MPO及EBD峰值显著下降[MPO(25.67±1.63)vs.(38.33±3.88),P<0.01;EBD(5.68±0.53)vs.(20.05±2.79),P<0.01],抗体干预组小鼠肺组织病理切片见肺部弥漫性炎细胞浸润减轻,抗体干预24 h组尤为明显.结论 HNGB1是HS所致ALI的晚期炎症介质,HNGBl拮抗治疗能减轻小鼠HS所致ALI病理牛理改变.     

HRE 和 hTERT 修饰条件复制型腺病毒携带 Egr-1介导的 Smac 对人食管癌细胞 Eca109周期和凋亡的影响

目的：探讨以 HRE 和 hTERT 修饰条件复制型腺病毒携带 Egr-1介导的 Smac（CARd．pE-Smac）对人食管癌细胞 Eca109周期和凋亡的影响。方法利用氯化钴进行化学乏氧,病毒感染滴度为5 MOI [Multiplicity of infec-tion （virus/cell）]感染人食管癌 Eca109细胞24 h,并进行2 Gy 照射,12 h 后分别利用 Western blotting 检测 Smac 蛋白的表达,PI 染色和 AnnexinⅤ-FITC 双染,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。实验分为 control、CARd．pE-Smac、hypoxia、2 Gy、H＋CARd．pE-Smac、CARd．pE-Smac＋2 Gy 和 H＋CARd．pE-Smac＋2 Gy 组。结果CARd． pE-Smac 感染常氧和乏氧的 Eca109细胞后均未见 Smac 蛋白表达增加,而2 Gy 照射后,常氧、感染 CARd．pE-Smac和乏氧再感染 CARd．pE-Smac 均能使 Smac 蛋白表达增加,尤其以三者联用后 Smac 表达增加最大;感染 CARd．pE-Smac 未对细胞周期有明显改变,而乏氧、2 Gy 和感染 CARd．pE-Smac 任二者（乏氧与2 Gy 除外）或者三者联用均能显著增加 S 期和 G2/M 期细胞百分比增加（P ＜0．05,P ＜0．01）,尤其以三者联用作用更强;而且,对于细胞凋亡的诱导作用与周期进程变化的规律相类似。结论HRE 和 hTERT 修饰条件复制型腺病毒携带 Egr-1介导的 Smac 在人食管癌细胞 Eca109中显著过表达,且能够导致细胞发生 S 期延迟和 G2/M 期阻滞,并诱导细胞发生凋亡。     

Cytotoxic T cells clear virus but augment lung pathology in mice infected with respiratory syncytial virus

We have examined the function of class I MHC-restricted cytotoxic T cells in experimental respiratory syncytial virus (RSV) infection of BALB/c mice by transfer of T cell line MJC-A2 and CTL clone E8a into RSV-infected mice. The T cell line cleared pulmonary RSV infection within 5 d in persistently infected gamma-irradiated mice, but caused acute respiratory disease. This was only seen in infected mice and was often lethal after transfer of greater than 3 x 10(6) CTL. Lower numbers of CTL produced less severe disease but still cleared lung RSV, albeit over a longer time course (up to 10 d). Clearance of lung RSV in immunocompetent mice by the T cell line and CTL clone was again accompanied by acute and sometimes lethal respiratory disease. Bronchoalveolar lavage showed severe lung hemorrhage and frequent neutrophil efflux in mice with CTL-augmented disease.