赖型钩体pCX7探针Southern杂交分析不同血清群型钩体DNA

用赖型０１７株钩体ＤＮＡ基因库中筛选出的重组克隆ｐＣＸ７制备重组质粒，再以￣（３２）Ｐ标记为探针，对１１个血清群的１８株问号钩体、双曲钩体ＰａｔｏｃＩ株和细螺旋体ｉｌｌｉｎｉ３０５５株ＤＮＡＳｏｕｔｈ－ｅｒｎ杂交。放射自显影结果显示：双曲钩体ＰａｔｏｃＩ株和细螺旋体ｉｌｌｉｎｉ３０５５株ＤＮＡ未获杂交阳性区带；ｊａｖａｎｉｃａ（爪哇）、ｍａｎｈａｏ２（曼耗２）和ｒａｎａｒｕｍ（蛙）三个低毒力血清型的问号状钩体ＤＮＡ亦为阴性；１５株问号状钩体ＤＮＡ均出现了杂交信号，而且不同群型钩体ＤＮＡ杂交带型明显不同，赖型钩体０１７株（强毒株）与６０１株（弱毒株）杂交带型也有细微差别。作者认为，以ｐＣＸ７探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交可望作为钩体分类和鉴定的工具或参考。     

赖型钩端螺旋体重组DNApCX7的特异性鉴定和限制性内切酶谱分析

本实验将赖型钩端螺旋体（简称钩体）ＤＮＡ基因库的克隆ｐＣＸ７制备成￣（３２）Ｐ－重组ＤＮＡ探针，对８个不同血清群的１７株问号状钩体、双曲钩体ＰａｔｏｃⅠ株以及细螺旋体３０５５株ＤＮＡ进行打点杂交；同时用１５种ＤＮＡ片断进行限制性内切酶谱分析。结果表明，该重组ＤＮＡ具有问号状钩体种（Ｓｐｅｃｉｅｓ）特异性，但与不同问号状钩体之间的同源性程度有差别；限制性内切酶谱分析发现ｐＣＸ７重组ＤＮＡ片段长约１．７ｋｂ，具有１个Ｂｇ１Ⅱ识别位点和３个ＢｓｔＢ１识别位点。     

应用低严格度-单引物聚合酶链反应对问号钩体中国参考株的基因多态性分析

Ｇ１、Ｇ２引物是对问号钩体具有特异性的引物。分别用Ｇ１或Ｇ２单引物对问号钩体中国参考株进行前４个低严格度循环的ＰＣＲ扩增，扩增带谱显示赖型、犬型、致热型、秋季型、澳洲型、临海型、乌尔夫型、溶血型为一类，而爪哇型、拜伦型、波摩那型、七日热型、巴叶赞型、塔拉索夫型、曼耗Ⅱ型则不与以上赖型等血清型钩体为一类，双曲钩体Ｐａｔｏｃ型及伊利尼细丝体伊利尼型的扩增带谱与问号钩体截然不同。应用苯酚法提取的高纯度钩体ＤＮＡ与ＳｉＯ２法提取的粗ＤＮＡ扩增结果一致。对钩体病患者血清标本进行ＬＳＳＰ－ＰＣＲ检测，可快速地对所感染钩体作出初步遗传学分类鉴定。     

钩端螺旋体CPL5x、BMD－3A、BMD－10基因转录表达的初步研究

经氯化锂—脲提取ＲＮＡ的方法提取钩端螺旋体（钧体）赖型０１７株的总ＲＮＡ，用生物素标记的钩体保护基因ＢＭＤ－３Ａ、ＢＭＤ－１０、问号钩体种特异性基因ＣＰＬ５ｘ及赖型钩体０１７株总ＤＮＡ作为探针，分别与所提取的总ＲＮＡ进行斑点杂交。结果显示：以上探针均出现了不同强弱的杂交信号，证明了ＢＭＤ－３Ａ、ＢＭＤ－１０、ＣＰＬ５ｘ三个特异性基因片段在０１７株钩体中得到了转录表达，提示其可能分别在钩体免疫保护及钩体种特异性鉴定中具有重要作用。     

保护性MbE_4B_7G_5对问号状钩体疏水外膜蛋白OmpL_(39)的免疫印迹分析

选用具有高效价、特异性的黄疸出血群保护性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）Ｅ４Ｂ７Ｇ５，用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ，对ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４（ＴＸ－１１４）抽提的６株问号状钩体（０１７、６０１、６０３、６０９、６２０、２４５株）的疏水外膜蛋白进行分析鉴定。结果表明，提纯的０１７、６０１、６０３、６０９株问号状钩体３９ｋｄ疏水外膜蛋白（ＯＭＰ）有明显的免疫反应，而６２０、２４５株此带区无明显的免疫识别。这一结果提示：用ＭｂＥ４Ｂ７Ｇ５筛选问号状钩体保护性抗原，分离、纯化３９ｋｄ的疏水外膜蛋白（ＯｍｐＬ３９）在构建钩体基因工程疫苗中有重要的研究价值。     

光敏生物素和~(32)P标记DNA打点杂交检测钩端螺旋体

应用光敏生物素和~(32)P标记黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体DNA(简称017DNA)作为探针,打点杂交检测问号状钩体。结果表明:两种探针均能检测不同群、型的问号状钩体DNA,最小检测量分别为5pg和1pg;与双曲钩体patoc型PatocⅠ株、细螺旋体属illini型3055株及其他致病菌和正常人血清未发现明显杂交信号。提示光敏生物素制备的017DNA探针可以用于检测钩体,也可应用于钩体病的早期诊断和流行病学调查。     

钩端螺旋体病患者早期血标本的PCR检测

以问号钩体１６ＳｒＲＮＡ基因多变区序列作引物，用ＳｉＯ＿２高盐吸附法处理，对５５例钩体病患者早期血标本进行了扩增。结果表明，问号钩体１６ＳｒＲＮＡ基因引物可用于钧体病的临床检测和流行病学调查，其检测效果明显优于血培养和显微镜凝集试验（Ｐ＜０．０１）等方法。     

保护性Mb E4B7G5对问号状钩体疏水外膜蛋白OmPL39的免疫…

选用具有高效价、特异性的黄疸出血群保护性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）Ｅ４Ｂ７Ｇ５，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，对Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１４４（ＴＸ－１４４）抽提的６株问号状钩体（０１７、６０１、６０３、６０９株）的疏水外膜蛋白进行分析鉴定。结果表明，提纯的０１７、６０１、６０３、６０９株问号状钩体３９ｋｇ疏水外膜蛋白（ＯＭＰ）有明显的免疫反应，而６２０、２４５株此带区无明显的免疫识别。这一结果提示：用     

16S rRNA基因多变区序列对不同种属钩端螺旋体的PCR扩增

从问号状钩体16S rRNA基因多变区V2和V4序列中设计了一对引物:PⅠ 5’GGGAAC CTA ATA CTG GAT GG;PⅡ 5’ACA TAG TTT CAA GTG GAG GC,并对不同种属钩体DNA进行了扩增。在55℃退火条件下,问号状钩体各群型具有相同大小的扩增产物(473bp)和KpnⅠ酶谱,双曲钩体有约280bp的扩增带,但不被KpnⅠ酶消化,而细丝体属钩体和其它对照DNA未见扩增。以~(32)P标记的lai型Lai株(强毒)扩增产物作探针行Southern杂交发现,问号状钩体各株扩增带均可被杂交,而双曲钩体扩增物无杂交。研究表明,该对引物可用于钩体的分类和检测。     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的克隆和在E.coli表达的研究

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经ＨｈａⅠ和ＡｌｕⅠ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲⅠ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲⅠ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲⅠ臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，建成含２．１×１０６重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出一个强阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆入ｐＵＣ１８质粒，获重组质粒，ｐＤＬ１２１。ＥｃｏＲⅠ酶切证实该重组质粒含有１ｋｂ的外源插入片段。ｐＤＬ１２１经ＩＰＴＧ诱导后，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现２３ｋｄ特异条带。免疫印迹表明该蛋白带可被抗赖型钩体兔血清识别。     

用分子杂交技术对17株钩端螺旋体基因组DNA同源性的研究

采用缺口平移及随机引物标记法制备出问号状钩体017株、双曲钩体Patoc Ⅰ株和细螺旋体illini型3055株3株不同属种钩体基因组DNA的~(32)P标记探针,用之分别与构端螺旋体属和细螺旋体属的5个血清群17株钩体DNA进行打点杂交。结果发现:此两属钩体间基因组DNA同源性极低;属内不同种间有较低同源性;问号状钩体中不同血清型之间有较高的同源性;赖型017株钩体DNA与不同群型的致病性钩体均有较高的同源性,表明该探针可作为广泛识别各致病性钩体的通用探针。     

应用低严格度—单引物聚合酶链反应对问号钩体中国参考株的…

Ｇ１、Ｇ２引物是对问号钩体具有特异性引物。分别用Ｇ１或Ｇ２单引物对问号钩体中国参考株进行前４个低严格度循环的ＰＣＲ扩增，扩增带谱显示赖型、犬型、致热型、秋季型、澳洲型、临海型、乌尔夫型、溶血型为一类，而爪哇型、拜伦型、波摩那型、七日热型、巴叶赞型塔拉索夫型、曼耗Ⅱ型是不与以上赖型等血清型本为一类，双曲钩体ａｔｏｃ型及伊利尼细丝体伊利尼型的扩增带谱与问号钩体截然不同。应用苯酚法提取的高纯度钩体ＤＮＡ     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的…

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经Ｈｈａ Ｉ和Ａｌｕ Ｉ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲ Ｉ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲＩ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲ１臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０，建成含２．１×１０＾４重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出中阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆     

我国主要致病钩端螺旋体DNA与OmpL1基因同源性的研究

用￣（３２）Ｐ标记的ＯｍｐＬ１基因片段与我国１８株钩体进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，此片段与非致病钩体ＰａｔｏｃＩ株、伊利尼细丝体３０５５株无杂交信号；问号钩体中，除爪哇群、塔拉索夫群、曼耗群和明尼群的４株钩体外，黄疸出血群、犬群、拜伦群、致热群、秋季群、澳洲群、波摩那群、流感伤寒群、七日热群、巴达维亚群、赛罗群各群钩体参考株ＤＮＡ均有杂交信号。     

问号钩端螺旋体对主要细胞外基质分子黏附作用及其差异性研究

目的：了解问号钩端螺旋体（简称钩体）对细胞外基质（ECM）分子的黏附作用及其差异。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A．1、L929和Vero细胞感染模型，采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法，了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效果。建立多种ELISAs，检测问号钩体56601株黏附ECM分子层粘连蛋白（LN）、纤维纤连蛋白（FN）、核心蛋白多糖（DEN）及胶原蛋白1、2、4（COL1，2，4）的作用，采用竞争性抑制试验对上述实验结果进行验证。结果：问号钩体56601株能以一端或两端黏附于L929、J774A．1和Vero细胞的ECM部位。问号钩体56601株可与上述6种ECM分子发生黏附，其中对COL1、LN、COL4的黏附作用较强。问号钩体56601株分别与上述6种ECM分子预孵育后，对相应ECM分子的黏附作用明显下降。结论：ECM是问号钩体黏附宿主细胞的主要部位。LN、FN、DEN、COL1、COL2、COL4均是问号钩体黏附的受体分子，但问号钩体对不同ECM分子的黏附效果有一定差异。     

我国主要致病钩端螺旋体DNA与OmpL1基因同源性的研究

用＾３２Ｐ标记的ＯｍｐＬ１基因片段与我国１８株钩体进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。此片段与非致病钩体ＰａｔｏｃＩ株、伊利尼细丝体３０５５株无杂交信号；问号钩体中，除爪哇群、塔拉索夫群、曼耗群和明尼群的４株钩 体外，黄疸出血群、犬群、拜伦群、致热群、澳洲群、波摩那群、流感伤寒群、七日热群、巴达维亚群、赛罗群各群钩体参考株ＤＮＡ均有杂交信号。     

用分子杂交技术分析不同毒力钩端螺旋体基因组DAN同源性

用~(32)P标记钩端螺旋体(钩体)基因组DNA,以Dot-blot和Southern-blot杂交法分析5株钩体DNA同源性。结果表明:问号钩体黄疸出血群赖型017株和601株及七日热群七日热型245株与双曲钩体patoc型Patoc I株、细螺旋体illini型3055株同源程度极低;3株问号钩体有不同程度同源;illini型3055株与各株同源性均低。     

不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究

目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体）株携带侵袭相关mce基因情况，原核表达mce基因并制备其抗血清，了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法：采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段，T—A克隆后测序。采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统，SDS—PAGE联合Bio—Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况，采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清，免疫双扩散试验测定其效价。采用实时荧光定量RT—PCR，检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A．1细胞前后mce基因转录水平的变化。结果：我国13株问号钩体株均携带mce基因，双曲钩体三宝垄群patoc型PatocI株则否。与报道的序列（GenBank accession No．：NP_712236）比较，所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．02％～100％和97．91％～100％。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce，其产量为细菌总蛋白的5％。问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce。问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调。结论：mce基因仅存在于致病性的问号钩体中，且其转录水平呈细胞接触上调模式，表明该基因与问号钩体致病性密切相关。mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段。     

问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞FasL/Fas表达上调及FasL/Fas相关细胞凋亡的研究

目的：了解FasL／Fas途径参与问号钩端螺旋体（简称钩体）诱导细胞凋亡及其FasL／Fas表达水平变化。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核一巨噬细胞J774A．1模型。采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征，流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法，观察问号钩体56601株感染细胞FasL／Fas表达情况。采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL／Fas表达水平。结果：问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h时，部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象；感染24h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解。问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h和24h的凋亡率分别为53．6％和64．31％。FasL中和抗体预处理细胞后，问号钩体56601株感染细胞4h或24h的凋亡率分别为10．27％和15．90％。J774A．1细胞被问号钩体56601株感染后4和24h，FasL表达率分别从感染前的4．19％上升至21．69％和65．70％，Fas表达率分别从感染前的12．88％上升至91．96％和88．01％。结论：诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A．1细胞的重要机制。问号钩体可上调靶细胞FasI。／Fas表达水平；并通过FasL／Fas途径诱导J774A．1细胞凋亡。     

PCR扩增52株钩体23S rRNA基因及其临床应用55例分析

采用犬型钩端螺旋体(以下简称钩体)Moulton株23SrRNA基因273-293位点和376—396位点的引物A和B,即5＇GATCTAATTCGCTGTAGCAGG~(3＇)及~(5＇)ACTTTCACCCTCTAT-GGTCGG~(3＇),对52株钩体进行PCR扩增。结果表明49型50株问号状钩体均发生特异性扩增,而双曲钩体patoc型PatocⅠ株及细螺旋illini型3055株钩体不出现特异性扩增。用引物A和B对1992年从井研、西昌两地收集的早期钩体病患者的早晚期血清进行PCR扩增,结果第一次血清55份(发病后1～5天),PCR阳性51例(92.72％),第二次血清55份(发病后6～60天),PCR阳性41例(74.55％)。由此表明PCR不仅可广泛用于钩体病的临床早期诊断,而且可用于检测不同病程患者血中钩体DNA。