利用生物信息学资源进行差异表达ESTs的分析与新基因的克隆

人类真核细胞中大约有70,000个不同的基因,不同类型的细胞所表达的基因不同,即便是同一类型的细胞,在特定时刻同时表达的基因也是很少的一部分,约占基因总数的10～15％。基因差异表达决定了生命的所有过程,分析不同类型的细胞以及同一细胞在不同病理和生理状况下的基因表达差异可以有助于我们获得与生命本质有关的信息,揭示疾病发生发展的分子机制。因此,如消     

肺巨细胞癌高低转移株差异表达基因的鉴定

目的 从两株同源但转移能力不同的人肺巨细胞癌细胞株中分离并鉴定差异表达基因。方法 应用抑制消减杂交(SSH)技术,对来源相间、转移能力不同的人肺巨细胞癌细胞株PLA-801C和PLA-801D进行了两次实验。第1次SSH实验以PLA-801C株为实验方,第2次实验以PLA-801D株为实验方。将获得差异表达的片段点在氨基化的玻片上做成基因芯片,利用荧光标记的探针与芯片杂交,选取差异表达克隆,并利用RNA狭缝杂交或Northern杂交对若干片段进行验证。结果 在低转移肺巨细胞癌细胞株中,高表达的序列有16条;在高转移肺巨细胞癌细胞株中,高表达的序列有79条。测序后经过同源性分析,大部分序列均与已知序列高度间源,主要编码以下几类蛋白：(1)细胞因子及其受体相关蛋白;(2)激酶及其相关蛋白;(3)其他蛋白,包括酶类、热休克蛋白、受体蛋白、细胞骨架蛋白、线粒体蛋白和癌基因编码产物等;(4)一些未知功能的蛋白或是从核酸序列推出来的假想蛋白。结论 HSP70、AXL受体酪氨酸激酶和14-3-3ξ等多种已知基因表达情况的改变,可能影响肺癌的转移过程,此外还发现了一些可能的肿瘤转移相关新基因。     

人NIT1基因原核表达载体的构建和鉴定

背景与目的目前已知FHIT基因为抑癌基因，其结构和功能的异常与肺癌的发生、发展有密切关系，而且可能与NIT1基因存在功能上的相关性。但是．FHIT基因与NIT1基因调控肺癌发生发展的分子机制尚未明了。本研究旨在构建人NIT1基因原核表达载体．为进一步研究人肺癌细胞株中NIT1基因和FHIT基因的关系打下基础。方法应用RT—PCR法获得NIT1基因cDNA．定向克隆到融合表达载体pET-32a中．作双酶切和测序鉴定。结果①克隆的cDNA片断包含了人NIT1基因翻译区的全部序列，翻译区序列与GenBank登录的人NIT1 cDNA序列完全一致。②对构建的原核表达载体做双酶切．获得了预期的目的条带。结论通过RT—PCR和定向克隆的方法．成功构建了人NIT1基因的原核表达载体，为研究人NIT1蛋白的表达和进一步研究人肺癌细胞中NIT1基因和抑癌基因FHIT的关系奠定了基础。     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.     

联合检测nm23—H1、E—cadherin基因蛋白在鼻咽癌中的表达

目的探讨nm23-H1基因和粘附分子E-cadherin在鼻咽癌中的表达情况及其与转移的关系.方法用免疫组化SP法检测nm23-H1和E-cadherin基因产物在42例鼻咽癌中的表达.结果42例鼻咽癌活检标本中,nm23-H1蛋白表达阳性率54.7%,E-cadherin表达阳性率57.1%,nm23-H1蛋白在有颈淋巴结转移患者中表达阳性率为40.7%,在无颈淋巴结转移患者中表达阳性率为80.0%,两者差异有显著意义(P<0.05).E-cadherin在颈淋巴结转移阳性患者中表达阳性率为44.4%,颈淋巴结转移阴性患者中表达阳性率为80.8%,两者差异有显著意义,(P<0.05).两种基因产物表达在鼻咽癌中呈正相关(P<0.01).结论nm23-H1和E-cadherin基因与鼻咽癌的转移密切相关,对临床判断鼻咽癌预后有一定指导意义.     

4-1BBL基因真核表达载体构建及在肝癌细胞中表达的研究

目的 研究含鼠源性4-lBBL真核表达载体体系的构建及其在大鼠肝细胞癌(HCC)细胞系CBRH7919中获得稳定、高效表达的方法。方法 将4-lBBL全长cDNA亚克隆到真核表达载体PCI-neo中,获得4-1BBL定向插入重组子PCI-neo-4-lBBL,采用酶切法和测序法鉴定。用阳离子脂质体将PCI-neo-4-1BBL转染CBRH7919,经G418筛选,获得阳性克隆,命名为PCI-neo-4-lBBL-CBRH7919 细胞。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测4-1BBL在CBRH7919中的表达。结果 PCI-neo-4-1BBL经限制性内切酶切,电泳后显示有980bp的4-lBBL目的基因片段和5．4kb的线性化PCI-neo载体片段;重组子测序结果与Genbank中4-lBBL cDNA序列相符,证实构建成功。RT-PCR检测到4-lBBL在PCI-neo-4-1 BBL-CBRH7919 细胞中获得稳定表达。结论 重组4-1BBL真核表达载体构建正确,并在PCI-neo-4．1 BBL-CBRH7919 细胞中获得稳定、高效表达。     

抑癌基因Rb、MTS1的表达与膀胱癌的预后

目的：研究抑癌基因Ｒｂ、ＭＴＳ１的表达与膀胱癌的预后。方法：用Ｓ－Ｐ免疫组化法同步检测６０例膀胱移行细胞癌抑癌基因Ｒｂ、ＭＴＳ１的表达,观察其与预后的关系。结果：ＰＲｂ、ｐ１６表达阳性组生存率明显优于阴性组。结论：ＰＲｂ与ｐ１６均具有膀胱癌的预后价值,而同步检测两者的预后价值优于单一检测。     

应用抑制消减杂交技术筛选人肾癌差异表达新基因

背景与目的：认识肾癌差异表达基因有助于阐明肾癌发生,发展的分子机制。但至今有关肾癌差异基因尤其肾癌特异相关基因的研究仍不令人满意,本实验应用抑制消减杂交技术筛选入肾癌组织与正常肾组织间差异表达的新基因,以期克隆出新的肾癌特异相关基因。方法：以肾癌组织mRNA为检测对象（Tester)。正常肾组织mRNA为驱赶者（Driver)。构建cDNA消减文库,随机挑取文库克隆进行酶切及测序,所得结果在GenBank中做同源性比对分析。对感兴趣的片段进行电子定位确定其在染色体的位置,用Northern blot,半定量RT-PCR方法检测新基因在肾癌组织与正常肾组织中的差异表达。结果：文库包含414个阳性克隆;随机挑取280个克隆提取质粒并酶切分析,其中265个有插入片段;将其中80个克隆进行测序,初步显示28、158、170、249号4个克隆为新基因片段,电子定位表明上述4个基因分别位于染色体21q^22,4q^15.3,9q^34,22q^11.2。已在GenBank中登录（BM181083,BI784487,BI863835,BI863386）,对其中28、170号克隆用Northern杂交,半定量RT-PCR检测,证实新基因在肾癌组织中表达较正常肾组织显著增高。结论：抑制消减杂交技术是筛选,克隆肾癌差异表达新基因的有效手段;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长,研究基因功能提供了实验基础。     

小鼠Doc-1R基因的克隆及其表达

背景与目的：Doc-1R基因是1999年克隆的一种新的基因,已有的研究表明Doc-1R基因可能是一种潜在的抑癌基因。为了进一步研究此基因的功能,我们首先克隆了小鼠的Doc-1R基因,并对此基因的表达进行了初步的研究。方法;根据小鼠的Doc-1R基因cDNA序列,设计合成了基因组特异引物,应用巢式PCR对小鼠基因组步移文库进行扩增。对测序结果进行序列分析及剪接位点的鉴定。另外应用RT－PCR的方法研究了Doc-1R基因在小鼠肝,脾,胰,肾,肺,肠,心,脑,骨,肌肉,膀胱,卵巢,睾丸等13种组织的表达。结果：经二次基因组步移获得了小鼠Doc-1R基因组全长序列。基因组全长2787bp,含4个外显子和3个内含子,外显子与内含子接头符合GT／AG法则。RT－PCR结果表明,Doc-1R基因在小鼠13种组织和器官中均有表达。结论：成功克隆了小鼠Doc-1R基因,为进一步研究此基因的功能奠定了基础。RT－PCR表达结果提示此基因可能是对维持组织器官的功能具有重要的作用的管家基因。     

IN SILICO EXPRESSION ANALYSIS OF HUMAN NOVEL GENE UBAP1 IN MULTIPLE CANCERS

Loss of heterozygosity (LOH) on human chromosome 9p2l-22 is one of the most frequent genetic alterations in many common sporadic cancers, including breast cancer, lung cancer, bladder cancer, melanomas, gliomas and nasopharyngeal carcinoma. So it was postulated that there might be some other unknown tumor susceptibility or suppressor genes, which are correlated with the occurrence of these cancers[1-5]. In order to obtain the novel genes associated with human nasopharyngeal carcinoma (NPC) o…     

差异杂交筛选人肝癌组织内高表达的新基因

目的寻找与肝癌相关的新基因。方法应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术对１２个表达序列标记（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ,ＥＳＴ）克隆进行筛选,找到在肝癌及癌旁肝组织内有表达差异的基因,然后与基因数据库进行比较。结果Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示,ＥＳＴ克隆Ｆ９３９１在所有６例肝细胞肝癌标本中呈高表达,而在相应的癌旁肝及２例正常组织内低表达。ＤＮＡ序列测定并检索基因数据库ＧｅｎｅＤａｔａｂａｓｅｓ（ＥＭＢＬ９６．６）,表明该基因属于一未知新基因。结论Ｆ９３９１基因为一在肝癌组织内高表达的新基因,它与细胞的增殖相关,可能在肿瘤的发生中起重要作用,并且有可能成为肝癌诊治的一个新标志。     

染色体3p14.2区域一个与鼻咽癌呈负相关EST的鉴定

目的：寻找染色体３Ｐ１４．２区域与鼻咽癌相关的表达序列标记,为筛选鼻咽癌候选基因打下基础。方法：运用生物信息学同生比较筛选ＥＳＴ的策略,结合Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和逆转录ＰＣＲ方法,检测３ｐ１４．２区域的相关ＥＳＴＳ在鼻咽癌和正常鼻咽组织中的表达。结果：在３Ｐ１４．２区域筛选到一个在鼻咽癌中低表达的ＥＳＴＷ２３３１２,与正常鼻咽上上以组织相比较,在鼻咽癌细胞株及１３例鼻咽癌活检组织中的５便其表达下调     

人睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因的克隆测序及在原核系统中的表达

目的：扩增及克隆人的MAGE-E1基因并利用大肠杆菌进行表达。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325中提取总RNA，用RT-PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE-E1基因片段插入载体pGEM-T easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达载体pGEX-4T-2-MAGE-E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmol／L．异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE-E1蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出Mr约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白的35％。结论：成功扩增、克隆MAGE-E1基因，并在大肠杆菌中得到稳定高效表达。     

新克隆的硝基还原酶基因NOR1的表达及其产物的纯化

背景与目的：NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤／易感基因候选者之一,本实验旨在构建NOR1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化NOR1基因所编码的蛋白。方法：抽提人鼻咽正常组织中总RNA,利用RT－PCR扩增NOR1基因全长,经BamH I、Xho I双酶切后插入同样经BamH I、Xho I双酶切后的pGEX-4T-2质粒,构建表达载体pGEX-4T-2/NOR1重组表达质粒;转化大肠杆菌Jm105,用异丙基－β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-thiogalactoside,IPTG）诱导pGEX-4T-2/NOR1/Jm105表达GST融合蛋白后,采用Western blot验证,并用GST琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。结果：酶切鉴定和测序验证成功地构建了NOR1基因原核表达载体,经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析在大肠杆菌Jm105中成功诱导表达了一分子质量约为74kDa的融合蛋白;该融合蛋白存在于细菌裂解液的上清和沉淀中,Western blot证实表达获得了成功;并利用亲和层析法获得了纯化蛋白。结论：成功获得了高效表达NOR1基因的原核表达产物,通过对该融合蛋白的纯化为它的多抗制备奠定了基础。     

肝细胞癌细胞诱导和体外培养的大鼠肝星状细胞基因差异表达

目的 从基因水平了解肝细胞癌(HCC)内的星状细胞(HSC)与正常肝HSC的异同.方法 密度梯度离心分离HSC,用大鼠HCC细胞株CSF的条件培养基诱导HSC活化.cDNA微阵列比较静止、体外培养活化和诱导活化HSC之间22 012个基因的表达,并通过实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和Western blot检测进行验证.结果 与静止HSC相比,体外培养HSC共有1672个基因差异表达,包括促炎症因子、细胞表面受体、黏附分子、信号转导分子、免疫因子等,其中1012个基因上调,660个基因下调.肿瘤诱导活化HSC有711个基因差异表达,其中420个基因上调,291个基因下调,有一部分基因表达与体外培养相同,部分基因如Raf1、Rac2、Adam17、Wnt6、MMP-9和TNF等,呈特异性表达.real-time RT-PCR和Western blot检测结果与cDNA微阵列检测结果相符.结论 HCC细胞可特异性驱动HSC的活化,诱导活化的HSC在HCC细胞的浸润和转移中可能起重要作用.瘤内活化的HSC应作为研究HSC生物学功能的标准.     

RAS相关家族1A基因在胃癌中的表达和启动子甲基化

目的分析散发性胃癌中RAS相关家族1A基因(RASSF1A基因)的表达、突变和启动子甲基化状况,探讨RASSF1A基因在胃癌发生、发展中的意义.方法采用定量PCR、RT-PCR和SSCP的检测90例胃癌组织和30例相应癌旁正常组织中RASSF1A基因表达水平以及基因突变的情况;采用甲基化特异性PCR (MSP)方法检测RASSF1A基因启动子甲基化情况.结果 90例胃癌中有52例(57.8%)RASSF1A无表达或表达低下.RASSF1A无表达或表达低下和肿瘤细胞的分化(P<0.05)以及分期(P<0.001)相关,但是和肿瘤的浸润深度以及淋巴结转移不相关(P>0.05).90例胃癌中52例启动子发生甲基化(57.8%),其中90.3%(47/52)的RASSF1A无表达或表达低下组织中检测到RASSF1A基因启动子的甲基化,然而癌旁正常组织未发现有RASSF1A基因启动子的甲基化,SSCP没有发现任何突变.结论胃癌中存在较多的启动子异常甲基化造成RASSF1A基因失活,这可能是胃癌发生发展的因素之一.     

三苯氧胺对淋巴细胞mdr1表达阳性的非小细胞肺癌患者多药耐药性的逆转作用

目的:探讨经多次化疗的非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤细胞与外周血淋巴细胞(PBL)多药耐药基因(mdrl)表达蛋白P-gp含量及其相关性;临床观察三苯氧胺对已产生多药耐药的NSCLC患者耐药性的逆转作用.方法:应用流式细胞免疫学方法,对57例多次接受过化疗的NSCLC肿瘤组织细胞及PBL的P-gp含量进行定量研究,对PBL中P-gp表达阳性的48例患者均采用EMP方案化疗,其25例在化疗过程中同时予三苯氧胺口服,观察其临床治疗效果.结果:肿瘤细胞P-gp含量与其对应的PBL的P-gp含量呈正相关,PBL的P-gp含量可间接反应NSCLC细胞对化疗药物的耐受程度;三苯氧胺可部分逆转NSCLC细胞的耐药性,显著提高EMP方案对耐药的NSCLC患者的疗效.结论:通过检测NSCLC患者PBL P-gp的含量可间接反应肿瘤细胞的耐药程度,对已耐药的患者在化疗的同时合用三苯氧胺可明显提高化疗方案的有效率.