重组寻常型天疱疮抗原抗血清的制备与纯化

寻常型天疱疮抗原 (pemphigusvulgarisantigen ,PVA )是桥粒中相对分子质量为 130 0 0 0的糖蛋白 ,其分子由细胞外区(extracellulardomain ,EC )、跨膜区和细胞内区三部分组成 ,主要发挥作用的区域在细胞外区。为了了解PVA细胞外区的致病性位点及其相应抗体的致病作用 ,制备抗血清是必需环节。本文在已重组表达的PVAEC1 2融合蛋白的基础上进行蛋白纯化 ,并免疫家兔 ,使之产生针对融合蛋白的特异性抗血清 ,经双向免疫扩散实验 ,其效价为 1:16～ 1:32。采用辛酸沉淀法和DEAE 5 2 纤维素阴离子交换层析进行抗血清IgG抗体成分的提纯 ,总量为 12 5～ 2 2 0mg ,经间接免疫荧光检测 ,其滴度为 1:40。从而获得高滴度、高特异性的兔抗PVAEC1 2融合蛋白抗血清IgG抗体成分。     

兔抗人Bit1抗血清的制备及其纯化

目的：利用大肠杆菌中表达的人Bitl(hBitl)蛋白，制备兔抗人Bitl抗血清并对其进行纯化。方法：在大肠杆菌中诱导表达人Bitl融合蛋白：以其免疫家兔，制备兔抗人Bitl抗血清，用非特异性去除法纯化抗体，并以Western blot对所纯化的兔抗人Bitl抗血清进行鉴定。结果：大肠杆菌中表达的人Bitl蛋白占菌体总蛋白的40％。用纯化的抗血清可特异地检出大肠杆菌表达的人Bit融合蛋白。结论：人Bitl融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，并成功地制备并纯化了兔抗人Bitl抗血清。     

人甘露糖结合凝集素（MBL）的纯化与兔抗人MBL抗血清的制备

甘露糖结合凝集素ｍａｎｎｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎＭＢＬ是哺乳动物Ｃ型凝集素超家族的成员,在机体抗感染免疫反应中处于第一线１。ＭＢＬ能特异性地识别多种病原微生物表面的多糖结构,进而激活补体系统和调理吞噬杀灭病原２３。同时,它也参与多种免疫性疾病的发生４。目前,有关其与疾病的关系,以及其在疾病治疗和预防中作用的研究正方兴未艾,因而获取有活性的ＭＢＬ蛋白,并制备其特异性抗体,已成为这些研究必不可少的工具。１材料和方法１．１材料混合人冰冻血浆由西京医院血库提供。Ｄ－甘露糖和…     

兔抗人ERA抗血清的制备

目的 在大肠杆菌中表达人ERA蛋白（h-ERA)和h-ERAC端结构域蛋白。并制备兔抗h-ERA抗血清。方法 以PCR扩增人era基因（h-era)全长cDNA和h-ERAC端的结构域基因,并分别克隆到（His)6融合表达载体RSET-C和非融合表达载体pDH中,诱导表达（His)6-h-ERA融合蛋白和h-ERAC端结构域蛋白,用h-ERAC端结构域蛋白免疫兔,制备兔抗h-ERA抗血清,并以Western-blot对兔抗h-ERA抗血清进行鉴定。结果 大肠杆菌中表达的h-ERAC端结构域蛋白和（His)6-h-ERA融合蛋白,分别占菌体总蛋白的40%和80%。用兔抗血清可检出大肠杆菌中表达的（His)6-h-ERA融合蛋白。结论 h-ERA和h-ERAC端结构域蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,并成功地制备了兔抗h-ERA抗血清。     

妊娠相关血浆蛋白A的分离，纯化及抗血清制备

本文采用Sephadex G-200,Hepaarin-Sepharose CL-6B亲和层析法从晚孕血浆中分离,纯化妊娠相关血浆蛋白A（PAPP－A）,纯化了545倍,回收率为60．7％,纯化的PAPP－A经SDS－PAGE鉴定呈单一条带,分子量为205,000;在280nm和214nm处有吸收峰,并含有锌,与PAPP－A标准抗体呈阳性反应,制备PAPP－A抗血清效价高,特异性好,已用于建立ELISA测定PAPP－A。     

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的微量蛋白制备抗血清

目的　以SDS PAGE纯化的微量蛋白制备抗人层粘连蛋白受体前体蛋白 (LRP)的血清。方法　以SDS PAGE分离纯化原核表达的人LRP与 6×组氨酸的融合蛋白 ,切下并粉碎融合蛋白所在凝胶块。将含 10 μg融合蛋白的凝胶颗粒与弗氏佐剂混匀后 ,免疫BALB/c小鼠。以Westernblot检测所获抗血清的滴度和特异性。结果　以胃癌细胞总蛋白为靶抗原时 ,Westernblot显示 ,所获抗血清仅识别 1条Mr 约 4 2 0 0 0的蛋白带 ,将抗血清做 1∶2 0 0 0稀释后 ,仍能清晰地显示其靶抗原所在位置。结论　以聚丙烯酰胺凝胶颗粒为载体 ,用微量蛋白即可成功地制备抗血清     

酶联免疫转印技术（EITB）在检测人类脑囊虫病患者血清IgG的IgG4抗体中的应用

本试验对4组脑囊虫病患者血清中的总IgG和IgG     

食物特异性抗体IgG检测在溃疡性结肠炎中的临床意义

探讨血清中食物特异性抗体IgG(sIgG)与溃疡性结肠炎的关系.用ELISA法检测30 例溃疡性结肠炎(UC)患者及76名正常对照sIgG,UC患者同时测ANA、CIC、补体C3、C4、CH50、抗脱氧核糖核酸B抗体(抗B抗体),sIgE及皮肤点刺试验.30例UC患者中sIgG阳性者口服5-氨基水杨酸并忌食相关食物,随访6个月观察疗效,与同期就诊的未测sIgG的39例UC患者相比较.30例UC患者中sIgG阳性21例阳性率70.0%,76名健康人中10例阳性,阳性率13.2%.两组相比较有显著性性差异(P＜0.01).治疗组21例,经随访2月总有效率46.7%,6月总有效率66.7%.对照组39名,2月总有效率9.5%,6月总有效率23.8%,两者相比有显著性差异(P＜0.01).食物sIgG检测在UC患者中是有意义的,食物sIgG升高与UC发病有关.     

兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定。方法:构建pGEX-4T1-g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-g-Hoxc10蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清。用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性。结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1-g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清。Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性。结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂。     

兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定.方法:构建pGEX-4T1 -g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶( GyST) -g-Hoxc 10蛋白.用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清.用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性.结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1 -g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清.Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性.结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂.     

兔抗人BMP-2成熟肽抗血清的制备

目的利用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-2(hBMP-2)成熟肽,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.方法将含有hBMP-2成熟肽基因的表达载体pDH2m,转化大肠杆菌,热诱导表达hBMP-2成熟肽,经纯化、复性后,再用其免疫兔子,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定.结果Western-blot结果显示在对应于hBMP-2成熟肽位置有阳性条带,免疫组化结果显示人软骨细胞胞浆阳性着色.结论hBMP-2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达,并成功制备了兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.     

Production of chicken yolk IgY to sulfamethazine: comparison with rabbit antiserum IgG

Sulfamethazine was used as target analyte to produce IgY from chicken aiming to compare the performance of these two antibodies in term of yield, titer, sensitivity, selectivity and matrix effect under parallel conditions. The results showed that the total yield of IgY produced by one chicken during 43 weeks' experimental period was about 15 g. This output is much more than IgG (150 mg from one rabbit). Besides, IgY titers increased during 10 weeks and remained stable over 30 weeks. The peak titer of IgY was 1:2¹⁸. As the antibody titer rose, the sensitivity was increased. For IgG, the maximum titer was observed to be 1:2²³. In addition, both IgY and IgG were highly sensitive. The limits of detection were 0.54 ng/mL for IgY and 0.24 ng/mL for IgG. These results indicated that the IgY potentially provides a practical and ethical alternative to IgG in veterinary drug residue immunoanalysis.     

RAI16蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的: 制备RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体, 并进行初步鉴定和应用, 为研究RAI16蛋白的功能及作用机制获得重要的实验工具.方法: 应用Fmoc法化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽, 经C18的RP-HPLC纯化后, 通过高碘酸钠法将纯化的RAI16蛋白的多肽与KLH交联; 皮下注射抗原免疫新西兰纯种大耳白兔, 加强免疫得到抗血清, 应用蛋白G纯化获得多克隆抗体.对纯化的抗体进行ELISA、免疫组化、 Western blot等初步鉴定和应用.结果: 化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽, 纯化后多肽纯度为96% , 达到免疫用抗原标准.多肽与KLH交联, 用于免疫动物.经纯化后的抗体效价为1∶ 125 000.该多肽抗体可特异识别人脾脏组织中相对分子质量(Mr)约为55 000的RAI16蛋白.结论: 所制备的多克隆抗体能与天然RAI16蛋白发生特异性反应, 可应用于ELISA、免疫组化、免疫沉淀和Western blot等实验, 为确定RAI16蛋白的组织分布和亚细胞定位、研究RAI16蛋白的功能及作用机制提供了重要的实验工具.     

兔抗人DOC-2抗血清的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌中表达的融合蛋白GST-nDOC-2，制备兔抗DOC-2的多克隆抗体。方法将克隆有人DOC-2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2)的原核表达载体pGEX-4T-nDOC-2转化大肠杆菌，IPTG诱导表达融合蛋白GST-nDOC-2，经包涵体洗涤后，用其免疫兔，制备兔抗人DOC-2抗血清。并以ELISA、Western blot和免疫组化的方法对抗血清进行鉴定。结果用ElISA法测定抗血清的效价为1：32000；Western blot结果显示对应于GST-nDOC-2融合蛋白位置上有阳性条带；免疫组化结果显示人正常卵巢上皮细胞胞浆呈阳性染色，人卵巢浆液性囊腺瘤上皮细胞染色呈弱阳性，而人卵巢癌浆液性囊腺癌上皮细胞呈阴性染色。结论成功制备了兔抗人DOC-2抗血清，为研究DOC-2的功能提供了有利的工具。     

兔BK通道β亚基多克隆抗血清的制备

目的:用小鼠制备抗兔BK通道β亚基的抗血清。方法:采用RT-PCR扩增编码兔BK通道β亚基胞内段的基因。在大肠杆菌中表达GST-β亚基融合蛋白。以从PAGE凝胶上切下的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗血清。用ELISA和Westernblot鉴定抗血清的特异性。结果:用RT-PCR扩增出约300bp的兔BK通道基因。序列分析显示,扩增的序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道的序列完全一致。在E.coliDH5α成功地表达Mr约为37000GST-β亚基融合蛋白。ELISA和Westernblot检测证明,针对GST-β亚基融合蛋白的抗血清,不仅可特异性地识别GST-β,也可识别源于兔组织的β蛋白。抗血清的最高滴度达1∶128000。结论:克隆了编码兔BK通道β亚基胞内段的基因,并成功地获得可特异性识别新西兰大白兔BK通道β亚基的高滴度抗血清,为BK通道的进一步研究提供了物质基础。     

Protection of mice against group Bstreptococcus type Ia by IgG components of a rabbit antiserum

IgG fractions were separated by ion exchange chromatography on DEAE-cellulose from hyperimmune rabbit sera prepared against a group Bstreptococcus type Ia mouse-virulent strain. 50g IgG in conjunction with ampicillin (200 mg/kg) protected mice more effectively against a lethal challenge than ampicillin (400 mg/kg) alone or ampicillin (200 mg/kg) combined with gentamicin (10 mg/kg), when administered up to 12 h after infection.     

抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗青霉素的单克隆抗体(mAb)并建立双抗体夹心ELISA检测方法,对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行研究。方法:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化,建立检测过敏原的双抗体夹心ELISA方法。结果:经细胞融合、筛选及克隆化,共获得9株稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株,其中5株亲和力较高。建立了双抗体夹心ELISA相对定量检测方法,该方法灵敏度达到870 U/L,平均回收率为107.81%,批内变异系数平均为6.7%,批间变异系数平均为9.3%,可用于A群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测。结论:成功地制备了抗青霉素的mAb,并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法。