抗人IgE血清的制备及其在ELISA中的应用——Ⅱ.羊抗人IgE血清的制备及用ELISA法测定人血清总IgE水平

本文介绍羊抗人 IgE 血清制备、纯化的方法学。用纯度较高的 IgE 骨髓瘤蛋白抗原,采用淋巴结微量免疫法免疫绵羊,制备出特异性羊抗人 IgE 血清。用琼脂双扩散法和免疫电泳祛分别鉴定其效价和纯度。用45%饱和硫酸铵盐析法进行粗提,再经 DEAE_(82)-纤维素离子交换柱层析,利用阶段洗脱法得以进一步纯化,制备出纯度较高的羊抗人 IgE 的特异性抗体(IgG 部分)。为了鉴定此特异性抗体的效价,应用 ELISA 测定人血清总 IgE 水平。本文对国外进口同类抗血清制品以及相应的辣根过氧化物酶结合物进行了比较。     

肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备

目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。     

蓝藻抗病毒蛋白-N的制备、生物活性鉴定及其多克隆抗体的制备和修饰

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其效价和特异性,抗血清经硫酸铵初步沉淀和DEAE离子交换层析获得纯化抗体,纯化抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)标记获得修饰抗体。结果:纯化获得纯度达95%以上且具有明显抗流感病毒作用的非融合CVN,利用所得CVN抗原成功制备CVN多克隆抗体,酶联免疫分析显示其效价达到1∶16 000以上,Western blot分析表明其具明显特异性。抗血清经盐析和DEAE离子柱层析后获得效价为1∶6 400高纯度纯化抗体,经HRP修饰后获得具有较高生物活性的标记抗体。结论:获得高纯度,高效价兔抗CVN多克隆抗体,以及HRP标记的兔抗CVN多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。     

鱼类传染性造血器官坏死病病毒糖蛋白的截短表达及免疫原性检测

目的研究鱼类传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)糖蛋白不同区域对免疫原性的影响。方法本研究通过DNAStar 6.0软件分析糖蛋白跨膜区、疏水性及抗原性后,对其进行截短表达;纯化后的糖蛋白制备兔抗血清,ELISA检测兔抗血清的效价,用间接免疫荧光技术检测纯化后蛋白的免疫原性。结果 SDS-PAGE结果显示,截短糖蛋白相对分子质量(Mr)为40 000,纯化后的糖蛋白经高效液相色谱检测纯度达到90%。利用纯化后的蛋白制备兔抗血清,ELISA结果显示,所制备的兔抗血清与糖蛋白的反应效价为1∶80 000,与IHNV-Sn株细胞培养物的反应效价为1∶20 000;间接免疫荧光结果显示,兔抗血清与IHNV-Sn分离株及参考毒株均能发生特异性的反应。结论实验所表达的糖蛋白与天然的病毒表面糖蛋白具有几乎相同的免疫原性。     

鱼类传染性造血器官坏死病病毒糖蛋白的截短表达及免疫原性检测北大核心CSCD

目的研究鱼类传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)糖蛋白不同区域对免疫原性的影响。方法本研究通过DNAStar 6.0软件分析糖蛋白跨膜区、疏水性及抗原性后,对其进行截短表达;纯化后的糖蛋白制备兔抗血清,ELISA检测兔抗血清的效价,用间接免疫荧光技术检测纯化后蛋白的免疫原性。结果 SDS-PAGE结果显示,截短糖蛋白相对分子质量(Mr)为40 000,纯化后的糖蛋白经高效液相色谱检测纯度达到90%。利用纯化后的蛋白制备兔抗血清,ELISA结果显示,所制备的兔抗血清与糖蛋白的反应效价为1∶80 000,与IHNV-Sn株细胞培养物的反应效价为1∶20 000;间接免疫荧光结果显示,兔抗血清与IHNV-Sn分离株及参考毒株均能发生特异性的反应。结论实验所表达的糖蛋白与天然的病毒表面糖蛋白具有几乎相同的免疫原性。     

人星状病毒1型衣壳蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体制备的研究

目的表达纯化人星状病毒1型(HAstV-1)衣壳蛋白VP26片段,制备多克隆抗体,初步建立夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)检测病毒抗原方法,为进一步大量表达VP26片段、构建基因工程疫苗和临床检测奠定基础。方法利用原核表达系统在大肠杆菌中克隆、表达重组VP26蛋白,并以Ni2+-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,运用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二噻啉甲酸法(BCA)实验、Western blot等方法对重组蛋白纯度、浓度、抗原性进行评价鉴定。以重组VP26蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳兔获得多抗血清并对其效价、特异性用ELISA鉴定。结果原核表达载体pET30a(+)-VP26构建成功,重组VP26蛋白可在大肠杆菌Rosetta 2宿主菌中大量表达。免疫兔所得多抗血清效价达到1∶8 000,可以满足夹心法ELISA实验的需要。结论HAstV-1衣壳蛋白原核表达系统建立和多克隆抗体制备可以作为今后相关研究的基础,有助于对HAstV-1感染致病机制、免疫诊断和疫苗研制的更深入研究。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

戊型肝炎病毒ORF2 C端抗原片段的表达及其免疫学特性研究

目的　表达戊型肝炎病毒 (hepatitisEvirus ,HEV)ORF2C端 12 8个氨基酸残基的抗原片段ORF2 3 ,并进行其免疫学特性的研究。方法　用pBV2 2 0载体进行抗原的非融合表达 ,包涵体经变性凝胶过滤层析及离子交换层析纯化后透析复性 ,以Westernblot、ELISA、动物免疫与抗原捕获RT nPCR等方法研究其免疫学特性。结果　获得了ORF2 3的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白 5 0 %左右 ,纯化后纯度达 98%以上 ,Westernblot表明表达抗原可与戊肝患者阳性血清特异性结合 ;在HEV感染恒河猴实验中用于IgG抗体的检测 ,具有较好灵敏度与特异性 ;用其免疫豚鼠 ,抗体经ELISA法测定效价为 1∶80 0 0 ;用制备的豚鼠抗血清捕获戊型肝炎病毒颗粒 ,经RT nPCR扩增出特异性片段。结论　ORF2 3抗原片段具有HEV抗体识别的抗原表位 ,能够刺激机体产生抗体 ,抗血清具有一定的识别与结合戊型肝炎病毒颗粒的能力     

兔抗B16黑素细胞多克隆抗体的制备及对黑素细胞增殖的影响

目的:制备兔抗B16黑素细胞多克隆抗体,研究其对黑素细胞增殖的影响。方法:①用B16黑素细胞颗粒抗原免疫家兔得到兔抗B16黑素细胞多克隆抗体;试管凝集法检测抗血清效价;G蛋白亲和层析纯化抗血清;②SDS-PAGE检测纯化抗体分子量大小;MTT法检测纯化抗体IgG对B16黑素细胞增殖的影响。结果:兔抗B16黑素细胞抗血清效价高达1:1280;亲和层析纯化抗血清获得的免疫球蛋白IgG,经SDS-PAGE电泳显示重链分子量大小约为66.2kD;MTT比色法显示IgG对黑素细胞增殖有抑制作用,与非IgG和未纯化血清差异显著。结论:成功制备并鉴定了高效价的兔抗B16黑素细胞多克隆抗体,纯化后所获得的高纯度IgG,对B16黑素细胞增殖具有抑制作用,为进一步研究此抗体对黑素细胞生长及色素代谢的影响,以及色素减退性疾病白癜风的发病机制奠定了基础。     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。