RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排监测急性淋巴细胞白血病患儿治疗过程微小残留白血病

目的 研究RQ-PCR检测急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿Ig/TCR基因重排在微小残留白血病（MRD）监测中的作用。方法 以2009年3月至2011年3月在广州市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科确诊和治疗的ALL患儿为研究对象,PCR检测初诊ALL患儿的Ig/TCR基因重排;基因扫描分析初诊患儿Ig/TCR基因重排的克隆特性;对ALL患儿的单克隆性Ig/TCR基因重排进行测序,RQ-PCR检测不同治疗阶段Ig/TCR基因重排的表达量。结果 86例ALL患儿进入分析,男52例,女34例;年龄1~13（4.3±3.0）岁,随访时间1~26（14.3±7.0）个月。①83例（96.5%）检出1种或以上Ig/TCR基因重排,共检出209个Ig/TCR基因重排;②91.8%（56/61例）检出1种或以上单克隆性Ig/TCR基因重排;61例172个Ig/TCR基因重排中,单克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的检出率分别为58.1%（100个）、30.8%（52个）和11.0%（19个）,差异有统计学意义（P=0.000）;③26例完成连续3次随访,其中22例持续完全缓解患儿的Ig/TCR基因重排平均相对表达量持续下降,在维持治疗前均为MRD阴性（≤1.0×10-4）;4例复发患儿在诱导缓解治疗后至复发前各检测时点Ig/TCR基因重排表达量均＞1.0×10-4,并在复发前已有回升,从开始回升至临床复发的平均时间为3.75（2～8）个月。结论 Ig/TCR基因重排相对表达量可反映MRD水平,可作为判断预后、监测复发和指导治疗的有效手段。     

小儿急性淋巴细胞白血病IgH和Vδ_2Dδ_3基因重排的研究

目的 探讨IgH和Vδ2Dδ3基因重排在初诊儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的分布频率及其在中枢神经系统白血病(CNSL)早期诊断与脑脊液(CSF)微量残留病(MRD)监测中的意义。方法 对初诊ALL患者的骨髓标本及不同病期CSF标本采用聚合酶链反应(PCR)检测IgH基因重排和巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测Vδ2Dδ3基因重排。结果 32份ALL患者骨髓标本中有23份存在克隆特异性IgH基因重排和／或Vδ2Dδ3基因重排。在骨髓标本存在异常基因重排的诱导缓解治疗期患儿的23份CSF中,9份检出Vδ2Dδ3基因重排,4份检出IgH基因重排。而完全缓解期患儿的37份CSF中,3份检出IsH基因重排,7份检出Vδ2Dδ3基因重排。结论 在所检初诊ALL患者的骨髓标本中,IgH重排片段的阳性检出率为47％,Vδ2Dδ3基因的阳性检出率为38％;ALL患者脑脊液中ISH和Vδ2Dδ3基因重排的PCR动态监测较CSF常规、生化及细胞学检测更灵敏,更有助于CNSL的早期诊断,对CNSL的预防及预后的判断有指导意义。     

Population-based study of the pattern of molecular markers of minimal residual disease in childhood and adult acute lymphoblastic leukemia: an assessment of the practical difficulty of representative sampling for trial purposes. Northern Region Haematology Group

BACKGROUND: The prevalence, in unselected patients with acute lymphoblastic leukaemia (ALL), of clonal rearrangements suitable for minimal residual disease (MRD) studies has not been formally investigated. PROCEDURE: This was a prospective, demographic study of the frequency of molecular markers of MRD in all patients with ALL presenting over 5 years within the Northern Health Region of England (population 3.1 million). Presentation marrow samples were examined to detect informative markers. RESULTS: One hundred twenty-four children (age <15 years) developed non-Burkitt ALL. No material was available for study in 21. Eighty-six had clonal gene rearrangements (BCR/ABL, immunoglobulin heavy chain (IGH) and/or T cell receptor (TCR) gene rearrangements). All entered remission; 84 (68% of the original cohort) survived to become eligible for MRD studies. One hundred sixteen adults developed ALL, of whom 48 were not studied due to insufficient cellular material in the bone marrow aspirate or to logistical problems in central referral of samples from other hospitals. Material from elderly adults (age >55 years) was less likely to be sent for analysis, 36% vs. 59% (P = 0.024). Thirty-eight had BCR/ABL and/or IGH/TCR gene rearrangements. Thirty-one (27% of the original cohort) entered remission and became eligible for MRD studies. Informative gene rearrangements were more common in children than adults (83% vs. 63%, P < 0.003). CONCLUSIONS: The results reveal substantial potential, unintentional, selection bias. Large-scale multicentre studies of MRD in children may well produce clinically relevant and representative data. Those who mount similar studies in adults should not assume they will be similarly representative or as successful in accrual of material.     

应用半重叠TCR γ特异性引物的PCR方法检测淋巴细胞白血病

采用更加敏感的半重叠式TCRγ特异性引物的PCR方法，对28例ALL初治、CR及BMT患儿进行检测，并用消化煮沸及酚抽提法分别对所有骨髓标本进行DNA提取，将PCR结果进行比较。结果表明：消化煮沸法用于微量标本的DNA提取优于酚抽提法，28例ALL患儿中16例检出TCRγ特异性条带，MRD组18例，阳性检出12例，其中免疫分型标记为B细胞型的4例，占25％，免疫标记为T细胞型者全部出现TCRγ阳性条带。并对该引物的语系特异性及双克隆重排问题进行了理论探讨。     

以免疫球蛋白和T细胞受体基因重排为标志定量检测MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病的微小残留病和预后关系

目的 探讨MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）微小残留病（MRD）与临床特征的关系及其对预后的指导作用。方法 以2003年4月至2009年12月首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心收治的MLL基因重排的ALL患儿为研究对象。以免疫球蛋白和T细胞受体基因重排、MLL融合转录本为标志,定量PCR方法监测MRD水平。以诱导治疗结束时MRD水平≥10-4为MRD阳性组,<10-4为MRD阴性组。卡方检验和Kaplan-Meier生存分析分别比较MRD阳性和阴性组临床特征和无事件生存率（EFS）的差异。结果 14例ALL患儿在诱导治疗结束时检测了MRD水平,MRD阳性组患儿初诊时外周血WBC计数显著高于MRD阴性组,对泼尼松实验治疗反应显著低于MRD阴性组。MRD阴性组5年EFS显著优于MRD阳性组,100% vs （37.5±17.1）%,P=0.022。结论 诱导治疗结束时MRD水平有助于对MLL基因重排儿童ALL进行预后分组,指导个体化治疗、改善预后。     

儿童急性T淋巴细胞性白血病T细胞受体β链基因重排的特点及其在微小残留病定量检测中的意义

目的 建立以T细胞受体p链(TCRβ)基因重排为分子标志定量检测儿童急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)微小残留病(MRD)的实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测体系.方法 应用BIOMED-2欧洲协作组设计的PCR检测体系,检测26例初发T-ALL患儿的TCRB基因重排,并进行序列分析与比对.对其中6例患儿根据基因重排后连接区序列设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)引物,结合胚系TaqMan探针与引物,建立RQ-PCR检测方法,行缓解期标本MRD定量追踪检测.结果 92.3%的T-ALL患儿可检测到克隆性TCRβ基因重排[84.6%具有Vβ-(Dβ)-Jβ完全重排,50%具有DB-Jβ不完全重排].通过序列分析,V片段使用频率最高的家族为BV5、BV6,J区使用频率最高的家族为Jβ2.7,J1.3、J2.4、J2.6未被使用.6例患儿ASO标准曲线的斜率为-3.54～-3.37,截距为19.35～20.51,相关系数＞0.98.定量范围均达到10-4.对随访期标本MRD检测发现,复发患儿的MRD水平在复发前显著升高.结论 以TCRβ基因重排为分子标志对T-ALL患儿行MRD定量检测,具有较高的敏感度和特异性,动态追踪检测随访期标本MRD水平具有重要的临床价值.     

急性淋巴细胞白血病并EB病毒感染的临床分析

目的 探讨EB病毒(EBV)在急性淋巴细胞白血病(ALL)儿童中的感染及其临床意义.方法采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测EBV DNA,ELISA法检测EB病毒衣壳抗原IgM抗体(EBV-CA-IgM),共检测47例.其中新发45例,复发2例;年龄0～14岁[(8.06±3.71)岁].另取14例健康儿童作为健康对照组.男9例,女5例;年龄2～10岁[(7.24±2.54)岁].结合临床表现、诱导治疗骨髓完全缓解(CR)率、形态学CR状态下的微小残留病(MRD)、复发率及无事件生存(EFS)率等分析ALL患儿中EBV感染情况及其临床意义.结果 47例ALL患儿中检出EBV感染15例(31.9%),其中11例(23.40%)检出EBV DNA,EBV DNA水平为(3.28±5.95)×108copy·L-1;14例健康对照组外周血未检测到EBV DNA及EBV-CA-IgM.ALL中EBV感染组与非EBV感染组白细胞数分别为(78.00±58.38)×109 L-1、(27.46±60.10)×109 L-1(t=2.70,P=0.01),诱导治疗CR率分别为 46.7%、87.5%(P<0.01),MRD>10-3分别为90.0%、26.1%(P<0.01),复发率分别为53.8%、13.8%(P<0.01),EFS率分别为 23.1%、82.8%(P<0.01).结论 ALL并EBV感染具有高白细胞数、低诱导治疗CR率、高复发率、低EFS率,提示EBV感染可能参与儿童ALL的发生发展过程,亟待改善EBV感染ALL的治疗方法.     

MRD监测对儿童B系急性淋巴细胞性白血病疗效评估的意义

目的：研究监测微小残留白血病(MRD)在B系急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿治疗中的作用。方法：回顾性研究了2001年9月1日至2005年4月31日,采用ALL-XH-99方案治疗的B系ALL患儿中进行MRD监测的患儿共124例。用四色多参数流式细胞仪监测ALL患儿治疗过程中不同时间点的MRD。结果：在124例进行过MRD监测的B系ALL患儿中,其中MRD<0.01%、0.01%~0.1%和>0.1%的分别有103例、13例和8例,其5年无复发生存率（RFS）分别为（88.9±3.9）%、（70.0±14.5）%和0%,而5年无事生存率（EFS）分别为（82.4±4.4）%、（21.2±18.0）%和0%,两者均P<0.01;将首次CR后半年内MRD检查分成阴性（<0.01％）和阳性两组,其5年RFS分别为（87.7±4.1）%和（58.3±14.2）%,（P<0.01）;5年EFS分别为（80.7±4.6）%和（25.6±13.8）%（P<0.01）;首次CR后半年以后MRD检查阴性和阳性两组的5年RFS分别为（92.0±3.6）%和（48.5±15.5）%（P<0.01）。多因素分析显示结果显示诱导缓解后MRD、泼尼松诱导窗口反应、第19天骨髓象是否达M-1级骨髓象和是否检出BCR-ABL或MLL-AF4融合基因对患儿治疗过程中是否发生复发有预后价值（P<0．05)。结论： 在B系ALL患儿治疗过程中,无论在诱导缓解达到CR时,还是在随后的治疗过程中,监测MRD水平对于评估ALL患儿疗效有重要意义。     

Detection of Minimal Residual Disease in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia After Termination of Therapy

Using 1gH and TCRy gene rearrangements as gene markers, we detected minimal residual disease (MRD) by means of the polymerase chain reaction (PCR) and restriction analysis. Of 18 children with acute lymphoblastic leukemia (ALL), MRDs were detected in 9 patients after termination of therapy. All 18 patients had been followed for 1.5 to 102 months after detection. Three of the nine MRD-positive patients relapsed within 3 to 6 months; none of the nine MRD-negative patients relapsed. We suggest that MRD negativity at the end of therapy might be an important factor for long-term disease-free survival, because the negative cases had a very low risk of relapse. Because the outcome for MRD-positive cases is more difficult to evaluate, patients with MRD after termination of therapy should be monitored.     

应用TCRr基因重排标记对小儿急淋微小残留病定量分析及其临床意义

探索应用ＴＣＲｒ基因重排标志及改良的极限稀释定量ＰＣＲ法检测小儿ＡＬＬ微小残留病（ＭＲＤ）的可行性,探讨其追踪骨髓ＭＲＤ变化的临床意义。方法：改良极限稀释定量ＰＬＲ法。结果：敏感度平均为４拷贝。对１４例初治阳性病人在诱导达到缓解（ＣＲ）时的ＭＲＤ定量检测结果显示,骨髓复发组ＭＲＤ定量值平均为０．３４３％,未复发组为０．００４％（Ｐ＜０．０１）。１４例中６例ＣＲ时ＭＲＤ阴性,４例在追踪期内持续阴性,２例转为阳性（分别为０．０１７％、０．０２０％）,化疗后ＭＲＤ渐减少至转阴;３例ＣＲ时ＭＲＤ平均值为０．０７７％,在缓解期ＭＲＤ值渐减少,其中２例临床持续缓解,１例骨髓无复发但发生睾丸白血病,１例ＣＲ时ＭＲＤ值较高,２例持续高值,２例ＭＲＤ值渐增高,此５例均复发。结论：ＣＲ时ＭＲＤ阳性的病人应持续监测其水平,若持续高值或逐渐增高,复发的可能性大,应加强化疗以防复发。采用极限稀释定量法检测ＡＬＬ的ＭＲＤ有简单、敏感性高的优点。