丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达

目的在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后,构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后,再用痘苗病毒vTF7-3株感染,培养48 h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果Western blotting结果表明,在细胞中检测到相对分子质量为70 000 (NS3)和58 000 (Ns5a)的两条带;免疫荧光试验结果表明,无论采用抗NS3 单抗还是抗NS5a 单抗,大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3蛋白酶抑制剂的研究进展

面对丙型肝炎的流行，至今缺少理想的治疗药物和方案，丙型肝炎病毒（HCV）的非结构蛋白3（NS3）蛋白酶是近年来抗丙型肝炎药物研究的重要靶点。作者综述了NS3蛋白酶抑制剂的作用机制和活性特点。     

转染丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对P53表达的影响

目的了解丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p5 3表达的影响 ,探讨其在肝癌发生中的作用 ,及其发生机制。方法使用脂质体介导法 ,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2 NS4B及突变型p5 3基因重组质粒P5 3 CX2 2AN3进入Chang肝细胞内 ,并用G4 18筛选获得稳定表达细胞 ,分别采用细胞化学法检测p5 3表达率。设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组 ,转染p5 3组、共转染NS4B及p5 3组。结果空白对照组无p5 3表达 ,空白载体组及转染NS4B组呈弱阳性表达 ,转染p5 3组及共转染组呈阳性表达 ,与空白对照组、空白载体组及转染NS4B组比较有显著差异 ,P <0 .0 1。结论NS4B可能抑制突变型p5 3表达 ,也可能阻止其进入细胞核。     

丙型肝炎病毒 人工复制成功

德国美因兹大学的分子生物学者Rblf Bartenschlager及其同事在1999年7月1日出版的《科学》(Science)杂志上报告，他们找到了一种复制部分丙型肝炎病毒(HCV)的方法，这将有助于研究人员了解并有可能寻求治疗该病的新途径。现时全球有约170万人受肝炎病毒的感染，且越来越多地因此而引起肝病。由于HVC不能在实验室里培植，减慢了对其药物、疫苗以及对该病毒生命周期的基础知识的研究。     

丙型肝炎病毒多表位抗原的融合表达及抗原性分析

目的 表达HCV核心蛋白Core、非结构区NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的融合基因,为丙型肝炎病毒的检测提供合适抗原.方法 通过KT-PCK从HCV全长基因组中分别克隆Core、NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达裁体pBVIL-2中.转化大肠杆菌JM109,阳性克隆经42℃热诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.重组蛋白经阳离子交换和分子筛纯化.结果 42℃诱导可高表达分子量约为43 kD的融合抗原,重组蛋白主要以包涵体形式存在.经过纯化目的 蛋白纯度达90%以上的,表达量约为886μg/mL.ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性.结论 HCV复合多表位抗原融合蛋白可作为HCV诊断抗原提供了靶抗原.     

不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达. 方法:用PCR方法扩增基因型为1b型的HCV核心蛋白的全长及3种不同缺失突变的基因片段,对应氨基酸分别为C573:1-191aa,C510:1-59aa 81-191aa,C507:1-169aa,C444:1-59aa 81-169aa. 将其克隆到高效表达载体pRSET-A中构成重组质粒(pRSET-A-C573,pRSET-A-C510,pRSET-A-C507,pRSET-A-C444),转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS. IPTG诱导表达6×His融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定. 结果:经酶切鉴定及测序证实全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体构建正确. 经SDS-PAGE及Western blot显示在Mr约为21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现融合表达条带. 融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20%. 结论:全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达.     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的原核表达及鉴定

【目的】构建丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2基因的重组原核表达质粒，并获得E2蛋白的高效表达。【方法】通过RT-PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCVE2区基因595bp，PCR产物分别经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体PET22b（＋）上，转化大肠杆菌DH5α菌株，获得阳性重组质粒PETB，阳性质粒转化BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Westemblot鉴定。【结果】成功地克隆了HCVE2区基因，构建了其原核表达质粒，并在BL21（DE3）菌中表达HCVE2重组蛋白，Western blot显示表达蛋白具有抗原性。【结论】HCVE2重组蛋白的表达和鉴定为进一步了解HCV糖蛋白E2的功能及其与CD81二者的相互关系打下基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对P53表达的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p53表达的影响，研究其在肝癌发生中的作用及其发生机制。方法：设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组，使用脂质体介导转染法，转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2～NS4B进入Chang肝纠胞内，并用G418筛选获得稳定表达细胞。RT-PCR法鉴定质粒成功转染入肝细胞内，采用免疫细胞化学法检测p53表达率。结果：空白对照组无p53表达，空白载体组呈弱阳性表达，转染NS4B组呈阳性表达，与空白对照组、空白载体组比较转染NS4B组有显著差异（P〈0．01）。结论：丙型肝炎病毒NS4B促进p53表达，可能在丙肝病毒的致痛机制中起到重要作用。     

一株鸭乙型肝炎病毒DHBV全基因的克隆和序列分析

目的 从本地樱桃谷鸭血清中克隆鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA，并进行序列分析。方法 用PCR扩增HBV全基因．连接至T载体上，挑选克隆进行测序分析，与GenBank中16株：DHBV全基因组进行同源性比较，并进行分子进化树分析。结果 24-18与16株DHBV基因组比较，核苷酸同源性介于89．4%-99．3％之间，各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显地方位于P区。结论 24-18属于DHBV西方基因型中的一个亚型。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体，为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因，克隆到pGEM-T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体，Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在，融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论：HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术,扩增出357 bp的HCV核心蛋白基因片段,双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a/HCVc。转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况,Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达;SDS-PAGE电泳显示其在32 000处有一条融和表达条带;Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,而且表达产物有良好的抗原性。     

Effect of immunization in mice with recombinant DNA encoding the hepatitis C virus structural protein

OBJECTIVE: To explore the possibility and the efficacy of immune responses in mice inoculated with recombinant plasmid pCD-HCV1 and to lay a foundation for HCV nucleic acid vaccine development in the future. METHODS: The gene fragment coding C and E regions of HCV-II (type I b) was inserted into pCD-SR alpha 1 expression vector and formed pCD-HCV1 and then was injected into quadriceps muscles of Balb/c mouse. Serum anti-HCV level of mice was tested by ELISA (A value). Spleen cells proliferation responses to HCV antigens were detected by 3H-TdR incorporation (cpm). RESULTS: Balb/c mice immunized with recombinant plasmid pCD-HCV1 three or four times can generate specific antibody responses to HCV antigens and the antibody levels gradually ascend to the plateaus and did not have the trend of descending in 18 weeks detected. The serum antibodies in mice immunized by recombinant plasmid pCD-HCV1 were 100 percent positive when the serum were diluted 40 times and the positive rate of antibody still were 16.6 percent positive when the serum were diluted 320 times. Balb/c mice immunized with recombinant plasmid pCD-HCV1 (100 micrograms, 50 micrograms 10 micrograms/mouse three times respectively) can elicit antibody responses to HCV antigens and the antibody levels of three groups were 0.70 +/- 0.07, 0.33 +/- 0.04 and 0.11 +/- 0.09 respectively. Spleen cells of Blab/c mice injected with pCD-HCV1 three times were induced to produce proliferation responses to HCVc + e specific antigens. CONCLUSIONS: These results demonstrated that constructs expressioning HCV core and envelope proteins can generate anti-HCVc + e specific antibody responses and lymphoproliferation responses in mice, which suggested it to be possible to elicit immune responses to viral epitopes from HCV via DNA immunization with HCV-DNA recombinant and to warrant further investigation as a potential vaccine against HCV infections.     

一株输血传播病毒新变种的克隆和序列分析

目的：从1例不明原因转氨酶升高的病人血清中克隆输血传播病毒（TTV）DNA，并进行序列分析。方法：用巢式PCR扩增TTVDNA长片段，连接至pGEM-T载体上，挑选一个克隆（56－B）进行测序，将56－B与GenBank中五株TTV进行氨基酸和核苷酸序列的同源性分析，并用最大似然法进行分子进化分析。结果：56－B株与TA278等五株TTV序列的核苷酸同源性分别为42．4％，48．2％，47．9％，61．7％，氨基酸序列的同源性更低，但其5'，和3'两端非编码区的序列仍然很保守。结论：56－B株与其他TTV株之间的同源性很低，有很高的基因异质性，是TT的一个新变种，代表TTV的一个新的基因型。     

人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位预测

目的 预测人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位.方法 应用互联网软件分析Hopp&Woods亲水性(Hydrophilicity)、可及性(Accessibility)、极性(Polarity)及柔韧性(Flexibility)、Welling抗原性(Antigencity)和二级结构(Secondary structures)等参数,用吴玉章等建立的B细胞表位预测法综合评价.结果 多种预测法重复了人巨细胞病毒UL23开放阅读框编码蛋白的N端第27～43、104～119、125～160位氨基酸区域内或附近,该区域含有B转角和无规卷曲结构,板可能是B细胞识别表位.结论 为应用合成肽或原核表达大片断蛋白制备抗人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的抗体提供了依据.     

Effect of immunization in mice with recombinant DNA encoding the hepatitis C virus structural protein.

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｍｉｃｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＣＤＨＣＶ１ａｎｄｔｏｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒＨＣＶｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ－Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｃｏｄｉｎｇＣａｎｄＥｒｅｇｉｏｎｓｏｆＨＣＶⅡ（ｔｙｐｅⅠｂ）ｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐＣＤ…