经枕大池神经干细胞移植治疗大鼠创伤性脑损伤的研究

目的 将神经干细胞经枕大池移植到创伤性脑损伤模型大鼠蛛网膜下腔中并观察其存活、迁移和分化,从而为神经干细胞的体内存活、迁移和分化机理研究和临床应用提供实验依据.方法 体外培养BrdU标记的胚胎神经干细胞并应用免疫荧光细胞化学染色对BrdU、神经干细胞标记物nestin的表达进行鉴定:采用Feeney自由落体撞击法制做大鼠脑损伤模型,伤后24 h将BrdU标记的胚胎神经十细胞经立体定向注射移植到蛛网膜下腔;制作大鼠脑绢织石蜡切片,应用免疫组织化学染色检测BrdU、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达;伤前24h、伤后24 h及1、2周行动物运动神经功能评分.结果 免疫荧光检测显示神经球的表面细胞表达nestin及BrdU:免疫组织化学染色检测到脑内损伤灶存在BrdU阳性神经干细胞、MAP2阳性神经元和GFAP阳性胶质细胞;接受神经十细胞移植的大鼠神经运动功能评分的恢复较对照组有明显提高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 经枕大池移植到脑损伤大鼠蛛网膜下腔中的神经干细胞能存活且具有远距离迁移能力,并明显有助于脑损伤大鼠神经运动功能的恢复.     

经枕大池移植神经干细胞治疗重型颅脑损伤大鼠的实验研究

目的探讨胎脑皮质来源的神经干细胞(NSC)用于重型颅脑损伤模型大鼠的治疗作用。方法用电子颅脑损伤仪制备重型颅脑损伤大鼠模型(n=46),随即分为神经干细胞治疗组(NSC组,n=23)和对照组(DMEM/F12组,n=23)。将胎鼠皮质来源的NSC经体外培养、扩增后用BrdU标记,经枕大池移植到模型大鼠的脑脊液中,于移植后24h,3d,7d,14d,21d,28d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(mNSS)的评估。对照组用相同体积的DMEM/F12代替NSC,mNSS评估时间和方法同NSC组。4w后NSC组取5只大鼠脑组织行免疫组化法染色检测BrdU表达。结果 NSC组大鼠在移植后第7d、14d、21d和24d,其mNSS评分与DMEM/F12组相比,均有显著性差异。对脑组织行BrdU免疫荧光染色,发现移植后第4w脑损伤灶及周围脑组织中有BrdU阳性细胞的表达。结论经枕大池移植后,NSC可在大鼠脑组织内存活、增殖,并能促进脑损伤大鼠神经功能的恢复。     

Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的实验研究

目的观察Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对大鼠脑缺血性损伤的治疗作用及对移植的MSCs保护性作用。方法将114只SD大鼠随机分为假手术组、Model组、MSCs组和Bcl-2-MSCs组;线栓法制作大鼠一侧大脑中动脉缺血再灌注模型,MSCs组及Bcl-2-MSCs组在缺血24h后经尾静脉注射方式移植BrdU标记的MSCs及人Bcl-2基因修饰的MSCs;分别于术后1、7、14、28d对各组大鼠进行神经功能缺损评分（NSS）;在脑缺血14d应用TTC法观察梗死灶体积;BrdU和TUNEL免疫荧光双重标记检测移植的MSCs凋亡情况;Westernblot检测大鼠脑梗死周边区Bcl-2蛋白的表达;HE染色观察脑组织病理形态。结果MSCs-Bcl-2组和MSCs组NSS评分、脑梗死体积百分比、TUNEL阳性细胞数较Model组低（P〈0.05）,且MSCs-Bcl-2组比MSCs组更低,BrdU阳性细胞数较多（P〈0.05）;MSCs-Bcl-2组BrdU和TUNEL免疫荧光双标细胞数稍多,但差异不显著（P〉0.05）,而MSCs-Bcl-2组BrdU和TUNEL免疫荧光双标细胞占BrdU阳性细胞百分比明显较低（P〈0.05）。MSCs-Bcl-2组Bcl-2蛋白呈持续较高水平的表达,和MSCs组同时间点相比差异有统计学意义（P〈0.05）。HE染色示MSCs组和MSCs-Bcl-2组脑组织损伤及细胞丢失较轻,MSCs-Bcl-2组更明显,脑梗死周边区均未见到核大、浓染的异形细胞。结论Bcl-2基因修饰的MSCs移植较MSCs移植能进一步改善脑缺血大鼠的神经功能,减少脑梗死体积;其机制为Bcl-2基因修饰使MSCs持续、稳定表达一定量的Bcl-2蛋白,从而能保护移植的MSCs,减少其凋亡,增加其存活。     

骨髓间充质干细胞静脉注射移植对脑缺血大鼠脑内神经细胞增殖和分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）经静脉注射移植对缺血/再灌注脑内神经细胞增殖和分化的影响。方法体外培养和扩增成年雄性大鼠BMSCs;以“四管阻断法”制作大鼠前脑缺血/再灌注模型;造模后3、5、7d通过尾静脉注射Hoechst33342标记的BMSCs（2×10^6/1ml/只）,另设对照组于相同时间点通过尾静脉注射载体溶液。于造模后4周处死大鼠,取脑切片,HE染色观察大鼠海马缺血性损伤情况;BrdU/GFAP、BrdU/MAP2和BrdU/Hoechst33342免疫荧光双标染色,观察大鼠脑内神经细胞的增殖及分化情况。结果BMSCs移植组海马CA1区存活锥体细胞数显著多于载体溶液对照组（P〈0.05）。BMSCs移植大鼠脑内海马结构BrdU阳性细胞数显著多于载体溶液对照组（P〈0.05）,BrdU/MAP-2双标阳性细胞占BrdU阳性细胞的比例显著高于载体溶液对照组（P〈0.05）。结论BMSCs经静脉注射移植能够减轻缺血性脑损伤,促进宿主脑内自体神经细胞增殖,并提高其分化为神经元样细胞的比例。     

神经生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死大鼠的实验研究

目的观察神经生长因子基因(NGF)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑梗死的作用及可能机制。方法采用线栓法制备大鼠脑梗死模型,将符合条件的30只脑梗死模型大鼠按随机数字表法分为模型组(n=10),BMSCs移植组(n=10)和NGF-BMSCs移植组(n=10),分别经尾静脉注射PBS、BrdU标记的BMSCs和NGF-BMSCs各1mL。分别于术后1d、7d和14d采用改良神经功能损害评分(mNSS)对各组大鼠进行神经功能评估,于术后14d应用HE染色观察脑组织病理情况,应用免疫荧光组织化学检测BrdU标记的移植细胞存活状况和TUNEL法检测脑组织中细胞凋亡情况。结果NGFBMSCs组和BMSCs组mNSS评分和TUNEL阳性细胞数较Model组减低(P0.05),且NGF-BMSCs组较BMSCs组更低(P0.05);HE染色显示NGF-BMSCs组和BMSCs组较Model组脑组织损伤及细胞丢失较轻,NGF-BMSCs组更明显;并且NGF-BMSCs组中的BrdU阳性细胞数较BMSCs组增多(P0.05)。结论 NGF基因修饰的BMSCs移植较单纯BMSCs移植能进一步改善脑梗死大鼠的神经功能,其机制为能够促进植入的BMSCs在脑内存活和减轻神经细胞凋亡。     

骨髓基质细胞移植治疗大鼠实验性脑梗死的疗效分析及组织病理学观察

目的 观察大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠脑内移植骨髓基质细胞fBMSCs)的治疗作用,分析植入梗死灶不同区域的BMSCs的存活、迁移情况以及植入细胞的行为与脑内微环境中GFAP阳性细胞的形态关系.方法 75只成年SD大鼠采用随机数字表法分为MCAO组(n=50)和BMSCs移植组(n=25),所有动物均采用线栓法制作MCAO 1 h模型,24 h后BMSCs移植组脑内注射BrdU标记的同种异体BMSCs(2x106个),MCAO组注射等量PBS.MCAO前及MCAO后第1(移植前)、3、5、7、10、14天应用加速转轮试验和贴纸去除试验检测神经功能缺损情况;第14天处死动物,取脑组织切片应用HE染色观察两组的缺血病灶范围,行BrdU和GFAP免疫组化染色观察BMSCs在不同区域和不同胶质细胞环境下的存活和迁移情况.结果 BMSCs移植组MCAO后7 d加速转轮试验结果优于MCAO组,差异有统计学意义(P＜0.05);组织学观察发现植入缺血半暗带区的细胞存活数量最多,且向病变方向放射状迁移,植入缺血病灶核心的细胞甚少存活,且无迁移现象.结论 BMSCs脑内移植可改善MCAO后大鼠神经运动功能;活化的星形胶质细胞构成适合植入细胞存活、迁移的环境,而胶质瘢痕阻碍了细胞的迁移.     

大鼠脑损伤后经枕大池及立体定向脑内移植神经干细胞的对比研究

目的 探讨大鼠脑损伤后,将神经干细胞（neural stem cells,NSCs）经枕大池移植到蛛网膜下腔及立体定向移植到脑内,观察神经功能恢复情况。方法 体外培养的NSCs取自胎鼠皮层,采用Feeney自由落体脑创伤模型制成大鼠脑损伤模型,伤后24小时将NSCs经枕大池移植到蛛网膜下腔及经立体定向移植到脑内。伤前24小时、伤后24小时及1、2周行动物运动神经功能评分。结果 接受NSCs移植的两组大鼠神经运动功能评分均较损伤对照组明显提高（P〈0．05）,两移植组大鼠神经运动功能评分无明显差别。结论 经枕大池移植的NSCs具有远距离迁移能力,并能像脑内移植一样明显有助于大鼠神经运动功能的恢复。     

脐带血间充质干细胞移植对大鼠脑创伤的影响

目的 探讨脐带血间充质于细胞(CB-MSC)移植对脑创伤大鼠的治疗作用及其在体内分化为神经元样细胞的可行性.方法 健康Wistar大鼠采用随机数字表法分为3组:(1)损伤组,开颅钻孔打击脑组织不移植细胞;(2)移植对照组,开颅创伤脑组织后在创伤区注射生理盐水1.25μ;(3)CB-MSC移植组,开颅创伤脑组织后在创伤区注射含CB-MSC混悬液.每组各18只.CB-MSC从脐带血中分离、培养得到,采用BrdU标记.分别于移植后3 d及10 d进行大鼠行为学评分,2周和4周行Y迷宫试验.移植后2周和5周对植人脑内的CB-MSC进行免疫组织化学检测,镜下观察胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.结果移植后10d 3组大鼠行为学评分差异有统计学意义(p<0.05),移植后2周和4周大鼠学习、记忆评分差异亦有有统计学意义(P<0.05).移植后2周和5周在CB-MSC移植组细胞移植区均发现BrdU-GFAP和BrdU-NSE阳性细胞,其他2组均未发现.结论 CB-MSC移植可促进大鼠脑创伤恢复,提高学习和记忆能力,CB-MSC在体内可以向神经元样细胞分化.     

脑皮层创伤灶注射法移植神经干细胞实验研究

目的 观察食蟹猴自体骨髓源神经干细胞移植到大脑皮层创伤灶内的存活、生长情况.方法 取骨髓分离、纯化骨髓基质细胞,培养诱导成神经干细胞,nestin染色表达阳性后再加入细胞标记物BrdU进行共培养7d待移植用.移植前将BrdU标记的神经干细胞收集、离心,制成干细胞悬液,要求活细胞＞80%.食蟹猴在采用Allen's打击法制作皮层创伤灶后,分即时移植(术后即在创伤灶注入,n=3)和延迟移植组(术后30 d在创伤灶注入,n=3),用微量注射针将干细胞悬液注入到猴脑皮质损伤灶.同时设置对照组(n=1),在动物的左侧皮层制作创伤灶并按上述方法注射含同样浓度BrdU的神经干细胞培养液0.5 mL,右侧皮层注入干细胞悬液.移植后1、3、6个月即时移植组、延迟移植组各灌杀1只食蟹猴,移植后6月灌杀对照组食蟹猴,做移植区组织切片染色检查.结果 即时移植组和延迟移植组都可观察到脑皮层创伤灶内有棕褐色的BrdU标记阳性细胞,而对照组组织切片中则未见BrdU阳性表达细胞.移植后BrdU阳性表达细胞早期呈簇状分布,随后散在分布,6个月后细胞形态多样.移植后6个月在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性表达的细胞.结论 移植的骨髓源性神经干细胞在脑皮层创伤灶内有存活并可向邻近区域迁移.     

大鼠骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑损伤

目的了解大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）经鼠尾静脉移植后在脑内的表达情况及对大鼠脑创伤后神经运动功能的影响。方法将溴脱氧尿苷（BrdU）标记培养的BMSCs分别在大鼠脑创伤后第1天（实验组1，n=6）、第3天（实验组2，n=10）、第7天（实验组3，，F7）经大鼠尾静脉注射移植，另取6只脑创伤大鼠（实验组4）在伤后第3天经尾静脉移植BrdU标记的全骨髓，尾静脉注射仅．MEM脑创伤大鼠作为对照组（n=6）。应用免疫组化染色，了解移植细胞在脑内的表达情况。脑创伤后第1、3、7、14天评价移植对大鼠神经运动功能的影响。结果脑创伤后14d时神经运动功能评分分别为实验组1：31．83±1．60，实验组2：31．10±1．79，实验组3：28，43±1．72，实验组4：28．67±1．37，对照组：26．00±1．00．各组间差异有显著性（P=0．000）。在移植各组的创伤侧脑组织，可见BrdU染色阳性细胞，并以脉络丛、脑室周围、血管周围分布较多。对实验组2进行免疫组化双染色，未发现BrdU＋神经元特异性烯醇化酶（NSE1、BrdU＋胶质纤维酸蛋白（GFAP）双染色细胞。结论大鼠BMSCs经鼠尾静脉移植．在一定时期内能改善大鼠脑创伤后神经运动功能；脑内可以发现移植细胞存活．但移植细胞是否转化为神经元仍然需要进一步的实验证实。     

Differentiation and neurological benefit of the mesenchymal stem cells transplanted into the rat brain following intracerebral hemorrhage

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) is often a fatal event. In a patient who survives the initial ictus, the resulting hematoma within brain parenchyma can trigger a series of events that lead to secondary insults and severe neurological deficits. Great efforts have been focused on searching for new approaches to help patients recover neurological function after ICH. Previous studies indicate that mesenchymal stem cells (MSCs) grafted into the ischemic rat brain can improve neurological function. However, there is no report regarding whether MSCs can be used in the same way to improve the neurological function after ICH. We generated the ICH model by injecting collagenase VII into rat brain. Subsequently, 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU)-labeled mesenchymal stem cells were delivered into the brain through carotid artery, cervical vein or lateral ventricle. The distribution and differentiation of MSCs were investigated by methods of immunohistochemistry. We found that MSCs were able to differentiate into neural cells in vitro as well as in the rat brain after ICH. The injected MSCs were able to migrate into hippocampus, blooding foci and ipsilateral cortex. In the hippocampus, MSCs differentiated into neurons; but in surrounding bleeding foci, they differentiated into neurons and astrocytes. In the ipsilateral cortex, MSCs differentiated into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Notably, the motor function of the rats in the carotid artery (CA) group and the lateral ventricle (LV) group improved significantly. Collectively, our study indicates that MSCs are able to differentiate into neural cells in the rat brain after ICH and can significantly improve motor function.     

菲立磁标记兔骨髓基质源神经干细胞自体移植入纹状体后的形态学观察

目的将体外标记的骨髓基质源神经干细胞经单细胞悬液微移植后观察其在兔纹状体的存活、迁移、分化和整合情况，为细胞移植治疗疾病奠定基础。方法分离兔骨髓基质细胞，利用神经干细胞培养基、白血病抑止因子和碱性成纤维母细胞生长因子进行细胞扩增并诱导成骨髓基质源神经干细胞，再经菲立磁和活细胞荧光染料PKH67标记后．采用微移植的方法，通过脑立体定位仪，用微玻璃针将干细胞分别植入兔脑纹状体内。存活1、4、8周后处死动物，组织切片，利用光镜和电镜观察标记细胞在脑内的形态学情况。结果菲立磁标记的兔骨髓基质源神经干细胞经微移植后可在兔脑内纹状体区域存活，移植的干细胞可向周围的脑实质内迁移和整合，迁移细胞沿特定的纹状体结构分布。少量菲立磁标记的干细胞可以分化成神经元。结论骨髓基质源神经干细胞移植后．可在脑实质内存活、迁移、分化和整合，这种细胞可能成为中枢神经系统自体移植的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞在糖尿病创面中向皮肤腺上皮的分化***

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,目前已证实其在急性创面中能够向皮肤组织细胞转化,但在糖尿病创面中的分化报道甚少。 目的：观察糖尿病创面皮肤微环境中的骨髓间充质干细胞分化为皮肤附属器细胞的可行性。 方法：全骨髓法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第三四代细胞行5-BrdU标记。采用一次性腹腔注射链脲佐菌素法建立糖尿病大鼠模型,2周后在模型鼠背部制作圆形创面,取密度为1×109 L-1 5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL注射于创面边缘,分别于细胞移植后2,3周切取创面中央再生组织制备切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色。 结果与结论：BrdU阳性细胞出现在表皮、真皮及皮下组织各层,部分阳性细胞位于皮脂腺及腺导管上皮中;连续切片中BrdU阳性细胞同时也表达角蛋白,以腺导管上皮多见。提示在糖尿病溃疡创面愈合过程中,骨髓间充质干细胞具有向皮肤附属器细胞分化的潜能。     

骨髓基质细胞移植治疗脑损伤研究进展

实验研究已证明骨髓基质细胞(MSCs)可以分化成多种神经细胞，脑实质内直接注射、脑脊液内注射或血管内注射移植后能促进脑损伤修复。血脑屏障的通透性可影响移植细胞进入脑内。MSCs移植的作用机制主要为替代受损细胞和产生内源性因子两种途径。对移植治疗效果的评估可能受到一些因素的影响。虽然仍存在一些尚待解决的问题．但MSCs移植治疗脑损伤是一种很有前途的治疗方法。     

骨髓间质干细胞经静脉移植后在脑缺血大鼠的体内分布与迁移

目的 观察骨髓间质干细胞经静脉移植后在脑缺血大鼠体内的存活、分布及迁移情况,为细胞静脉移植奠定基础。方法密度梯度离心法分离大鼠骨髓间质干细胞(rat bone mescnchymal stem cels,rMSCs),经体外培养并扩增,线拴法制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)脑局灶缺血模型,rMSCs Hoechst33342标记后,通过静脉移植,经过1周、3周、5周后处死大鼠,取脑、心、肺、肾、肝、脾组织切片,在倒置荧光显微镜下观察细胞在体内的存活、分布及迁移情况。结果大鼠脑缺血后,经静脉移植骨髓间质干细胞在脑内能较长时间存活,静脉移植的细胞集中于脑缺血灶周围,而脑缺血对侧及心、肺、肾、肝、脾等组织少有细胞发现。结论rMSCs通过静脉途径进行移植后,能够向损伤部位迁移,与宿主脑组织整合在一起。骨髓间质干细胞经静脉移植用于治疗脑缺血具有可行性。     

Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats

We tested the hypothesis that bone marrow stromal cells (MSCs) transplanted into the ischemic boundary zone, survive, differentiate and improve functional recovery after middle cerebral artery occlusion (MCAo). MSCs were harvested from adult rats and cultured with or without nerve growth factor (NGF). For cellular identification, MSCs were prelabeled with bromodeoxyuridine (BrdU). Rats (n=24) were subjected to 2 h of MCAo, received grafts at 24 h and were euthanized at 14 days after MCAo. Test groups consisted of: (1) control-MCAo alone (n=8); (2) intracerebral transplantation of MSCs (n=8); (3) intracerebral transplantation of MSCs cultured with NGF (n=8). Immunohistochemistry was used to identify cells from MSCs. Behavioral tests (rotarod, adhesive-removal and modified neurological severity score [NSS]) were performed before and after MCAo. The data demonstrate that MSCs survive, migrate and differentiate into phenotypic neural cells. Significant recovery of somatosensory behavior (p<0.05) and NSS (p<0.05) were found in animals transplanted with MSCs compared with control animals. Animals that received MSCs cultured with NGF displayed significant recovery in motor (p<0.05), somatosensory (p<0.05) and NSS (p<0.05) behavioral tests compared with control animals. Our data suggest that intracerebral transplantation of MSCs may provide a powerful autoplastic therapy for stroke.     

Migration and differentiation of nuclear fluorescence‐labeled bone marrow stromal cells after transplantation into cerebral infarct and spinal cord injury in mice

There is increasing evidence that bone marrow stromal cells (BMSC) have the potential to migrate into the injured neural tissue and to differentiate into the CNS cells, indicating the possibility of autograft transplantation therapy. The present study was aimed to clarify whether the mouse BMSC can migrate into the lesion and differentiate into the CNS cells when transplanted into the mice subjected to focal cerebral infarct or spinal cord injury. The BMSC were harvested from mice and characterized by flow cytometry. Then, the BMSC were labeled by bis‐benzimide, a nuclear fluorescence dye, over 24 h, and were stereotactically transplanted into the brain or spinal cord of the mice. The cultured BMSC expressed low levels of CD45 and high levels of CD90 and Sca‐1 on flow cytometry. A large number of grafted cells survived in the normal brain 4 weeks after transplantation, many of which were located close to the transplanted sites. They expressed the neuronal marker including NeuN, MAP2, and doublecortin on fluorescent immunohistochemistry. However, when the BMSC were transplanted into the ipsilateral striatum of the mice subjected to middle cerebral artery occlusion, many of the grafted cells migrated into the corpus callosum and injured cortex, and also expressed the neuronal markers 4 weeks after transplantation. In particular, NeuN was very useful to validate the differentiation of the grafted cells, because the marker was expressed in the nuclei and was overlapped with bis‐benzimide. Similar results were obtained in the mice subjected to spinal cord injury. However, many of the transplanted BMSC expressed GFAP, an astrocytic protein, in injured spinal cord. The present results indicate that the mouse BMSC can migrate into the CNS lesion and differentiate into the neurons or astrocytes, and that bis‐benzimide is a simple and useful marker to label the donor cells and to evaluate their migration and differentiation in the host neural tissues over a long period.     

人脑组织匀浆液诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经细胞

目的 研究人脑组织匀浆液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元细胞分化能力。方法从大鼠骨髓分离培养骨髓间质干细胞．经体外增殖，用人脑组织匀浆液诱导骨髓间质干细胞向神经元样细胞分化，应用免疫细胞化学方法对分化的细胞进行鉴定。结果大鼠骨髓间质干细胞可在体外增殖，经人脑组织匀浆液诱导，骨髓间质干细胞可向神经元样细胞分化，且分化率较高，24小时为45％，48小时为78．2％，72小时为88．3％。分化后的细胞表达神经元标志物-神经微丝(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论人脑组织匀浆液可诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元细胞分化，从而为骨髓间质干细胞脑内移植与及其分化，以及神经功能的修复提供了基础。