厄洛替尼联合RNAi对人肺腺癌A549细胞凋亡及survivin表达的影响

目的探讨厄洛替尼联合survivin siRNA转染对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及对survivin基因的抑制作用。方法选用survivin siRNA转染和厄洛替尼二者单独或联合作用于人肺腺癌A549细胞,作用48 h后采用流式细胞技术检测其对各组细胞凋亡的影响,Western blot法检测其对survivin蛋白表达的影响。结果 survivinsiRNA转染和厄洛替尼二者单独或联合作用于人肺腺癌A549细胞48 h后细胞凋亡均明显增加（P〈0.05）,并且均能明显降低细胞内survivin蛋白的表达水平,联合应用较单独应用促进细胞凋亡作用更显著（P〈0.05）,对sur-vivin蛋白表达的抑制作用更强（P〈0.05）。结论应用siRNA沉默survivin表达可以提高肺腺癌细胞对厄洛替尼的敏感性。     

二甲双胍对肺腺癌耐厄洛替尼细胞株A549ER的耐药逆转作用

目的 探讨二甲双胍对人肺腺癌耐厄洛替尼细胞株A549ER的耐药逆转作用.方法 将人肺腺癌细胞株A549细胞设为亲本组;将耐厄洛替尼细胞株A549ER细胞分为空白对照组、厄洛替尼组、二甲双胍组和联合用药组（厄洛替尼±二甲双胍组）,采用CCK8法检测不同浓度药物作用下各组细胞的50％抑制浓度（IC50）,计算耐药倍数和逆转倍数.采用流式细胞术检测各组A549ER细胞的凋亡率和细胞周期,计算增殖指数.结果 在0 ～ 20 mmol/L浓度范围内,二甲双胍对A549细胞及A549ER细胞均有生长抑制作用,抑制率随二甲双胍浓度升高而增加.厄洛替尼对A549细胞和A549ER的IC50分别为15.15 μmol/L和118.8 μmol/L,A549ER的耐药倍数为7.84.联合用药组A549ER细胞IC50为73.55 umol/L,耐药倍数为4.85.二甲双胍对A549ER厄洛替尼耐药性的逆转倍数为1.62.空白对照组、厄洛替尼组、二甲双胍组和联合用药组的凋亡率分别为（5.53±3.00）％、（7.51±3.73）％、（10.25 ±4.23）％和（16.92±1.20）％.根据细胞周期结果计算空白对照组、厄洛替尼组、二甲双胍组和联合用药组的增殖指数分别为0.84±0.15、0.78 ±0.10、0.73±0.08和0.60 ±0.09.结论 A549ER细胞较A549细胞对厄洛替尼有明显的耐药性;二甲双胍对A549ER细胞厄洛替尼的耐药性具有逆转作用;二甲双胍通过抑制细胞生长、促进细胞凋亡、减缓细胞周期进程等途径逆转A549ER细胞耐药.     

自噬在厄洛替尼诱导的肺腺癌细胞A549凋亡中的作用

目的探讨自噬对厄洛替尼(Erlotinib,特罗凯)诱导的肺腺癌细胞A549凋亡中的影响。方法用厄洛替尼和(或)自噬抑制剂3甲级腺嘌呤(3-MA)处理人肺腺癌A549细胞系,AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色荧光显微镜观察细胞酸性自噬泡的变化;Western印迹法检测自噬相关蛋白Beclin1及凋亡相关蛋白Caspase9的表达。结果流式细胞仪检测示厄洛替尼组、3-MA组、厄洛替尼+3-MA组细胞凋亡率为(56.35±0.71)%、(9.47±0.15)%、(78.40±0.52)%。厄洛替尼组经吖啶橙染色后,细胞内酸性自噬泡明显增加,呈明亮的红色荧光,而加入3-MA联合作用后,则上述现象被抑制。Western印迹结果示对照组、厄洛替尼组、3-MA组、厄洛替尼+3-MA组Beclin1和Caspase9相对灰度值分别为0.54±0.03、0.86±0.03、0.37±0.02、0.70±0.04和0.43±0.03、0.77±0.03、0.57±0.04、0.90±0.02。结论厄洛替尼可以诱导肺腺癌细胞A549细胞系凋亡,并可激活其自噬;3-MA可能通过抑制自噬且上调Caspase9的表达增强厄洛替尼对肺腺癌细胞的杀伤作用。     

培美曲塞与厄洛替尼联合或序贯治疗对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨培美曲塞与厄洛替尼联合或序贯对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法以人肺腺癌A549细胞为研究对象,分别应用培美曲塞与厄洛替尼单药、联合及不同序贯方法干预72 h后,MTT法检测细胞增殖及抑制情况,并计算联合指数(CI),流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及凋亡情况,蛋白质印迹法(Western印迹法)检测磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)及磷酸化-ATK(p-AKT)的表达情况。结果培美曲塞序贯厄洛替尼组(P-E)对A549细胞增殖的抑制率及凋亡率较高,明显高于培美曲塞(P)和厄洛替尼(E)单药组以及厄洛替尼联合(E+P)或序贯培美曲塞组(E-P)(P均0.05)。E组和E+P/E-P组的G1期细胞所占比例较对照组明显增多(P0.05),P组和P-E组的S期细胞所占比例较对照组明显增多(P均0.05)。各药物干预组细胞凋亡率均较对照组明显增高,且P-E组细胞凋亡率明显高于其他组(P均0.05)。P-E组A549细胞p-AKT及p-EGFR的表达水平均明显低于对照组(P均0.05)。结论培美曲塞可有效抑制肺腺癌A549细胞的增殖作用,且与厄洛替尼序贯应用的协同效果更为明显,其作用机制可能与p-EGFR及p-AKT信号通路相关。     

厄罗替尼对肺腺癌细胞凋亡的影响

目的 研究厄罗替尼对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的影响以及对表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达的影响.方法 采用MTT法检测不同浓度的厄罗替尼对A549细胞的增殖抑制作用;以倒置相差显微镜、流式细胞术、TUNEL法及DAPI荧光染色法检测细胞凋亡;以免疫荧光法分析厄罗替尼对EGFR蛋白表达的影响.结果 厄罗替尼抑制A549生长呈时间浓度依赖性;厄罗替尼处理A549后倒置相差显微镜、DAPI及TUNEL均见到明显的凋亡细胞(P<0.05);药物处理组使细胞发生明显的G1期阻滞(P<0.05);TUNEL检测到200 μmol/L厄罗替尼组细胞凋亡率为(42.13±1.4)%,显著高于对照组(0.82±0.03)%(P<0.05);免疫荧光法表明厄罗替尼明显下调EGFR表达(P<0.05).结论 厄罗替尼杀伤A549细胞的机制与介导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G0/G1期及阻滞EGFR信号途径有关.     

肺腺癌A549细胞KDR基因沉默后对厄罗替尼敏感性的影响

目的研究激酶功能区受体(KDR)基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖和对化疗药物厄罗替尼敏感性的影响。方法设计合成KDR的si RNA序列,LipofectamineTM2000转染人A549细胞。RT-PCR和Western印迹检测KDR在干扰后m RNA和蛋白的表达情况,通过流式细胞仪检测细胞周期。MTT法和细胞克隆形成试验观察KDR基因沉默后A549细胞对厄罗替尼的敏感性。结果 KDR基因沉默48 h后,A549细胞的KDR基因和蛋白表达明显降低(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数明显减少(P<0.05)。KDR基因沉默组细胞对厄罗替尼的敏感性显著性增强。结论 KDR特异性si RNA能显著沉默A549细胞KDR基因,抑制细胞增殖,并增强A549细胞对厄罗替尼的敏感性。     

厄洛替尼联合放疗对MKN45细胞株的影响

目的:观察厄洛替尼联合放疗对人胃癌MKN45细胞周期和凋亡的影响,了解厄洛替尼对放疗增敏的作用机制.方法:通过MTT法和集落形成实验,检测厄洛替尼和放射线对MKN45细胞的生长抑制作用,计算出半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)和放射生物学参数平均致死剂量(mean lethal dose,D0)、准阈剂量(quasi-threshold,Dq)值,得出放射增敏比;流式细胞仪检测MKN45细胞经厄洛替尼及联合放射线处理后细胞的凋亡率及周期分布情况;Westernblot法检测厄洛替尼及联合放射线对MKN45细胞的Bax与Bcl-2蛋白表达的影响.结果:厄洛替尼及放射线均能抑制MKN45细胞的生长,随用药浓度或剂量的增高,抑制作用增强(P<0.01).厄洛替尼与放射线联合对MKN45细胞的抑制作用大于单药和单纯照射(P<0.01);两者联合使S期细胞比率明显降低,放射敏感的G2/M期和G0/G1期细胞比率明显增加(71.87±0.77vs60.72±0.26,P<0.01),细胞凋亡率增加;厄洛替尼联合放射线作用于细胞后,Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax蛋白表达则明显增加.结论:厄洛替尼通过增加G2/M和G0/G1期细胞比率,降低Bcl-2、升高Bax蛋白表达,从而降低Bcl-2/Bax比率,增加细胞凋亡,以此提高MKN45细胞的放射敏感性.     

PVT1通过促进肿瘤干细胞特性介导肺腺癌细胞PC9厄洛替尼抵抗

目的探究浆细胞瘤转化迁移基因(PVT) 1对肺腺癌肿瘤干细胞特性及厄洛替尼抵抗的影响。方法慢病毒介导转染PVT1干扰载体si PVT1-1及si PVT1-2下调肺腺癌细胞PC9中PVT1的表达作为干扰A组及干扰B组细胞,转染对照载体为对照组细胞。实时荧光定量PCR(q PCR)技术检测PVT1、CD133和CD44 mRNA的表达水平,Western印迹检测CD133和CD44蛋白的表达水平。CCK-8法检测细胞对厄洛替尼的半抑制浓度(IC50),方差分析及SNK-q检验比较各组指标间的统计学差异。结果干扰A组及干扰B组PVT1、CD133和CD44 mRNA的表达水平均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0. 05)。干扰A组及干扰B组CD133和CD44蛋白表达水平均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0. 05)。干扰A组及干扰B组厄洛替尼IC50显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0. 05)。结论 PVT1可通过诱导肺腺癌细胞干细胞特性的维持促进其厄洛替尼抵抗的发生。     

靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的抑制作用

目的 探讨靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的抑制作用.方法 设计并合成3对靶向HER2基因的siRNA(2621组、1724组、1491组),分别转染肺腺癌A549细胞,同时设阴性对照组及空白组.应用实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测细胞内HER2 mRNA及其蛋白的表达.应用流式细胞术检测卡铂与HER2 siRNA联合应用时肺癌A549细胞的凋亡率.结果 2621组和1724组HER2 mRNA及蛋白表达均低于1491组和阴性对照组.流式细胞术检查显示,各组间细胞凋亡率比较P＜0.01,HER2 siRNA+卡铂组细胞的凋亡率均高于对应浓度的卡铂组.结论 siRNA能抑制HER2基因在肺癌A549细胞中的表达,并与卡铂协同诱导癌细胞凋亡.     

厄洛替尼对人胰腺癌细胞凋亡及survivin蛋白表达的影响

目的 研究厄洛替尼对人胰腺癌细胞PANC-1凋亡及survivin蛋白表达的影响.方法 培养人胰腺癌细胞,培养液中加入不同浓度厄洛替尼,MTT比色法检测PANC-1细胞增殖变化,流式细胞学检测PANC-1细胞的凋亡率;Western印迹检测survivin蛋白的表达情况.结果 厄洛替尼能明显抑制胰腺癌PANC-1细胞的生长,随用药时间的延长和用药浓度的提高,抑制率明显增强(P＜0.05);12.5 μmol/L厄洛替尼作用24、48、72 h的PANC-1细胞凋亡率(％)分别为9.51±1.38,14.50±1.65,16.6±1.89.结论 厄洛替尼通过下调survivin蛋白的表达诱导人胰腺癌细胞PANC-1凋亡,从细胞水平为其抗肿瘤浸润提供了新的治疗思路和实验依据.     

Construction of human Wnt-5a sense gene and RNAi eukaryotic expression vector

ObjectiveWnt-5a is important in the physiological development and differentiation of lung, and is also involved in the regulating proliferation, differentiation and invasion of tumor cells. However, very little is known about the roles of Wnt-5a in the development of lung cancer. The porpus of this study was to explore the role of Wnt-5a in the development of the non-small cell lung cancer, through constructing plasmids containing Wnt-5a sense gene siRNA.MethodsWe constructed the plasmids containing the Wnt-5a sense gene and siRNA eukaryotic expression vector and transfected it into the human lung squamous carcinoma cell line H157 and adenocarcinoma cell line A549. Expressions of Wnt-5a RNA and protein and proliferation of the cells were measured.ResultsExpression of Wnt-5a protein significantly stimulated cell proliferation, and transfection with siRNA plasmids suppressed Wnt-5 expression and cell proliferation.ConclusionThe human plasmids containing Wnt-5a sense gene and siRNA eukaryotic expression vector was successfully constructed, and transfection to human cancer cells induces cell proliferation. siRNA actively suppressed Wnt-5a expression.     

RNAi技术沉默Survivin基因抑制肺癌细胞株H1299增殖并诱导其凋亡

目的　研究RNAi技术沉默Survivin基因对人肺癌细胞株H1299增殖和凋亡的影响。方法 将 Survivin特异性siRNA 表达载体siRNA-Sur转染H1299细胞, 利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,通过Western blot和Realtime-PCR方法检测RNAi沉默Survivin 表达的效果, MTT 法检测RNAi沉默Survivin对H1299细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡。结果　siRNA-Sur转染H1299细胞48h后,细胞的Survivin基因表达明显减少,空白对照组Survivin mRNA的相对表达量为1.0,siRNA-空白对照组为0.98,而siRNA-Sur组为0.32(P<0.01);导致H1299细胞G2期阻滞,空白对照组为23.7% ,而siRNA-Sur组为50.1%(P<0.01);细胞抑制率和凋亡率增加, 转染48h,白对照组凋亡率为5.8%,无关对照组为6.2%,而siRNA-Sur组达50.6%(P<0.01)。 结论　RNAi沉默H1299细胞Survivin基因表达抑制细胞增殖,并诱导H1299细胞凋亡。     

辛伐他汀对非小细胞肺癌细胞增殖和免疫逃逸的影响

目的观察辛伐他汀对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和免疫逃逸的影响,并探讨其机制。方法用改进MTT法检测不同浓度辛伐他汀、RhoA siRNA处理后A549细胞的增殖情况;用Real-time RTPCR检测抗免疫逃逸相关因子即主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHCⅠ,又称HLA-A）和肽转运蛋白（TAP1）的基因表达;用RhoA活性测定法观察RhoA活性变化;用Lipofectamine 2000转染siRNA。结果辛伐他汀能浓度依赖性（10～30μmol/L）地抑制A549细胞增殖,增强HLA-A和TAP1基因表达,抑制RhoA活性（P〈0.05或〈0.01）。用0.1μmol/L RhoA siRNA抑制RhoA活性后,也能显著抑制A549细胞增殖,增加HLA-A和TAP1基因表达（P〈0.01）。但RhoA siRNA联合应用辛伐他汀不能产生协同效应,而与单用RhoA siRNA的作用相似（P〉0.05）。结论辛伐他汀主要依赖于抑制A549细胞的RhoA活性,从而增加HLA-A和TAP1表达,减少免疫逃逸和细胞增殖。     

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对肺腺癌细胞株A549分化和增殖的影响

目的观察4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinoate）对人肺腺癌细胞株A549生长抑制、分化的影响。方法4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯组及全反式维甲酸（ATRA）处理肺腺癌细胞株A549,观察A549细胞生长情况,流式细胞仪进行细胞周期分析,苏木精-伊红（HE）染色观察肺癌细胞形态变化。结果4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯及ATRA具有抑制A549细胞增殖、使细胞周期阻滞于G0／G1期,肺癌A549细胞在,发生了细胞胞体变小、分裂状态的细胞数减少等形态学变化。结论4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯及ATRA使细胞周期阻滞于G0／G1期,从而影响其DNA的合成,抑制其恶性增殖并诱导其分化。     

Lentivirus-delivered ZEB-1 small interfering RNA inhibits lung adenocarcinoma cell growth in vitro and in vivo

Purpose

To explore the relationship between the expression of ZEB1 gene and the proliferation ability of lung adenocarcinoma cells.

Methods

Immunohistochemistry, Western blot and Real-time PCR were used to detect the expression of ZEB1 gene in lung adenocarcinoma tissue and cell lines compared with adjacent noncancerous region and the human lung fibroblast cell HLF cells. The lentivirus RNA interference technique was used to knock down the expression of ZEB1 in lung adenocarcinoma A549 and H1299 cell lines. Cell cycle and cell apoptosis were measured by FCM assay. In vivo, four groups of 4-week-old nude mice were subcutaneously injected with the stably transfected (ZEB-si, scr-si) cells at a single site to investigate the effect of ZEB1-siRNA in the nude mice tumor growth. In situ apoptosis was detection by TUNEL assay.

Results

ZEB-1 was highly expressed in lung adenocarcinoma tissue and cell lines compared with adjacent noncancerous region and the human lung fibroblast cell HLF cells. ZEB1-siRNA could decrease lung adenocarcinoma cell proliferation by delaying S-phase entry and induce cell apoptosis, which led to the inhibition of the tumorigenicity of A549 and H1299 cell lines. Further investigation showed that injecting the ZEB1-siRNA cells into the nude mice could significantly decrease the tumor growth.

Conclusion

Knockdown of ZEB-1 expression by lentivirus-delivered siRNA may provide a novel therapeutic target for the treatment of lung cancer.     

S100A6基因过表达对 A549肺腺癌细胞恶性表型特征的影响

目的：探讨 S100A6基因过表达对于肺腺癌细胞恶性表型的影响。方法构建重组pLeno-DCE-S100A6载体,慢病毒转染 A549肺腺癌细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应和 Western blot 鉴定 S100A6基因和蛋白表达;采用四甲基偶氮唑蓝法、Transwell 和流式细胞仪分别检测细胞增殖、侵袭、细胞周期及凋亡等恶性表型特征。结果转染 S100A6基因的 A549肺腺癌细胞 S100A6 mRNA 和蛋白的表达较空载体对照组和阴性对照组均有明显的上调(P 值均<0.05);细胞增殖和侵袭能力较空载体对照组和阴性对照组增加(P 值均<0.05);细胞周期比例在 G0/G1期与空载体对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P 值均>0.05),在 S 期显著高于其他两组(P 值均<0.05),在 G2/M 期显著低于其他两组(P 值均<0.05);平均凋亡率较空载体对照组和阴性对照组下降(P 值均<0.05)。结论肺腺癌细胞 S100A6基因过表达可增强肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,增加DNA 合成,减弱凋亡等,与肿瘤发生、发展、侵袭及转移等生物学行为密切相关,有望作为肺腺癌诊断和治疗的分子标志物。     

慢病毒靶向溴样结构域蛋白4通过抑制SHH通路对非小细胞肺癌细胞A549能量代谢水平的影响

目的:探究溴样结构域蛋白4(BRD4)siRNA通过SHH通路对非小细胞肺癌细胞A549能量水平的影响。方法:RT-qPCR分析非小细胞肺癌细胞A549、HLF-1细胞内BRD4表达水平;将BRD4 siRNA转入A549细胞内,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和细胞克隆形成实验检测BRD4 siRNA对A549生长增殖的影响;2-[N-(7-硝基苯并-2-氧-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖法(2-NBDG)法和乳酸检测试剂盒检测BRD4 siRNA对A549细胞葡萄糖摄取率和乳酸生成量的影响;RT-qPCR和Western blot检测BRD4 siRNA对基因SHH、胶质瘤相关癌基因同源物1(GLI1)的mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:BRD4基因在A549细胞中上调表达(P0.05);BRD4 siRNA对A549细胞的增殖、克隆形成、葡萄糖摄入和乳酸生成具有抑制作用(P0.05),且能够促进SHH和GLI1基因的mRNA和蛋白表达显著下调(均P0.05)。结论:慢病毒靶向BRD4基因能够通过抑制SHH通路降低非小细胞肺癌细胞A549的能量代谢水平。     

甲状腺结节伴微钙化患者5年内发生恶变的临床研究

目的:探讨甲状腺结节伴钙化患者甲状腺激素与5年内发生恶变的相关性。方法:采用多普勒超声检查仪对427例甲状腺结节伴钙化患者(观察组)和1147例单纯甲状腺结节患者(对照组)定期随访约5年,观察2组患者甲状腺结节恶变情况,并比较2组患者甲状腺激素水平。结果:观察组中有51例(11.94%)患者发生恶变,对照组中有58例(5.06%)患者发生恶变,观察组恶变发生率明显高于对照组(P0.01);观察组患者结节恶变发生在随访后的25.0～75.0个月,恶变中位时间48.5个月,对照组发生在随访后40.0～81.5个月,中位时间66.5个月。观察组恶变时间明显短于对照组(P0.01)。在观察组51例发生恶变的患者中,有48例为微钙化,占94.12%,剩下3例为粗大钙化。2组中,恶变与未恶变患者,在随访前后甲状腺激素(FT_3、FT_4和TSH)水平均无显著差异(均P0.05),患者甲状腺激素与恶变无明显相关性(r=0.217,P0.05)。结论:健康人群中甲状腺结节伴钙化恶变发生率要高于无钙化的单纯甲状腺结节患者,绝大部分为微钙化,且恶变的发生与甲状腺激素水平无关。     

大蒜素对人肺腺癌细胞生长抑制作用的实验研究

目的研究大蒜素对人肺腺癌A549细胞增殖抑制、细胞凋亡的影响。方法用不同浓度大蒜素作用体外培养的A549细胞,采用CCK8法检测大蒜素对A549细胞增殖抑制能力,荧光显微镜观察A549细胞形态学变化,ELISA法测定A549细胞上清液VEGF水平,比色法检测caspase3、caspase9活性变化。结果大蒜素对A549细胞增殖有明显抑制作用,并呈时间及浓度依赖性;24 h、48 h及72 h大蒜素对A549细胞的IC50分别为114.26μg/ml、85.27μg/ml、76.83μg/ml(P<0.05);60μg/ml以上大蒜素作用A549细胞48h可产生显著凋亡特征;随大蒜素浓度增加,A549细胞上清液VEGF水平呈下降趋势,A549细胞caspase3、caspase9蛋白活性显著增加。结论大蒜素能显著抑制A549细胞增殖、诱导其凋亡,可能与VEGF表达下降及caspase3、caspase9激活相关。