mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB／c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT—PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcDNA3．1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1,并经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析对重组子的正确性进行鉴定。结果构建的小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析证明获得了目的基因,其序列与Genbank中登录的小鼠IL-21基因序列完全一致。结论成功构建了。mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体,为IL-21分子的进一步研究奠定了基础。     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

IL-1β反义RNA表达载体的构建及对肝癌细胞中IL-1β水平的影响

目的构建小鼠IL-1β反义RNA表达载体，观察对肝癌细胞中IL-1β表达的阻断效果。方法提取细胞总RNA，RT-PCR扩增IL-1β1和IL—1β2，将其反向连接到肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，构建Pafp IRES2-antilIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体，利用jetPEI转染H22肝癌细胞和YAC-1淋巴细胞，荧光显微镜下观察反义RNA载体的表达，RT—PCR方法分析H22细胞中IL-1β表达水平的变化。结果RT—PCR扩增到两条长度分别为264和284bp的片段，与IL-1β1和IL—1β2相符，将其反向与Pafp IRES2-EGFP连接，经菌落PCR和DNA序列分析证实，获得了PafpIRES2-antiIL-1β1和Pafp IRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体。上述载体转染H22细胞后，荧光显微镜下可见细胞表达出明亮绿色荧光，而YAC-1细胞则未见荧光。RT—PCR分析证实转染反义RNA后H22细胞中IL-1β表达水平明显下降，尤以IL-1β2反义RNA的阻断效果更为显著。结论成功构建了小鼠IL-1β肝癌细胞特异性反义RNA表达载体PafpIRES2-antiIL-1β1，PafpIRES2-antiIL—1β2，两载体能有效地阻断肝癌细胞中IL-1β的表达。     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础.方法 应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞.结果 重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段.与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功.以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中.重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6 介导转染293 包装细胞出现细胞病变效应(CPE).采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断.结论 携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞。结果重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段。与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功。以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6介导转染293包装细胞出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断。结论携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

人野生型survivin-1基因重组载体的构建及其在A549中的表达

目的克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin异构体之一Survivin-1（SVV-1）基因的编码序列，构建含SVV-1基因的真核细胞表达载体并在肺腺癌细胞系A549中高表达，为进一步研究该基因在肺腺癌发病中的作用奠定基础。方法根据已发表的SVV-1基因的核苷酸序列自行设计一对分别合有BamHⅠ和XhoⅠ双酶切住点的survivin-1基因上下游引物，以A549细胞系抽提的R．NA为模板进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR），扩增产物用BarnHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．0中，用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA30-SVV-1和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pcDNA3.0—SVV-1导入肺腺癌细胞系A549中，嘌呤霉素选择培养，经免疫组化法和western blot鉴定其表达。结果RT—PCR扩增出长448bp的特异性片段，经克隆至pcDNA3．0后酶切鉴定证实，并测序表明序列与Gen—Bank报道完全一致。pcDNA3．0—SVV-1在A549细胞中有稳定表达。结论成功克隆了SVV-1的编码序列，构建了其真核细胞表达载体pcDNA3．0-SVV-1，有助于对SVV-1基因在腺癌发生中的致瘤机制做进一步研究。     

hGF—α cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果 以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应（PCR）,扩增hHGF- α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增到了1．34kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386bp,954bp两个片段,分别为EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ／Xho Ⅰ,Xho Ⅰ/BamH ⅠⅠ与pBSKS载体连接重组,对目的基因克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、ⅠBamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、XhoⅠ／BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α386,pBSKS-HGF-α954中切出的386bp,954bp两个片段以EcoR Ⅰ／BamHⅠ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF－αcDNA插入到载体pBV220r EcoR Ⅰ/BamⅠ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS－PAGE显示一分子量与单体hGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论 设计制备了hGF-α链cDNA,克隆建立了hGF-α链原核表达质粒。     

重组人肝细胞生长因子基因的克隆

用RT PCR技术从人胎盘组织内成功地扩增全长肝细胞生长因子 (HGF)cDNA基因 (2 184bp) ,并将其克隆至pGEM T载体 ,经限制性核酸内切酶NdeⅠ ,Bg1Ⅱ ,HindⅢ ,BamHⅠ和XhoⅠ的酶谱分析和DNA测序分析证实。再将其亚克隆至逆病毒载体pLNL XHC ,可进一步用于基因表达和基因治疗的研究     

小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体的构建、表达及意义

目的 构建小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达,为进一步探讨CXCL14对脂肪细胞因子、氧化应激及胰岛素信号转导通路的影响提供工具.方法 从C57/BL胚鼠肝脏组织中抽提RNA,RT-PCR扩增CX-CL14基因片段,并将其插入pcDNA3.1进行测序,鉴定正确构建pcDNA3.1/CXCL14后转染293T细胞,用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白质水平分别检测CXCL14的表达情况.结果 重构质粒经PCR、限制性核酸内切酶Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切以及DNA序列分析鉴定,表明真核表达载体构建正确;以脂质体法转染293T细胞后,RT-PCR、Western blot能检测到目的蛋白表达.结论 成功构建了小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体并能在真核细胞中进行表达.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ的构建及其在PC-3M细胞中的表达

目的：构建人雌激素受体β（hERβ）全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法：采用RT-PCR法从卵巢囊肿患者切除的部分正常卵巢组织中钓取hERβ全长基因（1 593 bp）,与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T-hERβ和表达载体pEGFP-C1分别用Hind Ⅲ和BamHⅠ进行双酶切,应用基因重组技术构建hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染PC-3M细胞。结果：重组质粒经限制性酶切鉴定得到与hERβ全长基因长度一致（1 612 bp）的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的hERβ基因（NM_001437）序列完全一致,表明成功地完成了hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达;PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论：构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,hERβ基因在PC-3M细胞内成功表达。     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯化,前者回收1065bp片断,后者回收大片断,再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接,转化感受态DH5α细胞,挑选单克隆,提取质粒,将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK293T细胞,观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,该质粒能有效地转染HEK293T细胞,目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

白细胞介素-23基因的克隆及真核双表达载体的构建

[目的]通过分别克隆白细胞介素-23（IL-23）基因的双亚基p19和p40,构建pcDNA3-IL-23真核双表达载体,为通过IL-23基因转染树突状细胞（dendritic cell,DC）增强其介导的免疫抗肿瘤作用提供基础。[方法]一步法从小鼠脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA,RT—PCR法扩增p19和p40的cDNA,扩增产物与pMD18-Tvector连接并热转化至大肠杆菌JM109,PCR法筛选阳性克隆,提取质粒并进行DNA的测序鉴定,将pMD18-p19和DMD18-p40分别限制性酶切,在对pcDNA3表达载体限制性酶切后将切胶回收的p19和p40片段分别克隆至pcDNA3．0表达载体,对阳性质粒进行XhoI/KpnI双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳分析。[结果]脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA电泳鉴定是完整的,克隆的p19和p40 cDNA经测序鉴定与Genebank中序列完全一致。构建的pcDNA3．0-p19和pcDNA3．0-p40质粒分别限制性酶切后得到了593bp和1028bp的基因片段;构建的pcD．NA3．0-IL-23表达载体限制性酶切后得到了1．62kbD的p19＋p40片段。[结论]成功克隆了小鼠IL-23基因,并分别构建了pcDNA3-p19、pcDNA3-p40和pcDNA3-IL-23真核表达载体,为IL-23基因转染DC来增强其免疫活性创造了条件。     

人β细胞素基因原核表达载体的构建

目的构建人BTC基因的原核表达载体。方法以人胰岛细胞瘤CDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCK）扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列，克隆入原核细胞表达载体PET32a（＋）中，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCK扩增的特异性片段长度为240bp，以此构建的重组质粒PET32a（＋）-BTC，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5．9kb和250bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中的人BTC基因eDNA（Genbank序列号NM_001729）序列一致。证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a（＋）中。结论成功构建了PET32a（＋）-BTC重组原核表达载体。     

TGF—β1原核表达载体的构建

目的：克隆人TGF—β1基因,为TGF—β1的研究提供平台。方法：应用RT—PCR技术扩增人TGF—β1基因序列,将TGF-β1基因插入载体PET-28a,构建pET28a—TGF—β1重组质粒。结果：经限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,重组质粒PET-28a—TGF—β1序列及阅读框架正确。结论：获得了TGF—β1编码序列和表达载体,能满足进一步实验的需要。     

构建PDCD5基因真核表达载体及电转染BGC823细胞的研究

目的构建PDCD5基因真核表达载体,并电转染BGC823细胞,获得稳定转染细胞。方法设计合成PDCD5基因片段,将其插入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1~+表达载体,菌落PCR和基因测序进行鉴定。重组质粒电转染BGC823细胞,G418筛选数周后PCR鉴定稳定转染细胞。结果重组质粒经菌落PCR测序分析表明,PDCD5基因序列准确插入预期位置,且序列正确。重组质粒成功电转染BGC823细胞,并整合入细胞基因组DNA。结论成功构建了PDCD5基因真核表达载体,并整合进BGC823细胞基因组,为研究PDCD5基因的功能及胃癌的基因治疗提供实验基础。