许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用

目的：观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤舯促进作用，为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据。 方法：实验于2004-04／2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成。纳入普通级雄性Wistar大鼠24只，体质量180-220g。随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组，每组8只。分笼饲养。另纳入5-8d龄spmgue-Dawley乳鼠40只，取其双侧坐骨神经与臂丛神经。实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损。空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损。酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞；许旺细胞与10mm长的脱细胞神经移植物共培养后，应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损。13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况。 结果：Wistar大鼠24只全部进入结果分析，没有脱失。①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀，轴索略粗，髓鞘厚度有差别，部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构，许旺细胞包绕神经纤维，轴索内微丝微管结构较清晰，无髓神经纤维直径较小，不均匀分布在有髓神经纤维之间，由一层纤维结缔包裹形成纤维束，实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄，自体移植组再生神经纤维均较粗，许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘，髓鞘厚薄基本相同。②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形，并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布。许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着。③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率（有髓纤维总面积／神经干总面积）接近自体移植对照组，差异无显著性意义[（5344&;#177;592），（5514&;#177;373）；（3．13&;#177;0．16），（3．19&;#177;0．25）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（57．11&;#177;2．28）％；P〉0．05]；与空白对照组比较差异有显著性意义[（5344&;#177;592），（3191&;#177;236）；（3．13&;#177;0．16），（1．28&;#177;0．33）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（31．05&;#177;4．19）％；P〈0.05]。 结论：与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生，促进神经损伤修复，是临床修复神经缺损的可行办法。     

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复坐骨神经缺损

背景:作者前期已经成功将无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经,并证明可以促进周围神经再生.目的:构建组织工程人工神经,观察和验证桥接大鼠坐骨神经缺损后的神经功能恢复情况.方法:成年雄性SD大鼠60只构建大鼠坐骨神经15 mm缺损模型.随机分成3组,每组20只.桥接大鼠坐骨神经缺损,实验组采用组织工程人工神经,空白对照组采用无细胞组织工程神经支架,自体神经对照组采用自体神经移植.桥接后12周通过大体观察、胫骨前肌湿质量、组织学等方法分析坐骨神经组织学及功能恢复情况.结果与结论:桥接术后12周:实验组大鼠肢体可以支撑着地,钳夹大鼠手术侧足底皮肤出现逃避反射,足底皮肤s.100蛋白染色呈阳性反应.实验组与自体神经移植组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义(P＞0.05).实验组辣根过氧化物酶逆行示踪实验显示脊髓、后根神经节均可见数量不等的辣根过氧化物酶标记阳性细胞.实验组移植物与自体神经移植组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、神经组织面积比较差异无显著性意义.实验结果验证了无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损,可以促进神经组织学的修复重建和功能的恢复.     

骨髓间充质细胞构建组织工程神经修复坐骨神经缺损

背景:许旺细胞是周围神经组织工程的种子细胞,但体外分离、培养、纯化许旺细胞较困难.脱细胞同种异体神经移植物具有较强的修复外周神经缺损的能力,且可诱导骨髓间充质细胞分化为类许旺细胞,理论上骨髓间充质细胞可替代许旺细胞作为种子细胞应用于周围神经组织工程.目的:观察骨髓间充质细胞构建组织工程神经修复坐骨神经缺损的效果,评估骨髓间充质细胞作为种子细胞修复周围神经缺损的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-07/12在大理学院基础医学院实验室完成.材料:将30只SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只.骨髓间充质细胞+异体移植组将骨髓间充质细胞复合脱细胞同种异体神经移植物培养的组织工程神经与两断端用10/0无创线端端吻合;异体移植组将脱细胞同种异体神经移植物桥接;自体移植组将切断的坐骨神经旋转180°端端吻合.方法:运用骨髓间充质细胞构建的组织工程神经修复大鼠10 mm坐骨神经缺损,移植后12周通过坐骨神经功能指数、腓肠肌湿质量恢复率、S-100免疫组织化学染色、电镜等方法观察移植物修复效果.主要观察指标:复合物培养时观察细胞形态的变化;移植后观察坐骨神经功能指数及腓肠肌湿质量恢复率;通过甲苯胺蓝染色观察新生髓鞘形成和轴突生长及神经纤维的分布情况,结合透射电镜及S-100蛋白免疫组织化学染色,观察许旺细胞生长和神经纤维再生情况.结果:坐骨神经功能指数及腓肠肌湿质量恢复率的检测结果显示骨髓间充质细胞+异体移植组优于异体移植组(P<0.05).骨髓间充质细胞+异体移植组复合物中S-100的表达明显高于异体移植组,有髓神经纤维数量、有髓纤维直径和髓鞘厚度均大于异体移植组(P< 0.05),修复效果接近自体移植组.结论:骨髓间充质细胞构建的组织工程神经修复周围神经缺损的效果优于单纯的脱细胞同种异体神经移植物,骨髓间充质细胞作为种子细胞在周围神经组织工程中具有较强的应用价值.     

辣根过氧化物酶逆行示踪评价无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞对坐骨神经缺损大鼠运动神经元的作用

背景:作者前期将无细胞神经移植物与骨髓间充质干细胞复合培养,成功构建了组织工程人工神经.目的:应用辣根过氧化物酶(HRP)神经逆行示踪技术对无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建的神经移植复合体桥接大鼠坐骨神经缺损后运动冲经元的保护作用进行评价.方法:成年清洁级健康雄性SD大鼠,随机分成3组:①实验组:采用复合骨髓问充质干细胞的无细胞神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损.②空白对照组:采用无细胞神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损.⑨自体神经对照组:采用自体神经移植桥接大鼠坐骨神经缺损.术后12刷应用辣根过氧化物酶神经逆行示踪技术对脊髓前角运动神经元的再牛进行评价.结果与结论:术后12周脊髓前角运动神经元再生评价结果显示:实验组优丁无细胞神经移植物组,而与自体神经移植物组相比差异无显著性意义.证实无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复人鼠坐骨神经缺损,对大鼠脊髓运动神经元具有倨护作用,可能达到与自体神经移植相似的效果.     

同种异体移植近期神经再生的实验研究

目的观察犬去细胞异体神经移植的近期神经再生.方法15犬分成去细胞神经移植组6犬、自体神经移植组6犬、新鲜异体神经移植组3犬.坐骨神经5.0 cm长缺损,以3种神经移植物桥接修复.术后6个月行神经再生的组织学观察.结果移植段内大量新生神经纤维,新生血管及许旺细胞;远端胫神经内大量的有髓神经纤维;靶肌肉运动终板的数量、形态及分布良好.去细胞神经移植组和自体神经移植组非常相似.结论化学去细胞神经作为同种异体神经移植物,在修复犬的粗大和长段神经缺损时不会被宿主排斥和吸收,其神经再生与自体神经移植无明显差别.     

同种异体移植近期神经再生的实验研究

目的：观察犬去细胞异体神经移植的近期神经再生。方法：15犬分成去细胞神经移植组6犬、自体神经移植组6犬、新鲜异体神经移植组3犬。坐骨神经5．0cm长缺损，以3种神经移植物桥接修复。术后6个月行神经再生的组织学观察。结果：移植段内大量新生神经纤维，新生血管及许旺细胞；远端胫神经内大量的有髓神经纤维；靶肌肉运动终板的数量、形态及分布良好。去细胞神经移植组和自体神经移植组非常相似。结论：化学去细胞神经作为同种异体神经移植物，在修复犬的粗大和长段神经缺损时不会被宿主排斥和吸收，其神经再生与自体神经移植无明显差别。     

许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损

背景：前期实验已初步证实许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子构建的人工神经具有体外神经活性、趋化性。目的：观察许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复周围神经缺损后神经传导的再通情况。方法：制作SD大鼠坐骨神经缺损模型,随机分组：实验组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复,阳性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合游离碱性成纤维细胞生长因子修复,阴性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层修复,空白对照组以自体神经修复。结果与结论：术后16周实验组再生神经纤维数目,DiI示踪标记的阳性神经元数量、S-100及神经细丝蛋白的阳性表达率、髓鞘及再生轴突的超微结构恢复、神经传导速度及复合动作电位的改善均优于阳性对照组与阴性对照组（P〈0.05）。表明许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子缓释微球构建的人工神经可重建坐骨神经缺损后的神经传导通路。     

许旺细胞及小肠黏膜下层复合生长因子缓释微球修复周围神经缺损

背景:前期实验已初步证实许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子构建的人工神经具有体外神经活性、趋化性。目的:观察许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复周围神经缺损后神经传导的再通情况。方法:制作SD大鼠坐骨神经缺损模型,随机分组:实验组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合碱性成纤维细胞生长因子缓释微球修复,阳性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层复合游离碱性成纤维细胞生长因子修复,阴性对照组以许旺细胞及小肠黏膜下层修复,空白对照组以自体神经修复。结果与结论:术后16周实验组再生神经纤维数目,DiI示踪标记的阳性神经元数量、S-100及神经细丝蛋白的阳性表达率、髓鞘及再生轴突的超微结构恢复、神经传导速度及复合动作电位的改善均优于阳性对照组与阴性对照组(P<0.05)。表明许旺细胞复合小肠黏膜下层及碱性成纤维细胞生长因子缓释微球构建的人工神经可重建坐骨神经缺损后的神经传导通路。     

复合许旺细胞的猪肠黏膜下层桥接修复周围神经缺损

背景：小肠黏膜下层作为一种天然的生物材料,能提供适合神经生长的三维支架,而许旺细胞又在神经再生过程中发挥重要作用。如果能将许旺细胞种植在小肠黏膜下层,用来桥接周围神经缺损,理论上更有利于神经的长入,极有可能获得良好的实验效果。目的：应用复合有许旺细胞的小肠黏膜下层桥接周围神经缺损,观察桥接后神经生长情况。设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-01在深圳市松岗人民医院完成。材料：取健康成年猪的新鲜近段空肠制备小肠黏膜下层。方法：SD大鼠20只随机分成2组,即复合有许旺细胞的小肠黏膜下层桥接组、自体神经移植组。每组10只。首先在距坐骨神经出口1cm处用双面刀片切取1cm长度的坐骨神经,造成神经缺损模型。然后分别用复合有许旺细胞的小肠黏膜下层桥接、自体神经移植桥接。主要观察指标：于术后6,12周自近端缝合口的近端至远端缝合口的远端切取大鼠的坐骨神经,用于病理组织学观察并进行图像分析。同时用生理示波器测定大鼠两侧坐骨神经的潜伏期和诱发电位的波幅。结果：复合有许旺细胞的小肠黏膜下层桥接神经组可见有再生神经组织长过缺损,呈条索状连续,且神经纤维多集中在小肠黏膜下层形成的桥接管周缘区域,而中心区域可见胶原组织且孔隙较多。复合有许旺细胞的小肠黏膜下层桥接神经组潜伏期的延迟率均高于自体神经移植组（P〈0.05）,而诱发电位的波幅恢复率均低于自体神经对照组（P〈0.05）。复合有许旺细胞的小肠黏膜下层桥接神经组轴突的平均直径、单位面积的轴突数量和神经组织所占的百分比均低于自体神经移植组（P〈0.05）。结论：复合有许旺细胞的小肠黏膜下层具有促进周围神经轴突再生的作用,但较自体神经移植略差。     

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损

背景:作者前期试验已成功制备了天然可生物降解的无细胞神经移植物并证明其可促进周围神经再生.目的:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经并观察其修复大鼠坐骨神经缺损促进运动功能恢复的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-06/2009-02在辽宁医学院附属第一医院医学组织工程实验室完成.材料:180～200 g成年健康雄性Wistar大鼠,用于制备无细胞神经移植物,100～120 g成年健康雄性Wistar大鼠,用于制备骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养构建组织工程人工神经.方法:180～200 g成年健康雄性SD大鼠60只构建坐骨神经15 mm缺损模型,随机分成3组,每组20只.①实验组采用组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损.②空白对照组采用组织工程神经支架桥接大鼠坐骨神经缺损.③自体神经对照组采用自体神经移植桥接大鼠坐骨神经缺损.主要观察指标:术后12周通过大体观察、电生理检测、组织学和小腿三头肌湿质量等方法分析评价运动功能恢复情况.结果:①术后12周,实验组大鼠手术侧足趾可以分开,并且可以支撑着地;实验组大鼠再生神经传导速度与自体神经对照组相比,差异无显著性意义.②术后12周,实验组组织化学染色可见腓肠肌内有呈AchE阳性的运动终板整齐地排列于腓肠肌的中上部形成终板带,经结合镀银染色后可见再生的神经束及发出的分支与运动终板相连.③实验组与自体神经对照组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义.结论:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞桥接大鼠坐骨神经缺损具有促进其运动功能恢复的作用.