CRMP4慢病毒载体的构建及其对神经元突起生长的影响

目的 探讨CRMP4对海马神经元突起生长的影响。 方法 利用PCR技术扩增CRMP4目的基因片段,与病毒载体连接,经过PCR、酶切和鉴定后与包装质粒共转293T细胞,制备慢病毒载体,之后感染海马神经元,观察神经元突起生长的变化,并进行定量分析。 结果 扩增出CRMP4目的基因,成功构建CRMP4慢病毒载体,病毒滴度为1.0×107~1.0×108 U/ml;对照细胞转染空质粒后见GFP表达,分布于神经元的胞体和突起,细胞随着发育不断极化,分化出树突和轴突,突起不断延长;过表达CRMP4后,可见神经元的突起延长,分支较对照组增多;定量结果显示,神经元突起总长度包括树突和轴突均较对照组增多,分支数目亦较对照组增多,差异显著（P<0.05）。 结论 成功构建了携带大鼠CRMP4基因的慢病毒表达载体;过表达CRMP4基因可以促进神经元突起的生长。     

坍塌反应调节蛋白5促进海马神经元突起生长

目的 探讨坍塌反应调节蛋白5(CRMP5)对神经元突起生长的作用。方法 构建CRMP5真核表达载体,采用基因转染、实时定量PCR和免疫印迹技术评估CRMP5基因表达;以空载体为对照组,设3个复孔,用时差成像技术和突起提取技术观察和检测原代培养海马神经元突起的生长。结果 成功构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签蛋白的CRMP5的真核表达载体。脂质体转染技术可成功把CRMP5基因导入细胞,转染的细胞CRMP5表达高于空载体对照组;CRMP5蛋白表达于神经元的胞体和突起,尤其是胞体、突起起始处和突起末端高表达。过表达CRMP5可明显促进突起生长,主要表现为突起的生长,并形成丰富的侧枝;定量结果显示,CRMP5过表达的细胞突起的长度逐渐延长,而且较空载体转染细胞增多,差异显著(P<0.01)。导入CRMP5的细胞突起提取液的吸光度较对照细胞明显升高(P.<0.01)。 结论 CRMP5能促进神经元突起及其分支的生长。     

Drebrin在神经元发育过程中的分布变化

目的:探讨肌动蛋白结合蛋白Drebrin在神经元发育过程中的分布情况。方法:采用免疫细胞化学方法检测原代培养大脑皮层神经元内Drebrin的分布。结果:体外培养1天(DIV,day in vitro)时,Drebrin主要分布在神经元胞体;3和7 DIV时,Drebrin分布在神经元胞体、突起末端和分支处;14和21 DIV时,Drebrin主要呈斑点状分布在神经元突起。结论:随着原代培养神经元和树突棘的发育成熟,Drebrin分布从神经元胞体向突起内转移,并逐渐在突起上密集呈斑点状分布。提示在神经元发育过程中,Drebrin表达可能和神经元突起形成及树突棘发育成熟密切相关。     

五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化北大核心

背景:前期各项研究表明,五脏温阳化瘀汤对阿尔茨海默症具有良好的治疗效果,但其药理机制尚未完全阐明。目的:探讨五脏温阳化瘀汤含药血清对阿尔茨海默症细胞模型过氧化物酶体增殖物激活受体γ和磷酸化tau蛋白表达的影响。方法:通过β-淀粉样蛋白干预原代海马神经元细胞建立阿尔茨海默症细胞模型,给予五脏温阳化瘀汤含药血清、盐酸多奈哌齐含药血清干预72 h,采用免疫荧光法检测原代神经细胞树突长度及分支数,Western blot检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ和磷酸化tau蛋白表达。结果与结论:与空白对照组比较,模型组神经元细胞树突长度及分支数明显下降(P<0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达下降,磷酸化tau蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,五脏温阳化瘀汤组与盐酸多奈哌齐组神经元树突长度及分支数增加,过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达升高,磷酸化tau蛋白表达显著下降(P<0.05或P<0.01)。结果表明,五脏温阳化瘀汤对β-淀粉样蛋白干预的阿尔茨海默症细胞模型具有神经保护作用,其机制可能与上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达,抑制Tau蛋白的磷酸化相关。     

Nogo-A在皮层神经元中的亚细胞分布模式研究

目的观察体外不同发育阶段神经元亚细胞组分中Nogo-A蛋白的含量,以及Nogo-A在神经元特化部位的分布特点。方法体外培养的原代皮层神经元,第1天、3天、7天、14天,分别抽提细胞浆、膜组分、细胞核和细胞骨架4个组分,利用Western blot检测不同时间点,各个组分中Nogo-A的含量。利用免疫荧光化学染色考察Nogo-A在树突、轴突、生长锥以及突触部位的分布特点。结果在不同发育时间点,Nogo-A都大量表达于细胞膜和细胞器膜组分,其次为细胞浆。在树突发育的关键阶段1~7 d,细胞核中可见相对分子质量约为80×103的Nogo-A降解片段。定位结果显示,Nogo-A大量分布于神经元的胞浆、树突和轴突,尤其富集于生长锥以及突触结构。结论 Nogo-A丰富表达于和突起生长密切相关的特化结构中。发育早期细胞核中Nogo-A的降解片段可能参与调控树突发育。     

转铁蛋白受体1对小鼠海马神经元生长与分化的影响

目的探讨转铁蛋白受体1(TfR1)对小鼠海马神经元生长与分化的影响。方法取胚胎18.5 d小鼠原代海马神经元培养,培养7 d后使用TfR1 shRNA p GFP-V-RS干扰质粒转染小鼠海马原代神经元使TfR1基因沉默,采用绿色荧光蛋白(GFP)分析及Western blotting技术检测TfR1 shRNA的转染效率;4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及TUNEL法检测干扰后海马神经细胞凋亡情况,免疫荧光技术检测凋亡后神经细胞骨架的变化及神经元突起生长的形态特征。结果 TfR1 shRNA质粒能有效使神经细胞内TfR1基因沉默;TfR1基因沉默后,原代海马神经细胞凋亡率增加,细胞骨架部分崩解,且神经元树突突起长度明显增长(P0.05)。结论转铁蛋白受体1可通过调控小鼠海马神经元树突的生长来影响海马神经元的分化。     

原代培养海马神经元Drebrin和Synaptophysin的表达与动态变化

目的:观察原代海马神经元不同时期树突棘的变化以及树突棘蛋白Drebrin和突触囊泡膜蛋白SYN的表达水平。方法:光镜观察原代培养7、14和20 d的海马神经元的形态改变。应用免疫荧光对Drebrin和SYN进行染色,观察树突棘形态和数量的改变。进一步应用Western Blot检测Drebrin和SYN蛋白的表达变化。结果:培养7 d的海马神经元,未见树突棘结构,SYN斑点状阳性产物较少。随着海马神经元培养时间的加长,突起数量逐渐增加,14 d和20 d的树突棘数量和SYN阳性产物均显著增加。Drebrin和SYN蛋白表达水平也随培养时间的加长而显著增加。结论:原代培养的海马神经元在14 d已有树突棘形成,20 d显示出成熟树突棘的形态和数量。Drebrin和SYN的蛋白表达水平反映了树突棘和突触的形成和功能状态。     

早期应激对小鼠纹状体神经元发育的影响

目的探讨早期应激对背侧纹状体多棘神经元发育的影响。方法通过改变新生小鼠(出生后第2~9天)的生长环境建立早期应激动物模型,采用原位杂交、Golgi染色和体视学分析方法,定量分析应激小鼠背内侧纹状体和背外侧纹状体内神经元胞体、树突和树突棘的改变。结果 9d龄C57BL/6J小鼠的纹状体神经元含丰富的树突分支和树突棘。持续7d的应激主要影响背外侧纹状体,表现为纹状体神经元的近胞体树突分支增多(应激组9.50±0.38,n=8;对照组6.50±0.23,n=6;P0.05),树突分支上含大量丝状伪足(每20μm树突节段:应激组8.15±0.51,n=8;对照组3.85±0.33,n=6;P0.05),但树突棘数量减少(每20μm树突节段:应激组12.05±0.91,n=8;对照组20.02±0.73,n=6;P0.05)。结论早期应激主要干扰背外侧纹状体神经元树突的发育,导致树突棘的成熟延缓。     

牛膝活性提取物对大鼠海马神经元生长的促进作用

目的:研究牛膝活性提取物(ABPPk)对体外培养的大鼠海马神经元生长的促进作用.方法:以体外原代培养的胎鼠海马神经元为模型,通过微管蛋白(β-tubulinⅢ)免疫荧光染色,采用Leica Qwin软件测量不同浓度ABPPk处理24 h对海马神经元突起延伸和突起分支的影响;通过突触结合蛋白(SYN)和突触后致密蛋白(PSD95)双标免疫荧光染色,采用LeicaQwin软件测量ABPPk(250 ng/ml)处理7d对海马神经元突触形成的影响;通过免疫印迹定量分析不同浓度ABPPk作用24 h对海马神经元生长相关蛋白(GAP-43)表达水平的影响,作用7d对PSD-95表达水平的影响,以及ABPPk(250 ng/ml)作用不同时间对磷酸化胞外信号调节激酶(ERK1/2)水平的调节.分析ABPPk对海马神经元的作用与ERK通路的关系.结果:ABPPk可有效促进海马神经元的突起延伸和突触形成,免疫印迹结果显示,ABPPk能显著增加海马神经元GAP-43和PSD-95蛋白表达,作用5 min即能显著上调ERK磷酸化水平,作用15 min ERK磷酸化水平达到峰值,PD98059可抑制该过程.结论:ABPPk能促进体外培养的海马神经元突起生长和突触形成,上调GAP-43和PSD-95蛋白水平,其作用可能与ERK通路的激活有关.     

人参皂苷Rg1通过调节GSK-3β/PP2A活性减轻皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨人参皂苷Rg1是否通过调节GSK-3β/PP2A活性而减轻凝聚态Aβ25～35诱导的胎鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.方法 选用孕期(18±2)d的SD大鼠,分离纯化胎鼠皮层神经元.实验分为阴性对照组、模型组、LiCl处理组、Rg1预处理组.阴性对照组不加任何处理因素;模型组用20μmol/L Aβ25～35作用于皮层神经元12h;LiCl处理组用10mmol/L LiCl和20μmol/L Aβ25～35共同作用于皮层神经元12h;Rg1预处理组分别用5、10、20、40、80μmol/L Rg1预处理皮层神经元24h,再加入20μmol/L Aβ25～35作用12h.通过免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测皮层神经元Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和糖原合成酶3β(GSK-3β)表达水平,通过非放射性免疫法检测皮层神经元蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性.结果 模型组Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均增加,但PP2A的活性不受影响;LiCl处理组和Rg1预处理组,Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均降低(P＜0.05).在Rg1预处理组中,以20μmol/L Rg1预处理后Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的表达水平下降最为明显,而且PP2A的活性明显增强(P＜0.01).结论 人参皂苷Rg1可通过上调PP2A活性和下调GSK-3β活性从而减轻凝聚态Aβ25～35所诱导的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.     

金黄地鼠外侧膝状体背侧核细胞形态学及其投射神经元的确定

用快速 Golgi 法研究了金黄地鼠外侧膝状体背侧核(LGd),观察了核内三种不同形态特征的神经元。第Ⅰ和Ⅲ型神经元分布在 LGd 各部分,第Ⅱ型则常见于 LGd 中份内侧。第Ⅰ型为多极神经元,胞体大,初级树突平滑但分支多,分支上布满了棘状和短柄的圆形树突突起。第Ⅱ型胞体较小,呈梨形。树突常从一主干分出,在树突分叉处分布有丛状树突突起。第Ⅲ型胞体最小。树突数目和分支也较少,但树突突起形态多样,包括如串珠样的树突突起。第Ⅰ和Ⅱ型神经元有轴突,大部分第Ⅲ型细胞则未发现有轴突。用逆行 HRP 法研究了 LGd 的三型神经元与视皮质的联系。视皮质注入 HRP,标记了第Ⅰ和Ⅱ型细胞,而第Ⅲ型神经元则不被标记,说明第Ⅰ和Ⅱ型为投射性神经元。第Ⅲ型为非投射性细胞,推论其可能为局部回路神经元。     

人参皂苷Rg1抑制叔丁基过氧化氢诱导的原代大鼠皮层神经元损伤

 目的：观察人参皂苷Rg1对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的原代大鼠皮层神经元损伤的改善作用,并探讨其可能机制。方法：将神经元随机分为正常对照组、10 μmol/L t-BHP组及10 μmol/L t-BHP+10 μmol/L人参皂苷Rg1组,培养24 h。采用MTT检测不同浓度t-BHP处理的神经元活性,神经元三维重建研究神经元平均总纤维长度及总突起数量,免疫荧光检测caspase-3表达水平及免疫印迹方法检测Bcl-2、caspase-3以及磷酸化糖原合成酶激酶3β (pGSK-3β)蛋白表达水平。结果：10 μmol/L人参皂苷Rg1能够对抗10 μmol/L t-BHP引起的原代大鼠皮层神经元活性水平的降低,并且上调Bcl-2及pGSK-3β蛋白表达量,降低caspase-3活化为cleaved caspase-3的水平(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1可能通过提高GSK-3β自身磷酸化从而增强神经元的抗t-BHP损伤能力。     

4-PBA通过抑制内质网应激减轻原代海马神经元的损伤

目的:探讨内质网应激后原代海马神经元树突棘密度及突触蛋白表达的变化,以及通过内质网应激分子伴侣4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)抑制内质网应激对这种神经元损伤的抑制作用。方法:原代培养新生大鼠海马神经元,将表达增强型绿色荧光蛋白的质粒转染到原代培养5～7 d(DIV 5～7)的大鼠海马神经元内持续培养,DIV 20时分为对照组、衣霉素(tunicamycin,Tm)处理组和Tm+4-PBA预处理组(Tm处理前1 h给予4-PBA),采用Western blot法检测内质网应激标志蛋白Bi P和突触蛋白的表达水平,激光共聚焦显微镜下观察神经元,分析树突棘密度,采用MTT法分析细胞活力。结果:Tm处理后使Bi P蛋白水平明显升高,而4-PBA预处理使Bi P蛋白水平显著下降(P 0. 05)。Tm引起的原代海马神经元树突棘密度下降及突触蛋白的表达下降能够被4-PBA抑制。Tm引起的细胞活力下降可被4-PBA抑制。结论:Tm能够通过诱导内质网应激而引起原代海马神经元树突棘密度下降及突触蛋白表达下降,而提前给予4-PBA预处理可明显降低内质网应激反应,抑制树突棘密度下降及突触蛋白表达下降,从而减轻原代海马神经元的损伤。     

锌对辣椒素激活的神经元磷酸化胞外信号调节激酶表达的影响

目的研究锌对辣椒素激活的原代培养SD大鼠乳鼠大脑皮层磷酸化胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulate kinase,pERK)表达的影响。方法原代培养大鼠乳鼠的皮层神经元,分为4组:对照组(Con,加入等量生理盐水),辣椒素组(N-CAP,加入等量生理盐水,24h后加入辣椒素200μmol·L-1),低锌组(L-CAP,加入氯碘羟喹5μmol·L-1,24h后加入辣椒素200μmol·L-1),高锌组(HCAP,加入氯化锌30μmol·L-1,24h后加入辣椒素200μmol·L-1)。应用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和图像分析技术检测锌对辣椒素刺激的培养神经元中pERK表达的影响。结果辣椒素刺激后,pERK阳性神经元数量显著增多,平均光密度增大,蛋白表达量(免疫印迹)增多(P0.01)。低锌组pERK蛋白表达量明显多于N-CAP组,而高锌组pERK蛋白表达量明显低于N-CAP组(P0.01)。结论高锌抑制辣椒素激活的培养神经元pERK的表达。     

异氟醚激活ERK和HIF-1α产生对神经元缺氧无糖损伤的保护作用

目的　探讨异氟醚预处理在对大鼠皮层神经元缺氧损伤中的保护作用及其可能机制。 方法　建立原代培养的大鼠皮层神经元缺氧无糖损伤（OGD）模型,采用MTT法观察异氟醚对神经元OGD损伤的保护作用,Western blot检测磷酸化ERK（pERK）和低氧诱导因子(HIF)-1α蛋白表达。 结果　异氟醚预处理显著增加OGD损伤神经元中HIF-1α的蛋白含量,ERK抑制剂PD98059可以部分阻断这种作用。 结论　异氟醚预处理对于大鼠原代皮层神经元OGD损伤具有明显的保护效果。其机制可能与通过增加pERK表达,进而调节HIF-1α的表达有关。     

NMDA受体在培养海马神经元树突树上的表面表达及定位

目的　研究NMDA受体在不同发育阶段的培养大鼠海马神经元的表面表达以及在树突结构上的定位。　方法　构建绿荧光蛋白 (GFP)标记的NMDA受体NR1a亚单位的表达载体 (GFP NR1a) ,转染原代培养 5d的大鼠海马神经元 ,用抗GFP抗体和Cy3交联的二抗染色活细胞表面的受体簇。结合青荧光蛋白 (CFP)的共表达突出神经元的结构细节 ,观察表面NMDA受体簇的分布。　结果　GFP NR1a转染的神经元能表达点状、且分布于全细胞的绿荧光NMDA受体簇 ,在成熟神经元的树突上多为表面受体簇。培养 7d和培养 17d的转染神经元树突表面的NMDA受体簇密度并无显著差异。另外 ,培养 7d的海马神经元 ,表面NMDA受体簇几乎都位于树突干上 ,而树突丝上则罕见 ;培养 2周后 ,约一半的NMDA受体簇分布于树突棘。　结论　表面NMDA受体簇的分布具有树突结构相关的特异性 ,尤其是发现在发育早期NMDA受体簇罕见于树突丝 ,却已广泛分布于树突干上 ,且密度相当于成熟神经元。提示在突触形成过程中NMDA受体可能是以预先表达于树突干表面的受体簇形式被新形成的突触所征募     

脑内神经元的树突侧棘与棘突触

<正> 神经元由细胞体、轴突和树突组成。从种系进化来看,动物越高等中枢神经元的树突分支越丰富,扩展的范围也越大。从动物个体发育来看,脑内神经元树突及其分支的形态特征在出生后仍继续形成和发展,大脑皮层锥体细胞的树突即是出生后继续生长的例子。树突分支的形态与排列方式及其伸展范围在不同动物及不同神经元之间有差异,使用特殊的组织染色方法(如高尔基银染色法等)和电镜方法可以显示树突表面的刺状或芽状小突起,这就是侧棘(spines),或简称棘,也称侧芽(gemmules)(图1)。中枢神经元的树突侧棘在系统发生和个体发生中代表着神经元演化与成熟的程度,其功能是接受信息和形成突触连接,     

大鼠外侧膝状体背核的主要突触构筑

外侧膝状体背核(DLG)的突触构成成份主要来自视网膜、视皮质、丘脑网状核的轴突终末和DLG内神经元的突起。视网膜和视皮质来的轴突终末对DLG投射神经元和中间神经元的树突形成非对称性突触,丘脑网状核的轴突终末则对这两类神经元构成对称性突触,而中间神经元树突具有轴突样作用,对投射神经元树突形成对称性突触。这些结果有助于我们了解视觉信息在DLG内的加工处理过程。     

冈田酸诱导大鼠海马神经元Tau 蛋白过度磷酸化

目的研究蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)对海马神经元微管相关蛋白(Tau)磷酸化的影响,建立Tau过度磷酸化的大鼠模型。方法实验随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、OA模型组。模型组又分为OA12h、24h、48h和2周组。OA模型组大鼠海马CA1区背侧定向注射1.5μl溶于10%DMSO的OA,DMSO对照组注射1.5μl10%DMSO溶液。通过Bielschowski染色、免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹分别观察海马神经元形态的改变和磷酸化Tau的表达水平;检测蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,了解其动态变化与Tau磷酸化的关系。结果OA模型各组与正常组和DMSO对照组比较,Bielschowski染色示海马神经元胞体和突起着色较深,欠均匀,部分神经元轴丘处浓染成斑块状,但各模型组均未见到老年斑和神经元纤维缠结样改变;免疫组织化学染色示模型组海马神经元Thr231和Ser199202磷酸化Tau蛋白表达增加,与DMSO对照组相比具有显著意义(P<0.05);蛋白免疫印迹提示OA可引起Tau蛋白Thr231、Ser396和Ser199/202位点发生磷酸化,且不同位点磷酸化的稳定性不同,注射OA48h后PP2A的活性明显降低,其变化与Tau蛋白Thr231和Ser396位点的磷酸化改变相一致。结论海马CA1区背侧单次注射OA可诱导建立神经元Tau蛋白过度磷酸化的大鼠模型。     

Spastin促进海马神经元树突野的形成

目的　探讨微管切割蛋白Spastin对海马神经元树突野形成的作用。 方法　把目的基因转染入原代海马神经元,用免疫荧光显示树突α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体,全细胞膜片钳检测微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）。 结果　过表达Spastin促进树突生长以及分支形成,敲减Spastin抑制树突的生长和新的分支形成,与对照细胞差异有统计学意义（P<0.05）;Sholl分析结果显示Spastin提高树突野的复杂性（P<0.05）;免疫荧光结果显示,过表达Spastin促进AMPA受体GluA2亚基在树突的表达,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）;而敲减Spastin则抑制树突GluA2的表达（P<0.05）;全细胞膜片钳检测显示,过表达Spastin神经元的mEPSCs振幅和频率均增加,敲减Spastin则使mEPSC的幅度和频率降低（P<0.05）。 结论　Spastin促进神经元树突野的形成,而且形成的树突是功能性树突。