神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化研究进展

在帕金森病的细胞移植治疗研究中 ,如何在体外获得足够的多巴胺能神经元一直是一个难以解决的问题。干细胞的研究让人们看到了希望的曙光 ,利用干细胞不仅能在体外大量得到相关的神经元 ,而且也可能解决胎脑移植引发的伦理问题。本文就神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化及相关因素的研究进展作一综述。     

人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的实验研究

目的 探讨人脐血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经元的最佳诱导条件.方法 体外分离、原代培养人脐血干细胞,流式细胞仪检测其表面标志,分别以EGF bFGF、ATRA、ATRA EGF bFGF、纹状体条件培养液、纹状体星形胶质细胞条件培养液对其进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化.应用免疫荧光染色技术检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 比较各组对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用,纹状体星形胶质细胞条件培养液＞纹状体条件培养液＞ATRA EGF bFGF组＞ATRA组＞EGF bFGF组＞对照组.结论 纹状体组织对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用优于其他各组,并且此作用可能主要源于纹状体的星形胶质细胞.     

诱导性多能干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究已成为发育生物学和细胞移植治疗学的研究热点,但伦理及免疫排斥问题一直阻碍胚胎干细胞（ES）的研究和临床应用。近两年,科学家成功地从多种成体细胞获得了诱导性多能干细胞（iPS细胞）,iPS细胞具有和胚胎干细胞相似的特性,由于其可来自自体成体细胞,因而可避开伦理及免疫排斥问题,是胚胎干细胞良好的替代材料,具有广阔的应用前景。iPS只有诱导分化为成熟的功能细胞才能用于疾病的治疗。主要介绍iPS细胞向成熟细胞分化的研究现状及目前存在的一些问题。     

施万细胞诱导共培养骨髓基质细胞向多巴胺能神经元分化

观察施万细胞(SCs)对骨髓基质细胞(BMSCs)的诱导分化作用。分离和体外培养SD大鼠SCs和BMSCs,分为SCs+BMSCs共培养(实验组)和BMSCs单独培养(对照组)。用流式细胞仪(FCM),S100、Brdu/nestin、Brdu/TH免疫荧光法分别鉴定BMSCs、SCs和BMSCs的分化情况。第2代SCs呈S100阳性,第3代BMSCs呈CD29和CD90阳性,CD45阴性。二者共培养3d后,可见Brdu/nestin免疫荧光双标细胞,阳性率达28.3±1.3%,与对照组比较,P<0.05。7d后,Brdu/nestin双标细胞减少,出现Brdu/TH免疫荧光双标细胞,阳性率为19.2±1.6%,与对照组比较,P<0.05。而对照组始终只见Brdu单标细胞。上述结果表明SCs可诱导共培养的BMSCs分化为DA能神经元。     

羊膜对人脐血干细胞分化为多巴胺能神经元的作用

目的 探讨羊膜上皮细胞对人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的作用.方法 体外分离、原代培养人羊膜上皮细胞,通过高速离心制备成条件培养液(CM)对P1代脐血十细胞进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形念的变化,应用免疫荧光染色和免疫印迹法检测其酪氨酸羟化酶(TH)及多巴胺转运体(DAT)蛋白的表达情况.结果 P1代脐血干细胞经羊膜上皮细胞条件培养液诱导后,TH及DAT阳性细胞率明显高于对照组,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),免疫印迹分析结果 与免疫荧光染色结果 一致.结论 羊膜上皮细胞能诱导人脐血问充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元.     

低氧促进hMSCs 向多巴胺能神经元分化

目的观察低氧对体外培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向多巴胺能神经元分化的影响。方法采用细胞免疫化学法、流式细胞分析和高效液相色谱—电化学法,检测多巴胺能神经元的数量以及诱导分化后培养基中多巴胺的含量。结果低氧处理后,低氧分化组酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量明显增多,为常氧分化组的3倍(P<0.01),并且分化后的神经细胞合成的多巴胺(DA)及其代谢产物高香草酸(HVA)含量也高于常氧分化组(P<0.05)。结论低氧可促进hMSCs向多巴胺能神经元方向分化,这为hMSCs临床应用于治疗帕金森病提供了新的思路。     

人羊膜间充质干细胞生物学特征及向多巴胺能神经元样细胞的分化

背景：羊膜间充质干细胞具有类似胚胎干细胞多潜能的特点,在再生医学等多种领域的临床应用具有广泛的实用性和明确的良好前景。 然而,目前对于羊膜间充质干细胞的生物学特性和分化潜能的认识仍然了解甚少。目的：建立体外分离和纯化人羊膜间充质干细胞的方法,检测羊膜间充质干细胞的体外分化特点,确定羊膜间充质干细胞在体外诱导条件下向多巴胺能神经元样细胞分化的潜能。方法：采用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ分步消化法从羊膜中分离羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞;采用percoll梯度离心方法对羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞进行纯化;流式细胞术检测羊膜间充质干细胞的表面标志,确定羊膜间充质干细胞细胞表面抗原的表达特征;对体外培养的羊膜间充质干细胞进行成脂肪和成骨诱导,确定其多向分化的潜能;采用神经细胞条件培养体系诱导羊膜间充质干细胞向多巴胺神经细胞分化,通过免疫荧光染色和激光共聚焦荧光显微镜观察和鉴定诱导后多巴胺神经元样细胞的生成。结果与结论：从羊膜组织成功分离、纯化和培养出羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞。羊膜来源的间充质干细胞不仅具有典型的间充质干细胞标志,而且保留了一些胚胎干细胞的OCT-4,SOX-2和KLF4等特有干细胞标志,可以诱导分化成为脂肪细胞和骨细胞,显示羊膜间充质干细胞保持了较为原始的胚胎干细胞的特点,具有多向分化的潜能。诱导分化之前的原代羊膜间充质干细胞表达固有的多种神经细胞标记,体外诱导后羊膜间充质干细胞可分化成为β-微管蛋白Ⅲ、神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白和巢蛋白等阳性表达的多巴胺能神经元样细胞。结果表明人羊膜来源的间充质干细胞所保留的多向分化潜能和有效分化成为多巴胺能神经元样细胞的特性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

无血清培养条件下诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向分化的实验研究

目的 寻求无血清、无饲养层细胞存在的情况下,胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的最佳条件。方法 采用阶段诱导的方法,在不同阶段加入不同的生长因子,对新近分离的胚胎干细胞进行分化培养。首先向无血清培养液中分别加入bFGF和LIF,实现由胚胎干细胞向神经前体细胞的定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定;在此基础上,撤除bFGF和LIF,加入B27无血清培养基、IL-1后继续培养,实现由神经前体细胞向多巴胺能神经元的定向诱导分化;通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色对多巴胺能神经元进行鉴定。结果 有85％的细胞团呈nestin免疫阳性着色,多巴胺能神经元的分化比率为13％,较多巴胺能神经元的自然分化比率(4％)有明显提高。结论 在无血清、无饲养细胞的情况下,我们采用阶段诱导的方法,在不同的阶段加入不同的生长因子,可有效诱导多巴胺能神经元的分化,使胚胎干细胞的诱导分化过程更易于操作。     

AngⅡ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的时间效应

目的:体外分离培养神经干细胞(NSCs),探讨血管紧张素II(AngII)诱导NSCs向多巴胺(DA)能神经元分化的时间效应。方法:取第二代NSCs在含有AngII的诱导分化液中培养,根据诱导持续时间不同,分为A(10d),B(14d),C(17d)和D(21d)四组。终止诱导后,用免疫学法检测分化细胞中DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达,半定量-PCR测定THmRNA的相对表达量。结果:在AngII作用下,B,C组分化细胞数量均比A组增多,细胞胞体饱满,突起粗长,而D组细胞部分开始老化、脱壁悬浮。其中,C组TH阳性细胞率最高(15.64%),且THmRNA相对表达量(0.5047±0.0212)明显高于其他三组(P0.05)。结论:AngII诱导NSCs分化成DA能神经元存在分化的时间效应,诱导持续达17d时分化细胞中DA能神经元的比例最高。     

体外诱导干细胞向多巴胺神经元分化的研究进展

由于传统的药物和手术方法不能够延缓帕金森病的发展,细胞移植替代多巴胺神经元的治疗方案受到越来越多的关注.许多体外实验证实不同的诱导方案均可以促进干细胞分化为多巴胺神经元,通过对近几年的体外实验结果进行综述,有利于探讨诱导方法和细胞来源的选择,促进干细胞移植技术转化应用于帕金森氏病的临床治疗.     

人诱导性多能干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 观察人诱导性多能干细胞（iPS细胞）定向分化为神经干细胞（NSCs）的潜能。方法 用维甲酸（RA）诱导人iPS细胞向NSCs分化。倒置显微镜下观察iPS细胞的形态变化,RT-PCR检测NANOG, OCT4, SOX2的表达;免疫组织化学方法检测NESTIN、SOX2、β-TUBULIN Ш和GFAP的表达。结果RA诱导后第4天,贴壁的拟胚体出现了早期神经祖细胞特有的神经管样结构并不断增多,细胞表达神经巢蛋白NESTIN,而对照组未观察到神经管样结构。神经管样结构内的细胞能分化为β-TUBULIN Ш阳性的神经元,但GFAP阳性的星形胶质细胞少见。结论 人iPS细胞具有定向分化为NSCs的潜能,并能模拟神经发育过程。     

阿尔茨海默病患者尿液细胞向诱导多能干细胞及神经细胞的诱导转化

目的:获得阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法:选取3例临床诊断明确的AD病例,收集病人尿液,分离出尿路上皮细胞,对所得细胞进行原代培养。利用电转染的方法将带有Oct4、Sox2、Klf4和SV40LT的质粒导入原代细胞内,将其重编程为i PS细胞。随后利用双向抑制Smad通路的方式继续诱导其神经分化。结果:AD病人尿液来源的细胞(以下称为尿液细胞)均成功诱导成i PS细胞,其诱导效率与正常人来源的细胞无明显差异。且病人的i PS细胞可成功分化为神经细胞,分化效率亦与正常人来源细胞相近。结论:阿尔茨海默症患者来源的尿液细胞可重编程为i PS细胞,所得到的i PS细胞可成功分化成有功能的神经元以及神经胶质细胞。     

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为神经元的体外实验研究*

 目的： 探讨源于小鼠的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）体外定向分化为神经元的方法,为大量稳定地获得神经元及提供种子细胞治疗脊髓损伤奠定体外实验基础。方法: 源于小鼠的iPSCs在不同的诱导培养基中经悬浮、贴壁、再悬浮和再贴壁培养。免疫荧光检测iPSCs多能性标志物、神经干细胞及其分化细胞标志物的表达。RT-PCR检测神经元及胶质细胞基因表达并行神经元基因测序鉴定,流式细胞术检测iPSCs定向分化为神经干细胞及进一步分化为神经元的比例。结果: 源于小鼠的iPSCs表达干细胞多能性标志物Sox2、Oct4和SSEA1。悬浮培养可以形成类球形拟胚体;经诱导及机械分离后的细胞可形成神经球,神经球经诱导后可分化为神经元。免疫荧光显示iPSCs可诱导出表达nestin的神经球,贴壁培养的神经球可分化为分别表达微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）及髓磷脂碱性蛋白(MBP)的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。RT-PCR及基因鉴定结果显示形成小鼠神经元;流式细胞术检测结果显示分化细胞中神经干细胞和神经元的比例分别为63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。结论: 源于小鼠的诱导多能干细胞能够稳定地在体外定向分化为神经元,为脊髓损伤的治疗提供了一个可靠的细胞来源。     

人诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的现状与未来

BACKGROUND:The emergence of human induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived dopaminergic neurons solves the problem that the embryonic stem cell (ESC) shows an ethical issue on its source, providing a promising cell source for treatment of Parkinson’s disease. OBJECTIVE:To summarize the differentiation methods of iPSCs-derived dopaminergic neurons in vitro, the choice of Parkinson’s disease models and the transplantation of iPSCs-derived dopaminergic neurons in the Parkinson’s disease treatment. METHODS: In order to search relevant articles about the application of iPSCs-derived dopaminergic neurons in the Parkinson’s disease models from PubMed databases (from 1980 to 2015), a computer-based search was performed by the first author, using the key words of “iPSC and Parkinson’s disease, induced pluripotent stem cells and Parkinson’s disease, ES cells and Parkinson, PD model, Parkinson and Lewy bodies” in English. Finally 40 articles were chosen for further analysis. RESULTS AND CONCLUSION:Here, this paper is detailed to show the research status of human iPSCs-derived dopaminergic neurons for treating Parkinson’s disease by reviewing the sources and in vitro differentiation schedules of iPSCs as well as the choice of Parkinson’s disease models and outcomes of transplantation of iPSCs-derived dopaminergic neurons for Parkinson’s disease treatment. According to the Parkinson’s disease mechanism of the Lewy body, we analyze the generation mechanism of the Lewy body, providing references to avert the presence of Lewy bodies and optimize the outcomes of transplantation. The improvement of differentiation conditions of iPSCs can markedly improve the behavior outcomes, and moreover, we can systematically evaluate the outcomes of transplantation by iconography and immunohistochemical results.     

影响多巴胺能神经元体内外分化的因素

帕金森病是神经系统变性疾病,以黑质多巴胺能神经元变性缺失为特征。现在,人们通过对多巴胺能神经元体内外分化条件的研究,获得利于其分化和存活的最佳条件,为帕金森病的细胞替代治疗提供充足的多巴胺能神经元。本文对体内外神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化的影响因素做一综述。     

转染胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞分化

背景：神经干细胞为神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径,解决其定向诱导分化问题仍是目前的研究热点。 目的：探讨转染胶质细胞源性神经营养因子基因诱导大鼠胚胎神经干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化的作用。 方法：构建PcDNA3-GDNF-GFP表达质粒,用脂质体介导该质粒转染大鼠胚胎神经干细胞并进行诱导分化,荧光显微镜观察转染情况,免疫荧光染色检测β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶表达。 结果与结论：胶质细胞源性神经营养因子基因转染后3 d,可观察到细胞呈绿色荧光细胞球状。诱导分化7 d,神经干细胞分化为神经元以及多巴胺神经元的比例明显增高。结果表明胶质细胞源性神经营养因子基因可以促进神经干细胞向神经元以及多巴胺能神经元分化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程