AmpC β-内酰胺酶实验室检测方法及进展

随着超广谱β-内酰胺类抗菌药物广泛应用于临床,越来越多耐药菌株的产生给临床治疗带来极大挑战,尤其是产AmpC酶的耐药菌株。近几年质粒介导的AmpC酶相继在世界各地被发现[1,2],在康复中心、养老院、社区等院外感染产AmpC酶耐药菌株的病例也不断被报道[3,4],人们越来越认识到产AmpC酶的耐药菌株的危害性。因此,实验室对其     

多底物协同-拮抗法同时检测超广谱β-内酰胺酶和AmpC β-内酰胺酶

目的建立一种能同时检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC β-内酰胺酶(AmpCs)的简便、实用的方法.方法应用"多底物协同-拮抗法"(MSSAT)检测30株阴沟杆菌(E.cl)和42株不动杆菌(Aci)的ESBLs和AmpCs.结果 MSSAT法检出各种ESBLs产酶株53株(E.cl 25株,Aci 28株);各种AmpCs产酶株52株(E.cl 19株,Aci 33株),其中高诱导型10株(E.cl 8株,Aci 2株),部分去阻遏型12株(E.cl 5株,Aci 7株),完全去阻遏型30株(E.cl 6株,Aci 24株);同时产ESBLs+AmpCs产酶株37株(E.cl 15株,Aci 22株),其中ESBLs+高诱导型4株(均为E.cl),ESBLs+部分去阻遏型6株(E.cl 5株,Aci 1株),ESBLs+完全去阻遏型27株(E.cl 6株,Aci 21株).结论 MSSAT法能同时检测ESBLs+AmpCs及其不同型,且准确、简便、实用.在同时产ESBLs+AmpCs的细菌中,E.cl以产诱导型AmpCs为主,Aci则以产非诱导型AmpCs为主.同时产ESBLs+AmpCs的细菌大部分取自痰标本.     

医院感染病原菌AmpC与超广谱β-内酰胺酶检测

目的 了解医院感染病原菌中革兰阴性杆菌产AmpC与超广谱p内酰胺酶(ESBLs)的情况.方法 用改良的头孢西丁三维试验和头孢曲松三维试验检测持续高产AmpC β-内酰胺酶和ESBLs.结果 医院感染病原菌中革兰阴性杆菌持续高产AmpC β-内酰胺酶,产酶率为16.00%,其中单独产AmpC β-内酰胺酶的产酶率为8.84%,以阴沟肠杆菌、褪色沙雷菌和产气肠杆菌产酶率高(36.00%、31.25%和28.00%);同时产ESBLs的检出率为7.16%,以鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌阳性率高(15.18%、10.60%和8.74%).结论 医院感染菌株产酶率较高,应引起临床高度重视.     

超广谱β-内酰胺酶及AmpC酶研究进展

革兰阴性杆菌耐药机制复杂，发展迅速，按照与临床紧密结合的BJM分类，β-内酰胺酶(BLA)中主要为染色体和质粒介导的Ⅰ型AmpC酶和Ⅱ型中的超广谱β-内酰胺酶。随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用，菌株产生新的BLA并可引起流行，故其检测受到临床重视。     

南京地区鲍氏不动杆菌AmpC酶、β-内酰胺酶基因研究

目的了解南京地区多药耐药鲍氏不动杆菌（ABA）临床分离株AmpC酶和β-内酰胺酶基因存在状况。方法自2007年7-10月南京地区住院患者标本中分离出20株多药耐药鲍氏不动杆菌,微量肉汤稀释法测定11种抗菌药物的敏感性,聚合酶链反应（PCR）法测定多药耐药鲍氏不动杆菌2种AmpC酶及18种β-内酰胺酶基因。结果20株ABA AmpC染色体型基因阳性14株（70.0%）、AmpC质粒型基因阳性1株（5.0%）;TEM基因阳性12株（60.0%）、SHV基因阳性1株（5.0%）、CTX-M-1群基因阳性2株（10.0%）、OXA-23群基因阳性1株（5.0%）、OXA-24群基因阳性1株（5.0%）,经测序BLASTn比对为OXA-72型;16、17号株测得AmpC（染色体型）DNA序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的AmpC（染色体型）序列比较分别有两个和1个氨基酸差别,均为新亚型。结论南京地区ABA除可携带TEM、VEB、GESI、MP、VIM、OXA-10、OXA-23基因外,还可携带AmpC染色体型及AmpC质粒型、SHV、CTX-M-1群、OXA-24群基因。同时进行AmpC活性与AmpC染色体型、质粒型基因配对检测为国内首次。     

多底物协同-拮抗法同时检测超广谱β-内酰胺酶和AmpC1β-内酰胺酶

目的 建立一种能同时检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpCβ-内酰胺酶(AmpCs)的简便、实用的方法。方法 应用“多底物协同-拮抗法”(MSSAT)检测30株阴沟杆菌(E．cl)和42株不动杆菌(Aci)的ESBLs和AmpCs。结果 MSSAT法检出各种ESBLs产酶株53株(E．cl25株，Aci28株)；各种AmpCs产酶株52株(E．cl19株，Aci33株)，其中高诱导型10株(E．cl8株，Aci2株)，部分去阻遏型12株(E．cl5株，Aci7株)，完全去阻遏型30株(E．cl6株，Aci24株)；同时产ESBLs AmpCs产酶株37株(E．cl15株，Aci22株)，其中ESBLs 高诱导型4株(均为E.cl),ESBLs 部分去阻遏型6株(E.cl5株，Aci1株)，ESBL.s 完全去阻遏型27株(E．cl6株，Aci21株)。结论 MSSAT法能同时检测ESBLs AmpCs及其不同型，且准确、简便、实用。在同时产ESBLs AmpCs的细菌中，E．cl以产诱导型AmpCs为主，Aci则以产非诱导型AmpCs为主。同时产ESBLs AmpCs的细菌大部分取自痰标本。     

临床常见持续高产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampD及其突变的研究

目的检测临床常见AmpCβ-内酰胺酶产酶菌株中染色质ampD及其高概率突变位点。方法41株临床常见AmpCβ-内酰胺酶产酶菌株(阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌)分离自医院感染患者样本,头孢西丁三维试验确定持续高产产酶类型,经抽提细菌染色质DNA,PCR法扩增ampD基因并连接入pMD19-T载体,双链测序后与同种非突变标准菌株的ampD序列比对,得到高概率突变位点。结果41株细菌的基因组中,使用PCR法扩增出染色质ampD基因有36株,并成功测定了其ampD基因的序列;并且统计出突变率50.00%的位点,其中阴沟肠杆菌有62个,肺炎克雷伯菌1个,鲍氏不动杆菌23个,铜绿假单胞菌4个。结论ampD基因不伴随ampC基因同时存在;ampD基因的高概率突变位点可能成为致持续高产酶的关键位点。     

抗菌药物对阴沟肠杆菌诱导型AmpC β-内酰胺酶向持续高产型转变的影响作用

目的 了解抗菌药物对阴沟肠杆菌由诱导型AmpCβ-内酰胺酶向持续高产型转变的影响作用.方法 观察临床应用抗菌药物前后阴沟肠杆菌由诱导型AmpC β-内酰胺酶向持续高产型转变的转变率.结果 60株诱导型产酶的阴沟肠杆菌,有8株转变为持续高产型,转变率为13.3％;应用头孢菌素类、喹诺酮类、碳青霉烯类和头孢菌素类+β-内酰胺酶抑制剂的患者,阳性转变率分别为16.7％、11.1％、10.5％和20.0％.结论 阴沟肠杆菌易受抗菌药物的影响发生突变,转变为持续高产型.     

产超广谱β-内酰胺酶阳性主要非发酵菌AmpC酶的检测及其耐药性分析

目的 检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性主要非发酵菌的AmpC酶,了解其耐药性.方法 利用头孢西丁三维试验检测受试菌的AmpC酶,双纸片增效试验确证ESBLs.结果 共分离出3351株非发酵菌,其中ESBLs阳性非发酵菌657株,检出率为19.61％,分离的前3位ESBLs阳性非发酵菌依次是铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌和洋葱伯克霍尔德菌,分别占32.72％、24.51％、12.02％;657株ESBLs阳性非发酵菌中,检出同产AmpC酶193株,检出率为29.38％,其中铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌为产超超广谱β-内酰胺酶(SSBL)的主要菌株,其在ESBLs阳性菌株中的检出率分别为40.47％、34.78％和37.97％ ;SSBL菌株中铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌,除亚胺培南、美罗培南外,对其他抗菌药物的耐药率均＞50.00％,洋葱伯克霍尔德菌的耐药率较高,均＞50.00％.结论 产SSBL非发酵菌的耐药性强于单产ESBLs菌株,进行ESBLs阳性非发酵菌AmpC酶的检测及其耐药监测,可以指导临床合理使用抗菌药物.     

阴沟肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶与AmpC酶基因及其流行病学研究

目的分析医院2008-2010年临床分离阴沟肠杆菌产ESBLs和AmpC酶及其对抗菌药物的耐药性,并了解其耐药基因的传播机制。方法采用改良三维试验筛选AmpC酶,双纸片扩散法检测ESBLs,聚合酶链反应(PCR)检测ESBLs和AmpC酶的基因,采用微量肉汤稀释法分析细菌耐药性,质粒接合试验分析耐药基因的传播特点。结果同时产ESBLs和AmpC酶菌株对三、四代头孢菌素及含酶抑制剂药物的耐药率均>50.0%;45株改良三维试验阳性,14株ESBLs确证试验阳性,ESBLs和AmpC酶的基因阳性者分别为25、38株,分别以TEM-1型、MIR-3型为主,其次为CTX-M-3、DHA-1型,SHV-11型广谱β-内酰胺酶2株,未检测到CIT、MOX、FOX、ACC型AmpC酶的基因,5株接合试验成功。结论阴沟肠杆菌主要携带TEM-1型广谱β-内酰胺酶、CTX-M-3型ESBLs和MIR-3型AmpC酶,耐药现状严重,应采取积极有效的措施预防多药耐药菌株的播散与暴发流行。     

肺炎克雷伯菌产ESBLs和AmpC酶的检测及其质粒分析

目的了解武汉地区分离的肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶的发生率、耐药情况及质粒型耐药基因。方法从该地区3家医院的重症监护病房(ICU)分离获得38株肺炎克雷伯菌,采用E-test法进行最低抑菌浓度(MIC)测定;以美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的双纸片协同试验和确证试验检测ESBLs;酶提取物三维试验检测AmpC酶;质粒接合和消除试验检测耐药基因。结果产ESBLs的肺炎克雷伯菌检出率为71.05%(27/38);产AmpC酶的肺炎克雷伯菌检出率为13.16%(5/38);其中同时产ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌检出率为5.26%(2/38)。产酶株对第三代头孢菌素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类耐药率均较高,对亚胺培南、厄他培南等碳青霉烯类耐药率最低。通过质粒接合和消除试验,40%(4/10)产ESBLs的肺炎克雷伯菌和20%(1/5)产AmpC酶的肺炎克雷伯菌检测到传播耐药的质粒。结论肺炎克雷伯菌产ESBLs和AmpC酶是其对多种抗菌药物耐药的主要原因,其耐药扩散与细菌质粒的水平传播有关,对这些产酶株的监测和阻止其传播是控制肺炎克雷伯菌感染的重要措施。     

吉林市肠杆菌科细菌产AmpC酶及超广谱β-内酰胺酶的研究

目的：筛查吉林市耐药性肠杆菌科细菌产AmpC β-内酰胺酶（AmpC酶）和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）,为临床用药提供参考依据。方法：收集北华大学附属医院及化工二院住院患者标本中分离出的207株肠杆菌科细菌,表型确证试验确定产ESBLs的菌株,酶粗提物三维试验粗筛出产AmpC酶菌株。结果：207株肠杆菌科细菌中产ESBLs者95株（占45．9％）,产AmpC酶者52株（占25．1％）。结论：AmpC酶和ESBLs是肠杆菌科细菌耐药的两类主要酶。     

铜绿假单胞菌超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶的检测及耐药性分析

5).结论 产ESBLs和AmpC酶是导致铜绿假单胞菌耐药的主要两种酶,产酶株对多种抗菌药物耐药,亚胺培南具有很高的抗菌活性.     

下呼吸道感染肠杆菌科细菌产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的检测

目的探讨下呼吸道感染标本中分离的肠杆菌科细菌去阻遏持续高产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的发生率.方法采用纸片扩散法对下呼吸道感染标本中分离的肠杆菌科细菌进行初筛,选择出可疑产酶菌株,然后以头孢西丁三维试验检测产AmpC酶菌株,以复合纸片法检测产ESBLs菌株,以头孢曲松三维试验检测同时产AmpC酶和ESBLs菌株.结果在下呼吸道感染肠杆菌科细菌初筛为耐药菌株的242株细菌中,检出单产AmpC酶、单产ESBLs及同时产AmpC酶和ESBLs细菌分别为21、110、6株,总检出率分别为8.7%、45.5%、2.5%,其中阴沟肠杆菌AmpC酶检出率最高,为42.1%,肺炎克雷伯菌ESBLs检出率最高,为64.5%.结论及时准确地检测产AmpC酶和(或)ESBLs细菌,为临床医师诊断和治疗患者提供依据,能早期治疗并控制下呼吸道感染性疾病.     

质粒介导产ESBLs与AmpC β-内酰胺酶基因弗氏柠檬酸杆菌的研究

目的研究一株同时产ESBLs和AmpCβ-内酰胺酶弗氏柠檬酸杆菌(CFR)的耐药机制。方法 2008年1月从临床尿液标本中分离出多药耐药弗氏柠檬酸杆菌1株,采用双纸片扩散法检测产ESBLs,头孢西丁三维试验检测AmpC酶,E-test法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC),聚合酶链反应(PCR)检测产ESBLs和AmpC酶基因,DNA测序决定基因型;接合试验测定耐药基因的转移性。结果临床分离出一株同时产ESBLs和AmpCβ-内酰胺酶的多药耐药弗氏柠檬酸杆菌,对头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁、氨曲南、氨苄西林、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的MIC分别为96、96、256、192、>256、>32μg/ml,PCR扩增及测序临床分离株携带blaCTX-M-3和blaCMY-2,接合试验显示含blaCTX-M-3和blaCMY-2基因耐药质粒可以通过接合转移至受体菌大肠埃希菌J53。结论 CFR同时携带有ESBLs和AmpCβ-内酰胺酶基因,ESBLs基因和AmpCβ-内酰胺酶基因由质粒介导。     

下呼吸道铜绿假单胞菌超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶的检测及意义

目的研究下呼吸道铜绿假单胞菌的主要耐药机制超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶的产生情况.方法采用K-B试验,选用5种药敏纸片(IPM、CTX、CAZ、CTX/CLAV、CAZ/CLAV),参照相关标准,根据抑菌环特征推测ESBLs、AmpC酶的产生.结果114株下呼吸道铜绿假单胞菌中检出产ESBLs菌10株(8.8%),如果仅以CTX/CTX/CLAV为底物,检出7株(6.1%),以CAZ/CAZ/CLAV为底物检出5株(4.4%);产AmpC酶菌79株(69.5%);同时产ESBLs和AmpC酶菌4株(3.5%),产AmpC酶菌的检出率明显高于产ESBLs菌,差别具有显著性(P＜0.05).结论联合CTX/CTX/CLAV和CAZ/CAZ/CLAV两组底物可以提高铜绿假单胞菌ESBLs的检出率;下呼吸道铜绿假单胞菌AmpC酶产生率高,ESBLs产生率低;AmpC酶可能是下呼吸道铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制.     

同时产超广谱β-内酰胺酶和AmpCβ-内酰胺酶菌的单独和联合药物敏感分析

目的研究同时产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpCβ-内酰胺酶(AmpCs)菌(同产酶菌)的抗生素单独和联合耐药性,以期指导同产酶菌的治疗. 方法采用多底物纸片法(协同法、拮抗法)、ESBLs确认试验、AmpCs检测法检测33株阴沟肠杆菌和46株不动杆菌属的ESBLs和AmpCs产酶情况,以琼脂扩散法检测同产酶菌的抗生素单独和联合耐药性. 结果在本组菌,检出同时产ESBLs AmpCs产酶株42株,其中ESBLs 诱导型AmpCs 12株,ESBLs 高产AmpCs 30株;同时产ESBLs 诱导型AmpCs菌对亚胺培南、头孢吡肟和头孢哌酮/他唑巴坦的单独敏感率均>90%,对阿米卡星的敏感率为66.67%,对其他4大类6种抗生素的单独敏感率均<34%;对4大类10种抗生素的10种组合联合药敏,氨曲南与阿莫西林/克拉维酸协同率高(75%),亚胺培南与头孢哌酮/他唑巴坦的拮抗率也较高(50%),其余大部分为无关;在同时产ESBLs 高产AmpCs时,有效抗菌药物仅为亚胺培南、头孢哌酮/他唑巴坦,对其他4大类8种抗生素的单独敏感率均<20%;对4大类10种抗生素的10种组合联合药敏,除氨曲南与阿莫西林/克拉维酸有少量协同外,全部为无关. 结论阴沟肠杆菌和不动杆菌属的同产酶率很高;同产酶菌仅对亚胺培南与头孢哌酮/他唑巴坦敏感,其对4大类10种抗生素的10种组合联合药敏,仅氨曲南与阿莫西林/克拉维酸部分协同,其余大部分为无关.     

3-氨基苯硼酸改良方法检测超广谱β-内酰胺酶

目的:克服经典方法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)易受AmpCβ-内酰胺酶影响引起阳性率降低问题.方法:利用3-氨基苯硼酸能够可逆抑制AmpCβ-内酰胺酶的原理,使用苯硼酸改良方法与经典方法同时对119例菌株检测ES-BLs,并进行对比.结果:无AmpCβ-内酰胺酶存在时,改良方法与经典方法阳性检出率均为100%;有AmpCβ-内酰胺酶存在时,经典方法阳性率为60%,改良方法阳性检出率100%.结论:苯硼酸法与经典方法相比,具有更高的敏感性和特异性,是检测ESBLs的一个优秀方法.     

氯唑西林增效试验对肠杆菌科高产AmpC酶细菌的表型检测

目的建立易于操作、适合临床应用的检测产AmpC酶肠杆菌科细菌的方法。方法制作分别含80、120、160、200、240μg氯唑西林的头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南的标准复合纸片,分别测定未加氯唑西林和加上氯唑西林后上述纸片对130株耐头孢西丁肠杆菌科细菌的抑菌环直径,根据氯唑西林对4种抗菌药物的增效作用判断受试菌是否产AmpC酶,将检测结果与头孢西丁三维试验结果进行比较从而确定复合纸片中氯唑西林的含量以及最佳药敏指示剂;采用统计学软件对试验数据进行分析。结果三维试验证实,在130株耐头孢西丁肠杆菌科细菌中产AmpC酶为48株,非产AmpC酶82株;氯唑西林增效试验结果表明,复合纸片中氯唑西林含量为200μg时,单一复合纸片头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松的产AmpC酶检出率均为87.5%,氨曲南的检出率较低为33.3%,头孢噻肟和头孢曲松联合使用则检出率为95.8%,特异性为95.1%。结论复合纸片中氯唑西林含量为200μg,联合使用头孢噻肟和头孢曲松,氯唑西林增效试验检测AmpC酶有较高的敏感性和特异性,适合临床常规开展。     

超广谱β-内酰胺酶的检测及临床意义

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)由革兰阴性杆菌(主要是肺炎克雷伯菌，其次是大肠埃希菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌等)产生，可来源于TEM和SHV酶(由于其固有序列的基因点突变导致)，该酶最早发现于肺炎克雷伯菌中，仅局限于少数肠杆菌和肠球菌中，可