SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

5′-非转录区序列改建提高毕赤酵母表达抗菌肽LL-37

目的:探讨5'-非转录区(5'-UTR)序列改建对毕赤酵母表达外源蛋白LL-37的影响.方法:去除毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9 5'-UTR内GGATCCAA序列,转化E.coli DH5α,构建改良的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-EDIT;PCR鉴定及测序确认后与酵母偏爱密码子编码的LL-37基因片段连接,构建改良的重组表达载体pPIC9-EDIT-LL-37;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定后诱导LL-37表达,筛选最佳表达条件,对表达产物进行凝胶电泳和Western印迹分析;比较转入pPIC9-EDIT-LL-37及pPIC9-LL-37后毕赤酵母表达产物的抑菌活性,间接测定改建前后LL-37蛋白表达量的变化.结果:PCR鉴定及测序证实pPIC9-EDIT改建成功,成功构建重组载体pPIC9-EDIT-LL-37;转化毕赤酵母后表达产物PCR鉴定出LL-37基因,最佳诱导甲醇浓度为0.5%,最佳诱导表达时间为72 h,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37;改建后LL-37蛋白表达量提高了约35倍.结论:pPIC9 5'-UTR序列的改建能明显提高毕赤酵母表达LL-37蛋白,值得进一步研究以应用于其他外源蛋白表达.     

人毛乳头细胞HSPC016基因在毕赤酵母中的表达和鉴定

目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的真核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定.方法用PCR从pET-28a( )/HSPC016中扩增出195 bp目的基因,克隆至酵母表达载体pPIC9K质粒,经酶切鉴定后转化毕赤酵母菌GS115,G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导表达后进行Western blot检测和目的蛋白N-端氨基酸测序鉴定.结果用PCR成功扩增出目的基因;pPIC9K/HSPC016转化GS115用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白相对分子量约为7.2×103,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约18%;Western blot检测具有良好的免疫反应性;N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致.结论HSPC016基因能通过酵母表达载体pPIC9K及宿主菌GS115进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因在真核细胞水平表达的生物学意义奠定了基础.     

阿尔茨海默病Aβ40人单链抗体在毕赤酵母的表达

目的 重组表达抗Aβ40的人单链抗体,为被动免疫治疗阿尔茨海默疾病提供研究材料。方法 将从人噬菌体单链抗体文库中筛选获得的抗Aβ40人单链抗体基因,突变BamHI酶切位点,克隆连接到T载体,经过PCR和酶切鉴定。EcoRI和NotI双酶切pT-scFvAβ40质粒,连接到经过同样酶切的pPIC9K载体构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,经过基因测序验证。线性化pPIC9K-scFvAβ40,转化GS115毕赤酵母,经0．5％甲醇诱导表达抗Aβ40的人单链抗体。结果 基因测序证实pPIC9K-scFvAβ40序列正确,转化GS115获得重组菌株。经过0．5％甲醇诱导,重组菌株分泌表达分子质量大小约为33kD的蛋白质。结论 成功构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,Aβ40的人单链抗体在毕赤酵母系统得以重组表达。     

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达.方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5α,构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37,PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定;甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株,检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析.结果: pPIC9-LL-37载体构建成功;转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因;0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5 μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37.结论:成功构建pPIC9-LL-37载体,转化毕赤酵母后,经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性.     

小鼠睾丸体外培养模型研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对睾酮合成及机制的影响

【摘要】 目的构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定。方法采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中。经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性。结果成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性。结论采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源。     

大鼠DAF蛋白真核表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定.方法 采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中.经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子.转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性.结果 成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性.结论 采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源.     

EB病毒衣壳蛋白P23重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的 构建pPICZα A-BLRF2重组表达载体,实现BLRF2重组蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达,为进一步研制高效能重组抗原诊断试剂,研发亚单位疫苗奠定基础.方法 以B95-8细胞提取的EBV DNA为模板,采用PCR法扩增出目的基因片段BLRF2,与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,电转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达,表达产物经Western blotting进行鉴定.结果 成功构建pPICZαA-BLRF2重组质粒,并在毕赤酵母菌中成功表达了分泌型BLRF2重组蛋白.结论 在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了P23蛋白,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZα A-BLRF2生产酵母工程菌株,为进一步应用研究奠定了基础.     

人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的 实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达.方法 用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2*-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性.结果 成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血.结论 在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性.     

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的 探讨在毕赤酵母中进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPl588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上，使其准确融合于α交配因子分泌信号之后，电击转化毕赤酵母宿主菌GS115／His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR．分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后，分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coli JM109的抑菌实验。结果BP1588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中，并有转录产物mRNA的存在，表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。     

人连接蛋白Connexin26基因的克隆、表达及初步鉴定

目的研究含人连接蛋白Connexin26（Cx26）基因的真核表达载体构建及其在非洲猴肾细胞（COS-7）中获得稳定、高效表达的方法。方法提取人外周血淋巴细胞RNA，经逆转录制备成cDNA，设计特异性引物，用PCR方法从cDNA中扩增Cx26基因，将其定向插入真核表达载体pCI-neo中获得pCI-Cx26重组子-采用酶切法和测序法鉴定。用脂质体将pCI-Cx26转染COS-7细胞，经G418筛选，获得阳性克隆。用RT-PCR和SDS-PAGE检测对表达产物进行检测。结果从人外周血RNA制备而成的cDNA中可扩增出预期大小的Cx26基因片段，pCI-Cx26经双酶切测序证实构建成功。RT-PCR和SDS-PAGE检测到pCI-Cx26在COS-7细胞中获得稳定、高效表达。结论本研究成功构建了人连接蛋白Cx26基因重组真核表达载体pCI-Cx26：pCI-Cx26脂质体转染COS-7细胞，可见Cx26基因在COS-7细胞中获得稳定、高效的表达。该结果为今后进行pCI-Cx26基因治疗Cx26基因突变引起的遗传性耳聋的研究奠定了实验基础。     

构建人类neuritin真核表达系统

目的：构建人类neuritin基因真核表达载体，并观察其转染的PC12细胞中neuritin的表达。方法：用基因重组技术，将人类Neuritin cDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDN A4．0中，经酶切鉴定及测序分析、并以脂质体介导转染PC12细胞，了解其在细胞内的表达。结果：酶切鉴定及测序分析，表明重组pcDNA4．0-neuritin表达质粒克隆成功．neuritin基因在PC12细胞中获得表达。结论：以脂质体介导pcDNA4．0-neuritin质粒转染真核细胞，为基因治疗神经系统退行性病变奠定实验基础。     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的 构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法 以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平.结果 通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA.结论 成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础.     

葡萄糖苷酶Ⅰ特异性siRNA-EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建葡萄糖苷酶Ⅰ(glucosidaseⅠ, GluⅠ)特异性siRNA真核表达载体。方法:根据 siRNA靶序列选取原则,设计并合成针对鼠葡萄糖苷酶ⅠcDNA的寡聚DNA,退火并连接至载体 pSilencer1.0 U6,再将 U6 启动子及下游插入片断一起切下,克隆至真核表达载体 pEGFP C1,通过限制性酶切和测序对重组表达载体进行鉴定,最后将该质粒转染至HeLa细胞,共聚焦荧光显微镜观察其表达。结果:①限制性酶切和测序结果表明成功构建了带有EGFP基因的鼠GluⅠ特异性的siRNA真核表达载体 pC 1U6glu; ②共聚焦荧光显微镜观察结果表明p C1U6glu成功转染至HeLa细胞。结论:pC 1U6glu的成功构建及表达为进一步利用 siRNA研究葡萄糖苷酶Ⅰ的功能和治疗肿瘤奠定基础。     

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的：构建PIAS3 （活化型STAT3抑制蛋白）的Myc融合蛋白真核表达重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法： 采用PCR方法，扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上，将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果：重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4 357和1 318 bp 2条带，XbaⅠ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带，与预期结果一致。测序结果显示，13个氨基酸Myc在N端，然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达，在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带。结论：成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。     

幽门螺杆菌napA基因真核表达系统的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）napA基因真核表达系统,了解其在小鼠肌细胞中的表达情况。方法根据GenBank中HpnapA基因序列（AF227075）和真核表达质粒多克隆位点序列设计引物,以Hp-RNA逆转录产物为模板,扩增HpnapA编码基因,用基因重组技术将目的基因定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA测序后,进行小鼠肌肉免疫、目的基因表达水平和抗体水平检测。结果经双酶切、PCR和测序验证,真核表达质粒HpnapA/pcDNA3构建成功。动物实验结果表明：真核重组质粒在小鼠肌细胞内获良好表达,表达产物能刺激机体产生一定效价的抗体。结论成功构建了HpnapA/pcDNA3真核重组表达质粒;用以免疫小鼠,在小鼠肌细胞内获较好表达并具有免疫原性,有用于疫苗研究的潜在价值。     

HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达

目的：构建人血清白蛋白（HSA）-胸腺五肽（TP5）融合蛋白表达载体,并在毕赤酵母中表达,阐明其生物学活性。方法：利用基因重组技术构建HSA-TP5融合基因,并转染至毕赤酵母中从而构建其真核表达体系,通过琼脂糖凝胶电泳分离及试剂盒纯化获得PPICZαC-HSA-TP5真核重组表达质粒;采用两步发酵法对HSA-TP5基因工程菌进行高密度发酵,对发酵液上清蛋白沉淀浓缩,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、阳离子交换层析及疏水层析等方法分离纯化蛋白;采用MTT法检测该融合蛋白促淋巴细胞增殖活性。结果：PCR法获得HSA目的基因片段长度为1 845 bp。酶切鉴定融合质粒HSA-TP5-pPICZαC得到片段长度为707 bp。测序分析,目的基因HSA和TP5序列与GenBank公布的基因序列完全一致,并正向连接融合。PCR法鉴定PPICZαC-HSA-TP5真核重组质粒与酵母基因组DNA整合,与对照组比较,转化组出现基因片段长度为1 860 bp。SDS-PAGE分析,在甲醇诱导后72 h内,随着诱导时间延长,HSA-TP5融合蛋白表达量逐步升高。利用阳离子交换层析及AKTA多功能蛋白纯化系统纯化得到HSA-TP5融合蛋白。MTT法检测,HSA-TP5融合蛋白与TP5蛋白具有一致的促淋巴细胞增殖活性。结论：通过构建HSA-TP5毕赤酵母真核表达体系可获得HSA-TP5融合蛋白并具有生物学活性。     

CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的: 构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV⁺)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法: 根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组。采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒。设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC)。采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV⁺肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学。结果: 酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体pIRES2-CSF2A。转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达。MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05或P<0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体。pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV⁺肿瘤细胞48h时凋亡细胞明显增多。结论: 重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV⁺CNE2细胞增殖且促进其凋亡。