聚酰胺-胺型纳米载体的研究进展

聚酰胺-胺型纳米载体是一种高分子多聚物,商品名为superfectTM,因为其形状及表面胺基团的设置精细,故有“人工球状蛋白”之称。它的表面主要为胺基团,具有结合、浓缩药物或DNA的能力,并将它们高效导入各种细胞,通过适当的修饰可以靶向定位,体外显示无明显的细胞毒性,因而可以在医学研究包括药物控释系统充当基因治疗中的基因转移载体,在诊断、监测中都可以起到重大的作用,目前是各学科中的研究热点之一。     

聚酰胺-胺型纳米载体在肿瘤治疗中的研究现状

近年来，纳米技术、生物技术等学科飞速发展，肿瘤的治疗也有明显进步。作为一种新型人工合成的纳米材料，聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM—D)具有颗粒直径小、易制备纯化、载药量高、可生物降解、特殊的树枝状结构及表面电荷、无免疫原性及遗传毒性等特点，使得其作为药物载体和基因载体成为肿瘤靶向治疗的新热点。该文对聚酰胺-胺型纳米作为药物载体及基因载体对肿瘤的靶向治疗作简要介绍。     

I型葡萄糖载体缺陷综合征

I型葡萄糖载体缺陷综合征是一种新认识的、可以治疗的神经系统遗传代谢病。它以婴儿期癫痫发作、生长发育迟缓、小头畸形和持续性脑脊液低葡萄糖含量为主要的临床特征，其病因为大脑微血管内皮细胞膜上的I型葡萄糖载体缺陷。临床抗癫痫药物治疗无效。生酮饮食（即高饮食）是目前唯一有效的治疗办法。     

膀胱粘膜下层无细胞基质作为细胞载体的可行性研究

目的 探讨膀胱粘膜下层无细胞基质作为组织工程学细胞载体的可行性。方法 采用胶原酶自膀胱组织分离出平滑肌细胞,在DMEM(含10％胎牛血清)中培养、传代。自膀胱显微解剖出膀胱粘膜下层,以0.5％SDS、双蒸水彻底洗涤后形成无细胞基质。平滑肌细胞以5.0×10~6/cm~2密度种植于膀胱无细胞基质,分别于1周、2周、3周、4周时取标本,HE染色、扫描电镜等观察细胞生长情况。结果 平滑肌细胞可在膀胱粘膜下层无细胞基质上粘附。1周时,平滑肌细胞主要位于膀胱粘膜下层无细胞基质的表面。第2、3周,细胞数量明显增多,并可见细胞向膀胱粘膜下层无细胞基质的中间部位侵入。第4周细胞数量减少。结论 膀胱粘膜下层无细胞基质可以作为细胞载体应用于组织工程学研究。该细胞-载体复合物的回植时间应在3周前。     

Ⅰ型葡萄糖载体缺陷综合征

Ⅰ型葡萄糖载体缺陷综合征是一种新认识的、可以治疗的神经系统遗传代谢病。它以婴儿期癫癎发作、生长发育迟缓、小头畸形和持续性脑脊液低葡萄糖含量为主要的临床特征，其病因为大脑微血管内皮细胞膜上的Ⅰ型葡萄糖载体缺陷。临床抗癫癎药物治疗无效。生酮饮食（即高脂饮食）是目前唯一有效的治疗办法。     

聚酰胺-胺型纳米载体在肿瘤治疗中的研究现状

近年来 ,纳米技术、生物技术等学科飞速发展 ,肿瘤的治疗也有明显进步。作为一种新型人工合成的纳米材料 ,聚酰胺 胺型树枝状高聚物 (PAMAM D)具有颗粒直径小、易制备纯化、载药量高、可生物降解、特殊的树枝状结构及表面电荷、无免疫原性及遗传毒性等特点 ,使得其作为药物载体和基因载体成为肿瘤靶向治疗的新热点。该文对聚酰胺 胺型纳米作为药物载体及基因载体对肿瘤的靶向治疗作简要介绍。     

鼠IL-10基因腺病毒载体的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建携带鼠IL-10（rIL-10）基因重组腺病毒载体，并探讨其能否在鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）中稳定表达。方法 rIL-10引物经PCR扩增rIL-10 cDNA序列，将回收到的656 bp rIL-10 DNA片段克隆入pcDNA3.1载体中，构建pcDNA3.1-IL-10，将其与腺病毒载体共转染HEK293细胞，进行细胞内同源重组，经测序及聚合酶链反应（PCR）鉴定重组是否成功；反复冻融裂解HEK293细胞，将获得的含rIL-10基因的病毒液感染MSCs，Western blot法检测rIL-10在MSCs中的表达。结果 经测序及PCR验证，rIL-10基因腺病毒载体构建成功，病毒滴度达4×10⁹ PFU/mL。含rIL-10基因的病毒液体外感染MSCs后，可检测到IL-10的表达。结论 构建重组腺病毒能够介导rIL-10基因在MSCs中的稳定表达，为下一步基因移植治疗炎症性肠病提供基础。     

六个转录因子将人脐带间充质干细胞高效重编程为诱导性多能干细胞的实验研究

目的 建立人脐带间充质干细胞(HuMSCs)来源的诱导性多能干细胞(iPSC)系.方法 以慢病毒载体将OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个转录因子转入HuMSCs使其重编程为iPSC.通过形态学观察、多能细胞特异性标志检测、碱性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、拟胚体形成、体内成瘤实验鉴定获得的iPSC.结果 慢病毒感染后第4天,HuMSCs逐渐变成类圆形,第10天开始出现不规则细胞团,第14天出现较大的细胞团,约1.25％的细胞重编程为iPSC.建系后iPSC呈典型的克隆状生长,边缘清晰,内部细胞细小,排列紧密;AKP染色阳性;表达多能性相关基因及胚胎干细胞特异性蛋白;细胞核型正常(46,XY);体内外均能向3个胚层方向分化.结论 慢病毒携带OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个因子能将HuMSCs高效诱导为完全重编程的iPSC.     

新生儿惊厥相关基因KCNQ2定点突变及其蛋白表达的研究

目的：在收集的1个良性家族性婴儿惊厥家系中发现KCNQ2基因 c.812G>T（p.G271V）突变,探讨c.812G>T突变体及其真核表达载体的构建方法,并观察其在人胚肾(HEK)293细胞中的表达。方法：利用重叠延伸PCR和限制性内切酶法构建 KCNQ2 基因 c.812G>T突变体真核表达载体pcDNA3.0-c.812G>T-KCNQ2,用脂质体转染法将KCNQ2质粒（野生型pcDNA3.0-KCNQ2或突变型pcDNA3.0-c.812G>T-KCNQ2）与荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染HEK293细胞,激光共聚焦显微镜下观察HEK293细胞,免疫荧光化学法检测蛋白质表达。结果：构建的突变体经DNA直接测序示 KCNQ2 基因cDNA第812位碱基G变为T,突变体在HEK293细胞中成功表达,野生型和突变型基因的蛋白质都在细胞膜上表达,提示KCNQ2钾通道孔区的突变c.812G>T并不影响蛋白的正常表达。结论：成功构建 KCNQ2 突变基因真核表达载体,并在HEK293细胞中表达KCNQ2蛋白,为突变型 KCNQ2 基因的功能研究及癫癎的分子发病机制研究奠定基础。     

小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在P19细胞中的表达。方法采用PCR方法获得WNT1基因启动子最小功能单位和3’UTR区域在内的DNA片段。双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受WNT1启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-SV40(表达海肾荧光素酶)共转染P19细胞,24 h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,空白对照组(荧光强度比值:2.820 4±0.294 4)与对照组(荧光强度比值:3.050 8±0.303 7)及WNT-3’UTR突变组(荧光强度比值:51.475 8±0.983 7)比较,差异均有统计学意义(Pa<0.001),该重组表达载体在P19细胞特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在P19细胞的特异性表达。     

还原性叶酸载体基因多态性与甲氨蝶呤药物敏感性的相关研究进展

还原性叶酸载体(RFC)是肿瘤化疗药物甲氨蝶呤(MTX)跨膜运输的主要载体,其基因多态性是造成MTX耐药的原因之一.近年来随着RFC基因多态性和功能之间关系的深入研究,人们发现RFC基因多态性引起的分子结构改变是造成MTX摄入减少的主要原因,它可以引起靶酶抑制不完全和聚谷氨酸盐形成减少,最终导致叶酸拮抗剂耐药.     

还原性叶酸载体基因多态性与甲氨蝶呤药物敏感性的相关研究进展

还原性叶酸载体(RFC)是肿瘤化疗药物甲氨蝶呤(MTX)跨膜运输的主要载体,其基因多态性是造成MTX耐药的原因之一.近年来随着RFC基因多态性和功能之间关系的深入研究,人们发现RFC基因多态性引起的分子结构改变是造成MTX摄入减少的主要原因,它可以引起靶酶抑制不完全和聚谷氨酸盐形成减少,最终导致叶酸拮抗剂耐药.     

K562细胞对c—myc反义寡核苷酸的摄入及分布

目的 动态观察白血病细胞K562对经不同化学修饰的c-myc反义寡核苷酸（ASONS）及其脂质体复合物的摄入及在细胞内分布情况,以探讨与其生物学作用的关系。方法 应用激光扫描共聚焦技术观察不同时间点K562细胞对上述物质的摄入量及分布特点。结果 K562细胞对经脂质体包裹的c-myc ASONS及未包裹全硫化ASON的摄入量随培养时间的延长而增加,至5h达高峰,7h已明显下降。未包裹的ASONS摄入量大小为：全硫化组＞端点硫化组＞未硫化组,其荧光主要以点状、团块状形式分布在细胞表面及胸浆内,而经阳离子脂质体包裹的ASONS的荧光向核内聚集。结论 对ASONS进行硫化修饰可以促进K562细胞对c-myc ASONS的摄入,脂质体作为载体可使ASONS向核内分布,从而可能影响ASONS生物学作用的发挥。     

MicroRNA表达载体对大鼠KiSS1基因的干预效应

目的在细胞水平观察microRNA(miRNA)载体瞬时转染293T细胞株后对KiSS1基因转录、翻译的干预效应。方法以SD大鼠基因组DNA为模板,克隆KiSS1基因全长序列,构建重组载体pcDNA3.1(+)-KiSS1。应用miRNA设计软件,针对大鼠KiSS1基因的4个不同靶位点设计4对干扰序列及1对非相关性的阴性对照序列,得到miRNA表达载体p-KiSS1-miRNA1-4及p-KiSS1-miRNA-neg。利用脂质体介导将上述载体与pcDNA3.1(+)-KiSS1共转染293T细胞,采用荧光显微镜及免疫荧光技术检测转染72 h后细胞中各载体表达。采用实时荧光定量-PCR(RT-RCR)及Western blot技术观察转染48 h及72 h后miRNA表达载体对KiSS1基因的干预效应。结果荧光显微镜观察到miRNA载体转染293T细胞后可表达绿色荧光蛋白,免疫荧光结果显示转染pcDNA3.1(+)-KiSS1载体组可见红色的KiSS1蛋白在细胞质中表达;RT-PCR结果显示干预组细胞KiSS1 mRNA表达显著低于阳性对照组和阴性对照组(Pa<0.05)。其中p-KiSS1-miRNA2组KiSS1基因表达抑制最显著,降低了85%;Western blot结果显示p-KiSS1-miRNA2干预组KiSS1蛋白表达明显低于阳性对照组及阴性对照组。结论 4个miRNA载体对大鼠KiSS1基因均具有抑制效应,其中针对KiSS1 mRNA序列304～324 bp的p-KiSS1-miRNA2抑制效果最佳,为个体水平沉默KiSS1防治性早熟的研究提供依据。     

叶酸结合蛋白1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1.叶酸结合蛋白1(Folbp1)基因真核表达载体,检测其在肺腺癌A549细胞中的表达.方法 采用反转录.PCR技术从肺腺癌 A549 细胞中扩增Folbp1 基因的完整编码框,将其克隆到真核表达载体 pcDNATM 3.1/myc.His B,脂质体转染肺腺癌 A549细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的肺腺癌 A549细胞株,并利用Western blot法鉴定其表达.结果 PCR扩增Folbp1基因全长编码区,电泳显示其分子大小与823 bp预期值一致;连接产物pMD.Folbp1转化感受态细菌,经氨苄西林筛选,提取质粒鉴定表明插入pMD.18T载体的目的 片段大小和方向正确;重组质粒扩增Folbp1 基因连入pcDNATM 3.1/myc.His B载体,酶切鉴定显示切出约5.1 kb符合载体大小的条带及符合插入片段大小的特异条带;转染pcDNA 3.1.Folbp1重组质粒的肺腺癌 A549细胞株经抗生素G418筛选,Western blot分析显示与预期大小一致的特异性条带.结论 pcDNA 3.1.Folbp1真核表达载体构建成功,并在肺腺癌 A549细胞内过表达,这将为研究Folbp1基因的功能及其肺发育中奠定了良好的基础.     

先天性QT间期延长综合征相关基因SCN5A定点突变及蛋白表达研究

目的：构建先天性QT间期延长综合征相关基因SCN5A-delQKP1507 1509突变型真核表达载体,并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达。方法：采用一步法构建SCN5A-delQKP1507-1509突变型真核表达载体PEGFP-delQKP-hH1,用脂质体转染法将野生型和突变型质粒分别转染HEK293细胞,激光共聚焦显微镜观察钠通道蛋白在HEK293细胞的表达与定位,Western blot检测其蛋白表达。结果经电泳及DNA测序显示突变型1507-1509位点成功缺失9个碱基,野生型与突变型均在HEK293细胞膜上表达,且表达量差异无统计学意义（P>0.05）。结论成功构建钠通道基因SCN5A-delQKP1507-1509突变型真核表达载体,并在HEK293细胞中表达,为进一步研究其功能奠定基础。     

Smac基因的克隆及其对Burkitt′s淋巴瘤

目的克隆人促凋亡基因(secondmitochondriaderivedactivatorofcaspases,Smac),研究Smac基因转染对Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞的促凋亡作用。方法从人胚肾293细胞中扩增人Smac基因全长的cDNA;构建含Smac基因全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1/Smac,并转染人Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞;用Westernblot测定外源基因的表达;Hoechest33258和碘化丙锭双荧光染色,结合激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞凋亡百分率;比色法测定caspase3酶活性。结果成功克隆人Smac基因全长cDNA,并构建真核表达载体pcDNA3.1/Smac;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24h,可显著诱导Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞的凋亡,凋亡百分率达(43.7±2.5)%;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24h,可显著诱导Raji细胞中caspase3酶活性上调,吸光度为0.936±0.041,与正常对照组(0.138±0.026)及空载体转染对照组(0.136±0.036)相比,P<0.05。结论转染并表达外源性Smac基因,可显著诱导人Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞凋亡。其机制可能与caspase3酶活性上调有关。     

应用RNA干扰技术抑制骨肉瘤细胞中基质金属蛋白酶-1基因表达的研究

目的构建针对人基质金属蛋白酶-1（MMP-1）基因的特异性短发卡RNA（shRNA）真核表达载体，并观察其在人骨肉瘤细胞MG63中对MMP-1基因表达的抑制作用。方法培养骨肉瘤细胞MG63，根据MMP-1基因cDNA编码序列，设计并合成针对MMP-1基因的特异性RNA干扰片断，将其克隆入pSilencer 3．0-H1 neo质粒，构建MMP-1基因shRNA真核表达载体siRNA MMP-1。与阴性对照质粒分别转染MG63细胞，G418筛选稳定转染的细胞系。采用RT—PCR、Western blot检测MMP-1 mRNA和蛋白的表达水平，同时进行体外侵袭试验。结果成功构建了MMP-1基因shRNA真核表达载体siRNA MMP-1。获得了稳定转染siRNA MMP-1载体和阴性对照载体siRNA neg的细胞系，并发现MG63／siRNA MMP-1细胞MMP-1 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制，细胞侵袭能力也显著下降。结论特异性shRNA能够明显抑制MMP-1基因在MG63细胞中的表达，这为进一步研究MMP-1在MG63细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

一种靶向肿瘤或炎症组织的新载体——工程巨噬细胞载体

近年，人们利用组织内的巨噬细胞(macmphages，MФ)具有聚集于炎症及肿瘤缺氧区的生物学特性，开发了一类新载体——工程MФ载体。MФ经携带治疗基因的重组病毒稳定转染，并以细胞因子或细菌脂多糖激活后，静脉注入体内，可靶向炎症组织和肿瘤组织，并不断产生和分泌重组病毒，有效介导治疗基因的转导，为肿瘤、慢性炎症和自身免疫性疾病的基因疗法提供了较理想的运载工具。     

Smac基因的克隆及其对Burkitt''''s淋巴瘤细胞的促凋亡作用

目的克隆人促凋亡基因(second mitochondria-derived activator of caspases,Smac),研究Smac基因转染对Burkitt's淋巴瘤Raji细胞的促凋亡作用.方法从人胚肾293细胞中扩增人Smac基因全长的cDNA;构建含Smac基因全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1/Smac,并转染人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞;用Western blot测定外源基因的表达;Hoechest 33 258和碘化丙锭双荧光染色,结合激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞凋亡百分率;比色法测定caspase-3酶活性.结果成功克隆人Smac基因全长cDNA,并构建真核表达载体pcDNA3.1/Smac;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24 h,可显著诱导Burkitt's淋巴瘤Raji细胞的凋亡,凋亡百分率达(43.7±2.5)%;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24 h,可显著诱导Raji细胞中caspase-3酶活性上调,吸光度为0.936±0.041,与正常对照组(0.138±0.026)及空载体转染对照组(0.136±0.036)相比,P <0.05.结论转染并表达外源性Smac基因,可显著诱导人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞凋亡.其机制可能与caspase-3酶活性上调有关.