Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞提取与纯化的体外研究

目的建立简便易行的Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞体外提取并纯化方法,以获取能够满足实验需求的Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞,提高原代培养成功率。方法采集6例Ⅱ型神经纤维瘤病患者肿瘤组织标本作为实验材料,Ⅰ型胶原酶消化培养法提取肿瘤性许旺细胞,低浓度酶快速消化法、差数贴壁法和克隆筛选技术纯化肿瘤性许旺细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学染色榆测纯化细胞S-100蛋白表达水平,结合细胞形态鉴定经体外培养并纯化的细胞为肿瘤性许旺细胞。结果自3例肿瘤组织标本培养液中成功获得肿瘤性许旺细胞。肿瘤细胞原代培养至第3天,可见大量双极梭形或三角彤细胞,以低浓度酶快速消化法和差数贴壁法纯化细胞;培养至第3代,倒置相差显微镜观察可见4～5个克隆细胞,免疫细胞化学染色S-100蛋白表达阳性,肿瘤性许旺细胞纯度〉95％,活力良好,可以稳定传代培养。结论应用体外原代培养方法结合低浓度酶快速消化法、差数贴壁法和克隆筛选技术能够有效剔除纤维母细胞,获得纯度高、活力良好的肿瘤性许旺细胞,可用于Ⅱ型神经纤维瘤病发病机制及治疗研究。     

神经纤维瘤病2型分子生物学研究进展

神经纤维瘤病2型(NF2)为遗传性疾病,其致病机制复杂,主要为NF2基因突变致Merlin肿瘤抑制作用失调。临床表型可分为Wishart型和Gardner型,表现多样,轻重程度不一。NF2突变形式包括无义突变、剪切位点突变等,各具不同特点,但与表型无明确关系。目前,基因检测技术敏感性不断提高和NF2动物模型研究促进靶向药物开发,更有利于干预NF2疾病的发展。NF2疾病的发病机制和治疗有待进一步研究。     

Ⅱ型神经纤维瘤病手术治疗2例报告

１病例报告病例１：男，２１岁，１９９１年１月起觉蝉鸣样耳鸣，听力下降并逐渐加重，伴有眩晕，６月出现双耳耳聋，右侧面部麻木，１２月出现双眼视力模糊，行走不稳。曾在多家医院诊治，未作手术治疗。１９９９年６月作头部MRI检查示：双侧桥脑小脑角、右颞顶部占位。体格检     

Ⅱ型神经纤维瘤病的基础与临床研究

Ⅱ型神经纤维瘤病是常染色体显性遗传性疾病,NF2基因突变及表达产物merlin缺乏是其主要的病理基础,merlin具有抑制细胞生长的功能,merlin表达下降将导致细胞的过度增殖和恶性变。本文就Ⅱ型神经纤维瘤病的临床表现、诊断和治疗,以及merlin的生物学功能及其在疾病发生发展中的作用等方面作一综述。     

遗传性神经纤维瘤病Ⅱ型一家系报告

神经纤维瘤病（NF）是基因缺陷造成神经嵴细胞发育异常、导致多系统损害的常染色体显性遗传性疾病。根据临床表现和基因定位分为神经纤维瘤病Ⅰ型（NFI）和Ⅱ型（NFⅡ）。其中NFⅡ较少见,现报告NFⅡ一家系如下。     

Ⅰ型神经纤维瘤病雪旺细胞纯化培养的实验研究

目的获得高纯度的NF1(Ⅰ型神经纤维瘤病)神经纤维瘤中雪旺细胞。方法将手术室取来的NF1神经纤维瘤组织剪碎,用Ⅰ型胶原酶消化,普通培养液吹打分散差数贴壁后接种于培养瓶,细胞贴壁后换用含Geneticin的培养液培养3 d,换用普通培养液继续培养,待细胞汇合时结合低浓度酶快速消化法和差数贴壁法对雪旺细胞进行纯化,传代培养;继用S-100蛋白进行免疫组化染色,鉴定培养的雪旺细胞。结果应用含Geneticin的培养液培养雪旺细胞,结合酶快速消化法和差数贴壁法,成纤维细胞基本消失,雪旺细胞活力良好,可进行传代培养,经S-100蛋白免疫组化染色鉴定培养的细胞基本为染色阳性的雪旺细胞。结论应用含有Geneticin的培养液培养雪旺细胞,结合酶快速消化法和差数贴壁法,能够有效地去除成纤维细胞,获得纯度高、活力良好的雪旺细胞。     

神经纤维瘤病Ⅱ型的MRI分析

目的探讨神经纤维瘤病Ⅱ型的MRI表现,提高对本病的认识。方法收集9例经临床及病理证实的神经纤维瘤病Ⅱ型进行分析、总结。结果双侧听神经瘤6例,其中合并多发脑膜瘤3例,多发神经鞘瘤2例,多发胶质瘤、神经纤维瘤1例;一侧听神经瘤合并侧脑室室管膜瘤及多发枕颈部皮下神经纤维瘤,合并多发脑膜瘤1例;1例脊膜瘤并侧脑室室管膜瘤。结论MRI是检查NF-II中枢神经系统病变理想的影像学检查方法,可较好的显示其多发性及多灶性病变。     

野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因Ⅱ亚型真核表达载体的构建及其功能

目的构建野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因（NF2）Ⅱ亚型的真核表达载体，观察其在人胚胎肾细胞293（HEK293）中的表达并检测其转染神经鞘瘤细胞（RT4）后的功能。方法以人胎脑cDNA文库中的NF2Ⅱ亚型基因为模板．应用聚合酶链反应技术扩增野生型NF2Ⅱ亚型基因，并定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1质粒中：经鉴定正确的重组质粒pEGFP-NF2Ⅱ亚型，用Lipofectamine2000脂质体导人人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Western Blotting法观察基因表达水平：随后转染大鼠神经鞘瘤细胞．利用水溶性四氮唑法观察野生型NF2Ⅱ亚型基因对大鼠神经鞘瘤细胞增殖的影响。结果经序列分析证实，克隆的NF2Ⅱ亚型基因与Genebank中的序列完全一致。DNA琼脂糖凝胶电泳检测显示，经双酶切后的质粒pEGFPcDNA片段大小约为4700bp：NF2Ⅱ亚型基因cDNA片段大小为l770bp，NF2Ⅱ亚型基因的真核表达载体可瞬时转染人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Westem Blotting方法得到证实；水溶性四氮唑法检测显示，转染pEGFP-NF2Ⅱ亚型并表达NF2Ⅱ亚型编码蛋白的293细胞与对照组293细胞的增殖指数相同。结论所构建的野生型NF2Ⅱ亚型基因真核表达载体可在人胚胎肾细胞293中表达，且不具有抑制肿瘤细胞增殖的特性。     

Ⅱ型多发性神经纤维瘤病的治疗

Ⅱ型多发性神经纤维瘤病（neurofibromatosis2,NF2）最早由Wishart于1822年报道。1882年VonRecklinghausen通过病理学研究,较详细阐述了NF2的组织学特点及其与神经系统的关系,故本病又称为Von Recklinghausen病。现在已经明确NF2是一种常染色体显性遗传病,发病率为1/5000,约有50%的患者来自父母遗传,     

Ⅱ型神经纤维瘤病分子遗传分析指导临床个体化诊疗的研究

目的 建立临床适用的Ⅱ型神经纤维瘤病(NF2)的分子遗传分析方法,对NF2患者及其后代进行分子遗传诊断,以指导NF2家族的遗传咨询及个体化病情监测、随访及临床干预.方法 以天津医科大学总医院神经外科自2009年1月至2010年1月收治的10例NF2患者为研究对象,收集患者的肿瘤组织标本,原代培养并鉴定术中获取的许旺细胞瘤组织.抽提原代培养的肿瘤性许旺细胞及患者血液的基因组DNA(2例NF2患者已有后代且同意接受基因测序,同时对其后代的血液进行基因组DNA提取),对2例NF2患者亲子二代血液及患者的肿瘤性许旺细胞基因组DNA进行NF2基因测序.制定不同的临床干预及随访计划,结合亲子二代分子遗传检测结果,对NF2家族制定后代的长期随访计划.结果 初步建立NF2许旺细胞瘤组织标本与基因组DNA库.基因测序结果显示肿瘤性许旺细胞与患者血液提取的NF2基因突变位点相同.第一组母女存在完全相同的基因突变位点,第二组母子基因突变位点不完全一致,二组检测到的突变位点均位于靠近外显子的调控区.结论 NF2许旺细胞瘤组织标本及基因组DNA库可以为该病分子遗传研究提供组织及基因组DNA资源.分子遗传分析可以指导临床工作,提前预计后代罹患风险,为高风险人群制定个体化的随访计划.个体化的临床干预可以提高患者的生活质量,延长生存期.

Abstract：

Objective To establish a molecular genetic analysis method applicable clinically for genetic diagnosis of patients with neurofibromatosis type Ⅱ (NF2) and their offsprings, and further guide the genetic counseling of NF2 family, condition monitoring, follow-up as well as clinical intervention of the patients. Methods Ten patients with NF2, admitted to our hospital from January 2009 to January 2010, were chosen;tumorigenic Schwann cells in Schwannoma were isolated and purified for primary culture. Genomic DNA was extracted from tumorigenic Schwann cells and from the blood of 2 patients and their offsprings who agreed to accept gene sequencing;the NF2 gene was sequenced (El-15 and El7 exons and adjacent introns). According to the implication of NF2 gene sequencing, genetic counseling was given to the NF2 family, and the potential NF2 patients in offsprings were followed up in a long-term. Results Schwannoma tissue and genomic DNA bank were established initially. Totallysame NF2 gene mutations were detected in genomic DNA extracted both from tumorigenic Schwann cells and blood cells in the same patient. By comparing the genotypes between the patients and the offsprings,consistent NF2 gene mutations were found between a female patient and her daughter aged 3, but not completely consistent gene mutations between another female patient and her son aged 15. All of the mutations in NF2 gene were located in the control region near the exons. Based on the patient's clinical manifestations and symptoms, reasonable plans for clinical interventions and follow-up were developed.Conclusion Schwannoma tissue and genomic DNA bank could supply the bio-resource for genetic molecular testing and treatment studies. Molecular genetic analysis would apply in clinical practice guidance, NF2 risk prediction, and follow-up plan for high-risk NF2 individuals. Early diagnosis and treatment, condition monitoring and long term follow-up and personalized clinical intervention are needed to improve the quality of life and prolong the survival.     

许旺细胞的体外培养提纯

许旺细胞是组织工程修复神经损伤的种子细胞，能否获得大量且高纯度的许旺细胞对于组织工程学至关重要。许旺细胞的培养纯化技术日趋完善，其经典的培养方法有植块法和酶消化法，在此基础上改进的去除成纤维细胞的方法有差速贴壁法、免疫选择法、阿糖胞苷补充法、刺激因子增殖法等。最近比较新的提纯方法有磁性活细胞分离法、层粘连蛋白纯化法、三维支架联合培养法。另外还有一些因子，如胎牛血清浓度等影响许旺细胞的扩增。这些技术的主要目的就是在体外获得大量的高纯度许旺细胞，以满足组织工程修复神经的需要。许旺细胞的体外培养和提纯方法众多，且已取得初步进展，但在此技术完全成熟之前尚还有许多问题有待解决，如周期长、细胞活性低、在传代培养中细胞生物学特性不稳定等。     

c-Kit receptor expression in normal human Schwann cells and Schwann cell lines derived from neurofibromatosis type 1 tumors

The growth factor receptor c-Kit has several well-characterized functions during the development of numerous cell types, including red blood cells, mast cells, and melanocytes. Its role in Schwann cells has been described in transformed cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors from patients with neurofibromatosis type 1 (NF1 MPNST; Badache et al. [1998] Oncogene 17:795-800). However, c-Kit functions have not been investigated in normal Schwann cells. We report here that neonatal rat Schwann cells express low c-Kit levels, whereas expression levels for c-Kit are high for Schwann cells derived from MPNST of NF1 patients. In addition, c-Kit expression is not detectable in normal adult human Schwann cells. Although the c-Kit ligand stem cell factor (SCF) induces the phosphorylation of protein kinase B (or Akt) and prevents apoptosis in Schwann cells, SCF has no effect on the proliferation or differentiation of Schwann cells.     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞*

背景：常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37 ℃超过30 min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。 目的：探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。 方法：采用4 ℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18 h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。 结果与结论：结果得到的细胞数量超过1×106,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

多步法分离和纯化雪旺细胞的实验研究

目的 改进雪旺细胞（SCs)的体外培养条件，以获得足够数量较纯净的雪旺细胞应用于周围神经修复。方法 5-7d的SD仔鼠坐骨神经，采用混合酶长时间多次消化法分离雪旺细胞，阿糖胞苷（cytosine arabinoside,Ara-C),G-418(geneticin)抑制成纤维细胞生长，氟丝扣林促进雪旺细胞分裂增殖，低浓度胰酶快速消化传代进一步纯雪旺细胞。结果 使用上述方法可以获得大量的高分裂增殖，低浓度胰酶快速消化传代进一步纯雪旺细胞。结果 使用上述方法可以获得大量的高分裂增殖，低浓度胰酶快速消化传代进一步纯化雪旺细胞。结果 使用上述方法可以获得大量的高纯度雪旺细胞，经抗S-100蛋白单抗通过SABX法染色鉴定，雪旺细胞纯度可达到97%以上。结论 本文所使用的方法是培养和纯化雪旺细胞较为理想的方法，可以满足目前组织工程神经修复的需要。     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为许旺细胞

背景：人脐带Wharton’s Jelly源间充质干细胞避免了伦理的限制,来源丰富,可以作为种子细胞进行组织修复。 目的：观察体外诱导脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞向许旺细胞分化的可行性。 方法：分离、培养脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志。利用神经细胞培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、维甲酸、血小板源性生长因子等采用两步法将脐带间充质干细胞诱导分化为许旺细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化。利用免疫细胞化学染色法检测巢蛋白、S-100、纤维酸性蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应、免疫印记技术检测许旺细胞特异性蛋白产物表达。 结果与结论：脐带细胞培养第7天形态发生变化,部分细胞变成梭形。原代细胞培养10 d左右可达80%~90%融合,细胞呈梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志：CD44(91.4%),CD29(91.3%),CD105(99.2%),不表达CD34(0.2%),CD45(0.9%),CD14(0.6%)。脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞经第一阶段诱导后,细胞由短梭形变成长梭形或纺锤形,并出现聚集现象,由形状规则、表面圆滑的球形细胞团形成。第二阶段诱导后,有长梭形细胞从球形细胞团爬出,96 h后细胞形态多为长梭形,伴有多极现象。免疫细胞化学染色结果示：长梭形多极细胞具有许旺细胞特异的纤维酸性蛋白、S100蛋白染色。结果表明脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可在体外诱导分化为许旺细胞。     

Characterization of early onset neurofibromatosis type 2

Neurofibromatosis type 2 (NF2) is an autosomal dominant multiple neoplasia syndrome of the central nervous system. The aim of the present study was to characterize the clinical course of early onset NF2. The specific Japanese disease registry for NF2 in 2010 was analyzed retrospectively. The male:female ratio for the 312 patients identified in the database was 1:1.29. The median age at onset was 25 years (range 2–76 years), with 31.3% of patients exhibiting symptoms at <20 years of age. Patients with an age at onset of <20 years were found to have more frequent spinal cord and extravestibular cranial nerve involvement, cutaneous signs, and convulsions than patients with a later age at onset. Of patients younger than 18 years of age, half did not exhibit hearing problems; in contrast, they frequently had other cranial nerve schwannomas, cranial meningioma, spinal cord tumors, and subcutaneous schwannoma. There were weak but significant positive correlations between symptomatic periods and disability scores in patients with an age of onset of ?20 years (R = 0.225; P < 0.01) and those with an earlier age of onset (R = 0.306; P < 0.01). Although there were no significant differences in disability scores between genders or patients with an age at onset of <20 versus ?20 years, patients with an earlier age at onset had significantly higher disability scores for spinal symptoms than patients with an age at onset of ?20 years. Atypical extravestibular presentation is common in early onset NF2, with more prominent spinal symptoms.     

许旺细胞提取与纯化的新方法

背景：许旺细胞移植可改变损伤局部的微环境,有利于神经创伤的修复,获取大量高纯度、具有增殖活性的许旺细胞是研究的关键。 目的：探求一种简单且快速提取和纯化许旺细胞的方法。 方法：实验组大鼠在无菌条件下切断坐骨神经远端,使坐骨神经在体内预变性;对照组大鼠的坐骨神经不予任何处理。术后7 d切取两组坐骨神经,采用混合酶消化、组织块移植法提取许旺细胞;通过低酶消化、2次接种差速贴壁法分离纯化许旺细胞。相差显微镜下观察细胞形态,并行免疫荧光染色鉴定;计算细胞纯度;MTT法检测细胞增殖能力。 结果与结论：实验组培养第7天可见典型呈双极或三极的许旺细胞,细胞间建立连接;对照组细胞突起较短,与周围细胞较少关联。S-100免疫荧光染色后,细胞呈阳性绿色表达。实验组细胞增殖较快,第15天迅速形成漩涡状,成纤维细胞数量相对较少,细胞纯度达96.1%;对照组细胞在培养过程中增殖较缓慢,成纤维细胞数量多,细胞纯度较低。MTT法检测结果显示,原代培养时两组许旺细胞增殖能力均较弱;传代后与对照组比较,实验组许旺细胞增殖能力明显增强(P < 0.05或0.01),第三四代达峰值。结果证实体内预变性、体外混合酶消化、组织块移植结合低酶消化、双差速贴壁分离许旺细胞是一种简便、快速的提取纯化许旺细胞的方法。     

血清和雪旺氏细胞诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的比较

目的 比较血清和雪旺氏细胞诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的差异。方法 分别采用血清和与雪旺氏细胞共培养的方法诱导大鼠胚胎神经干细胞分化，应用相差显微镜和免疫荧光染色的方法对其进行观察和比较。结果 两种方法都能够诱导绝大多数神经干细胞分化成神经元，少量分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞。虽然后一种方法诱导干细胞分化的进程比前一种方法要慢，但细胞形态学上更接近发育成熟的神经元。结论 雪旺氏细胞的分泌物不仅能够诱导共培养的神经干细胞分化，而且使其分化更加成熟。